一種基于菊粉-殼聚糖修飾的結核分枝桿菌亞單位疫苗及其制備方法
【專利摘要】本發明將菊粉和殼聚糖以共價鍵的方式進行偶聯，制備了菊粉?殼聚糖偶聯物。將結核分枝桿菌的兩種免疫原蛋白CFP10與TB10.4進行融合表達。用菊粉?殼聚糖偶聯物修飾CFP10?TB10.4融合蛋白，作為一種新型的結核分枝桿菌亞單位疫苗。該疫苗能誘導產生高水平的體液免疫應答和細胞免疫應答。
【專利說明】
一種基于菊粉-殼聚糖修飾的結核分枝桿菌亞單位疫苗及其制備方法
技術領域
[0001]本發明涉及生物醫藥領域，具體地，本發明涉及一種基于菊粉-殼聚糖修飾的結核分枝桿菌亞單位疫苗。【背景技術】
[0002]菊粉(inulin)是一種天然的果糖聚合物，由D-果糖經￠-1,2糖苷鍵連接而成，多來源于菊苣、菊芋或大麗花等菊科植物，具有生物相容性好、無毒性等特點。菊粉作為一種天然可溶性膳食纖維，具有控制血脂、降低血糖和促進礦物質吸收等生物保健功能。更為重要的是，研究表明菊粉具有免疫佐劑的功能，能夠激活補體旁路途徑，進而刺激機體的天然免疫系統，同時能夠增強機體的體液免疫和細胞免疫應答。例如，菊粉能夠顯著促進乙肝疫苗的體液免疫應答和IFN-y、IL-10、IL-6等細胞因子的產生。菊粉來源廣泛，簡單易得，成本低廉，具有良好的生物安全性和耐受性，作為免疫佐劑有著巨大的潛力。[00〇3] 殼聚糖(chitosan)是幾丁質的脫乙醜化廣物，其化學名稱為￠-( 1—4)-2_氛基_2_ 脫氧-D-葡萄糖，廣泛存在于自然界中，具有無毒、無刺激性、無免疫原性、生物相容性好、在體內可以降解吸收等生物學特性。殼聚糖分子上帶有大量的游離氨基，在溶液中會帶正電荷，而表面帶正電荷的分子會延長疫苗在注射部位的停留時間。研究表明殼聚糖可以促進巨噬細胞的活化，促進腫瘤壞死因子-a(TNF-a)、丫-干擾素(IFN-丫)、白介素(IL-12)等細胞因子的分泌，增強抗原呈遞作用，增加抗原特異性抗體的產生等。殼聚糖與抗原共同皮下注射后，可誘導機體產生更強的體液免疫應答和細胞免疫應答。
[0004]結核病是由結核分枝桿菌引起的一種古老的傳染性疾病，全球每年新增900萬患者，近1/3的世界人口已經感染結核分枝桿菌。到目前為止，接種卡介苗被認為是預防結核病發生和傳播的最佳途徑。但是，卡介苗已經使用了 90多年，逐漸暴露出諸如有效性降低、 副作用突出等問題，保護能力呈現明顯的區域性差異。因此，目前亟待需要一種新型、高效的結核分枝桿菌疫苗。作為結核病的一種候選疫苗，基于結核分枝桿菌免疫原蛋白的亞單位疫苗以其成分明確、安全性高、簡單易得而越來越受到人們的關注。其中，CFP10和TB10.4 是由結核分枝桿菌分泌至胞外的兩種免疫原蛋白。將CFP10和TB10.4融合表達后所制備成亞單位疫苗具有較強的免疫保護潛力。該融合蛋白的一個顯著缺點是所引起的免疫保護作用較弱，需要使用適當的免疫佐劑來彌補這一缺陷。
[0005]將免疫佐劑與免疫原蛋白進行物理混合，或將佐劑以微球或納米微粒的形式負載免疫原蛋白是提高疫苗效價比較常見的方法。然而，物理混合所制備的疫苗在免疫保護效果方面欠佳，特別是幾乎不能被誘導產生Thl型免疫應答。微球或納米微粒形式的佐劑能夠有效地延長免疫原蛋白在體內的存留時間，提高DC細胞的遞呈能力，從而增強疫苗的免疫保護效果。但是，這種佐劑能夠引起注射部位發生炎癥反應，并伴隨著不同程度的毒副作用。
[0006]與前兩種方法相比，采用化學偶聯的方法將免疫原蛋白與佐劑共價結合，能表現出更強的免疫保護作用。化學偶聯法制備的疫苗可以提高免疫原蛋白的水化半徑、減緩腎小球的清除速率，從而延長疫苗與免疫系統的作用時間，刺激免疫系統產生持續長效的免疫應答。此外，將免疫佐劑與免疫原蛋白共價鍵結合后可以確保它們同時到達抗原遞呈細胞，進而顯著提高免疫原蛋白的免疫原性。
【發明內容】

[0007]1.本發明通過基因工程的方法，將結核分枝桿菌的兩種免疫原蛋白CFP10和 TB10.4的基于融合表達，獲得了 CFP10-TB10.4融合蛋白(CT)。其制備方法包括以下步驟:
[0008](1)構建CFP10-TB10.4重組質粒:根據GenBank中結核分枝桿菌標準毒株H37RV的 CFP10和TB10.4的基因序列，進行全基因合成;設計引物進行PCR擴增全基因序列，將目的基因與載體質粒pET28a( + )用T4連接酶進行連接;將連接產物轉化到E.Col i BL21 (DE3)，用菌落PCR篩選陽性克隆，從而構建重組質粒CFP10-TB10.4-pET28a( + )。
[0009](2)誘導表達CT:將重組質粒轉化到E.Coli BL21 (DE3)中，按1 %的比例接種到LB 培養基，振蕩培養至OD600等于0.6?0.8，加入異丙基-f3-D-硫代半乳糖苷(IPTG)于37 °C誘導 3?4小時;離心收集菌體，重懸后于冰浴下進行超聲破碎1小時，然后離心收集上清和沉淀。 聚丙烯酰胺凝膠電泳結果表明，IPTG能誘導產生一條分子量在25kDa左右的蛋白帶，以包涵體表達的形式為主。
[0010](3)包涵體復性與CT的純化:離心收集沉淀，用含1M NaCl和2M尿素的50mM Tris-HC1緩沖液(pH 8.0)將包涵體洗滌三次；然后用含ImM EDTA，15mM DTT，8M尿素的50mM T r i s - H C1緩沖液(p H 8.0)溶解包涵體；逐滴加入包涵體復性液，于4 °C復性過夜。用Q Sepharose HP陰離子交換介質進行純化，收集含有CT的洗脫峰。
[0011]2.本發明通過化學修飾的方法將菊粉-殼聚糖佐劑與CT偶聯起來，制備出了一種結核分枝桿菌亞單位疫苗，能夠誘導機體產生的細胞免疫應答和體液免疫應答。
[0012]3.本發明涉及菊粉-殼聚糖免疫佐劑的制備工藝，包括以下步驟:
[0013](1)菊粉的活化:將菊粉溶于20mM醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH 5.8)，然后加入高碘酸鈉，于室溫下避光反應，透析除去未反應的高碘酸鈉和其它副產物。[〇〇14](2)菊粉與殼聚糖的偶聯:將殼聚糖溶于20mM檸檬酸緩沖液(pH 3.0)中，濃度為2.5mg/ml，然后與活化的菊粉混合，同時加氰基硼氫化鈉，于室溫下反應12小時。[〇〇15]4.本發明涉及一種結核分枝桿菌亞單位疫苗的制備工藝，包括以下步驟:[〇〇16](1)菊粉-殼聚糖佐劑溶于20mM磷酸鹽緩沖液(pH 7.2)中，然后加入2-亞氨基硫烷，于室溫下進行活化1-6小時。2-亞氨基硫烷將殼聚糖上剩余的氨基部分轉化成巰基。活化結束后，用透析袋透析除去未反應的2-亞氨基硫烷。[〇〇17](2)將CT溶于20mM磷酸鹽緩沖液(pH 7.2)中，然后加入3-馬來酰亞胺基苯甲酸琥珀酰亞胺酯(MBS)，于4°C下反應1-6小時。MBS將抗原蛋白上暴露在外面的氨基轉化成馬來酰亞胺基團。反應結束后，用透析袋透析除去未反應的MBS。
[0018](3)將第1步得到的活化菊粉-殼聚糖佐劑與第2步得到的活化免疫原蛋白混合，于4°C下反應14小時。[0〇19](4)疫苗的純化方法選用強陰離子交換層析，優選Q Sepharose HP層析介質(1.6cmX 2.5cm)。用于平衡柱子的緩沖液A為20mM磷酸緩沖液(pH 7.2)，用來洗脫柱子的緩沖液8為2〇11^磷酸緩沖液(含1.011他(:14117.2)。收集疫苗對應的洗脫峰。
[0020]本發明公開了一種基于菊粉-殼聚糖修飾的結核分枝桿菌亞單位疫苗及其制備方法，其技術優勢體現在以下幾方面:
[0021](1)本發明將具有佐劑功能的菊粉與殼聚糖相偶聯，能夠使菊粉和殼聚糖協同地發揮佐劑效應。這使得菊粉-殼聚糖修飾的免疫原蛋白所誘導的免疫應答要顯著高于單獨修飾菊粉或殼聚糖的免疫原蛋白。
[0022](2)本發明所涉及的菊粉-殼聚糖修飾的免疫原蛋白，其所誘導的免疫應答要顯著高于鋁佐劑與免疫原蛋白混合所產生的免疫應答。
[0023](3)本發明的結核分枝桿菌亞單位疫苗，其中多糖和免疫原蛋白的結構特征未發生顯著改變。【附圖說明】[〇〇24]圖1 SDS-PAGE凝膠電泳分析大腸桿菌破碎液。第1泳道為標準蛋白；第2泳道為全菌的破碎液;第3泳道為包涵體;第4泳道為上清。
[0025]圖2菊粉-殼聚糖佐劑和結核分枝桿菌亞單位疫苗的制備反應示意圖。[0〇26]圖3凝膠過濾分析結核分枝桿菌亞單位疫苗。用分析型凝膠過濾柱Superdex 200 (1 c m X 3 0 c m)檢測結核分枝桿菌亞單位疫苗。分析條件:流動相為2 0 m M磷酸緩沖液(p H 7.4)，流速0.5毫升/分鐘，檢測波長為280納米。[〇〇27]圖4咕NMR分析菊粉-殼聚糖佐劑。1H NMR分析由Bruker 600MHz核磁共振儀完成。
[0028]圖5結核分枝桿菌亞單位疫苗產生的免疫原蛋白特異性抗體。[〇〇29]圖6結核分枝桿菌亞單位疫苗產生的IFN-y、IL_2和TNF-a等細胞因子。【具體實施方式】:[〇〇3〇]實施例1:CT融合蛋白的制備
[0031](1)構建(^?10-讓10.4重組質粒[〇〇32] 首先根據Gene Bank中結核分枝桿菌標準毒株H37Rv的CFP10和TB10.4的基因序列，設計出中間加入3個甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸_甘氨酸_絲氨酸(Gly-Gly-Gly-Ser)重復單元的全基因序列，并進行全基因合成;然后設計引物，進行PCR擴增全基因序列，用膠回收試劑盒回收目的基因，并用Hindm和BamHI對全基因序列進行雙酶切。同時對載體質粒pET28a (+ )進行雙酶切，分別回收目的基因片段后，用T4連接酶進行連接;最后將連接產物轉化到 E.Coli BL21(DE3)，用菌落PCR篩選陽性克隆并進行測序鑒定，從而構建出重組質粒pET28a (+)-CFP10-TB10.4〇[〇〇33](2)誘導表達CFP10-TB10 ? 4融合蛋白(CT)
[0034] a)從pET28a( + )-CFP10-TB10.4(T0P10)中提取重組質粒，并轉化到E.Coli BL21 (DE3)中。菌落PCR篩選陽性克隆并進行測序鑒定，即為保存菌種pET28a( + )-CFP10-TB10.4 (BL21)；[〇〇35] b)活化表達CT融合蛋白的E.Coli BL21菌體，按1%的比例接種到200ml LB培養基，振蕩培養至0D6QQ等于0.6?0.8，加入終濃度為0.5mmol/L的IPTG，于37°C下誘導3?4小時；
[0036]c)于4°C和lOOOOrpm離心10分鐘，收集菌體，重懸于50mM Tris-HCl緩沖液(pH8.0)。于冰浴下進行超聲破碎1小時(240W，超聲2秒，停5秒)。然后于4°C和1 OOOOrpm離心30 分鐘，分別收集上清和沉淀。聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)結果表明(圖1)，與未經IPTG 誘導的菌相比，細胞破碎液有一條明顯的特異性蛋白帶，其分子量在25kDa左右，以包涵體表達形式為主。[〇〇37](3)包涵體復性與融合蛋白的純化[〇〇38] a)配制以下溶液:包涵體洗滌液，S卩50mM Tris-HCl(含1M NaCl和2M尿素，pH8.0);包涵體溶解液，S卩50mM Tris-HCl(含ImM EDTA、15mM DTT和8M尿素，pH 8.0);包涵體復性液，即100mM Tris-HCl(含0.18mM EDTA，4mM L-精氨酸，0.9mM還原型谷光甘肽，0.18mM 氧化型谷光甘肽和2M尿素，pH 8.0)。[〇〇39] b)離心收集含有融合蛋白的菌體。冰浴下超聲破碎后，于4°C和lOOOOrpm條件下離心收集包涵體，用包涵體洗滌液洗滌3次，然后用包涵體溶解液于37 °C水浴中溶解2小時。將蛋白濃度調整為l.〇mg/ml，最后在4°C條件下逐滴加入到包涵體復性液中，蛋白終濃度為 0.lmg/ml，于4°C下復性過夜。
[0040] c)由Q Sepharose HP強陰離子交換層析柱對復性的融合蛋白進行分離純化。陰離子交換柱A液，S卩20mM Tris-HCl(pH 8.0);陰離子交換柱B液，S卩20mM Tris-HCl(含0.5M NaCl，pH 8.0);所有溶液均過0.22m濾膜。由A液對層析柱進行平衡和洗脫，隨后由A液和B 液對層析柱進行梯度洗脫。收集目的蛋白(CT)所對應的洗脫峰，將目的蛋白置換到20mM磷酸緩沖液(pH 7.2)。[0041 ]實施例2:菊粉-殼聚糖佐劑的制備[〇〇42] 將菊粉溶于20mM醋酸鈉緩沖液(pH 5.8)溶解，配制成2.5mg/ml的溶液，加入終濃度為20mM高碘酸鈉，于室溫下避光反應20分鐘(圖2)。隨后，按體積的10 %加入乙二醇，消耗過量的高碘酸鈉。反應結束后，用截留分子量為2kDa的透析袋透析3次(每2小時換液1次)， 除去反應副產物，獲得帶有醛基的菊粉。透析液為20mM梓檬酸緩沖液(pH 3.0)。[〇〇43]將殼聚糖溶于20mM檸檬酸緩沖液(pH 3.0)，配制成2.5mg/ml的溶液;按菊粉:殼聚糖:氰基硼氫化鈉的質量比為3:1:1的比例進行反應，于室溫下反應12小時(圖2)。用截留分子量為10kDa的透析袋透析3次(每2小時換液1次)，除去未反應的菊粉和其它小分子。透析液為20mM磷酸鹽緩沖液(pH 7.2)。
[0044]實施例3:疫苗的制備[〇〇45]制備了菊粉-殼聚糖修飾的CFP10-TB10.4融合蛋白(Inulin-Cs-CT)。作為對照，還分別制備了菊粉單獨修飾的CT(Inulin-CT)和殼聚糖單獨修飾的CT(Cs-CT)。它們的制備反應式如圖2所示。
[0046] (l)Inulin-CT 的制備[〇〇47]菊粉(inulin)的氧化方法同實施例1，將其置換到20mM磷酸緩沖液(pH為7.2)中。 然后按CT:菊粉:還原劑(氰基硼氫化鈉)為1:9:3的質量比，于室溫下反應12小時。
[0048](2)Cs_CT 的制備
[0049]殼聚糖在偏酸性條件下溶于水，但在中性條件下難溶于水。因此，由分子量為5kDa 的PEG醛在偏酸性條件下修飾殼聚糖，使之在中性條件下溶于水，實現與融合蛋白的修飾反應。
[0050]將殼聚糖用20mM檸檬酸緩沖液(pH 3.0)在水浴加熱中溶解，配制成2.5mg/ml的溶液;將PEG醛:殼聚糖:氰基硼氫化鈉以質量比為1:2:1的比例進行反應，于室溫下反應12小時。用截留分子量為10kDa的透析袋透析，將其緩沖液置換到20mM的磷酸鹽緩沖液(pH 7.2) 中。殼聚糖與2-亞氨基硫烷(IT)以質量比為3:1的比例混合，于室溫下反應3小時。2-亞氨基硫烷可將殼聚糖上剩余的氨基部分轉化成巰基。反應結束后，用截留分子量為10kDa的透析袋透析3次(每2小時換液1次)充分除去未反應的2-亞氨基硫烷。[〇〇511 將融合蛋白CT與3-馬來酰亞胺基苯甲酸琥珀酰亞胺酯(MBS)以摩爾比1:50混合， 反應pH值為pH 7.2,于4°C下反應3小時，3-馬來酰亞胺基苯甲酸琥珀酰亞胺酯會將CT的氨基轉化成馬來酰胺基。反應結束后，用截留分子量為6kDa的濾膜于6000g離心5次，除去未反應的MBS。馬來酰亞胺化的融合蛋白CT與巰基化的PEG-殼聚糖佐劑以質量比為1:4的比例混合，反應pH值為7.2，于4°C下反應14小時。[0052 ](3)結核分枝桿菌亞單位疫苗CT-1 nu 1 i n-Cs的制備[〇〇53]菊粉-殼聚糖佐劑與2-亞氨基硫烷(IT)以質量比為3:1的比例混合，于室溫下反應 3小時，2-亞氨基硫烷會將殼聚糖上剩余的部分氨基轉化成巰基。反應結束后，用截留分子量為10kDa的透析袋透析3次(每2小時換液1次)，除去未反應的2-亞氨基硫烷。馬來酰亞胺化的融合蛋白與巰基化的菊粉-殼聚糖佐劑以質量比為1:4的比例混合，反應pH值為7.2,于 4°C下反應14小時。[〇〇54](4)疫苗的分離純化[0〇55]由Q Sepharose HP強陰離子交換層析柱對上述三種修飾的蛋白分別進行純化。先用A液(20mM磷酸鹽緩沖液，pH 7.2)平衡層析柱，上樣后繼續用A液進行充分洗脫，流速為 1.〇毫升/分鐘；隨后用A液和B液(含有1.0M氯化鈉的20mM磷酸鹽緩沖液，pH 7.2)對層析柱進行梯度洗脫，流速為1.〇毫升/分鐘。分別收集對應于3種疫苗的洗脫峰，將3種疫苗分別置換至lj20mM磷酸緩沖液(pH 7.2)。[〇〇56]實施例4:疫苗的結構表征[0〇57] 將3種疫苗用分析型Superdex 200凝膠過濾柱(1.0 X 30cm)進行鑒定，洗脫液為含有0.15M氯化鈉的20mM磷酸緩沖液(pH 7.2)，流速為0.5毫升/分鐘。如圖3所示，與融合蛋白 CT相比，三種疫苗的出峰時間均明顯提前，表明它們的分子量顯著增加。[〇〇58]用1H NMR分析菊粉-殼聚糖佐劑。如圖4所示，與殼聚糖相比，PEG-殼聚糖在3.3ppm 和3.5-3.7ppm出現特征峰，分別對應于PEG的甲氧基和乙氧基，而菊粉-殼聚糖在2.6-2.7ppm處也出現特征峰，對應于連接菊粉與殼聚糖的酰胺鍵中的-NH-。這些表明PEG與菊粉均成功地偶聯了殼聚糖。
[0059]實施例5:測定疫苗誘導的抗體水平
[0060]選取30只6-8周齡的雌性C57BL/6小鼠，隨機分為5組，S卩CT組、CT+鋁佐劑組、 inulin-CT組、inulin-Cs-CT組和Cs-CT組，每組6只小鼠。以皮下注射的方式，注射劑量每只小鼠每次含有20微克蛋白，分別于第0、第14和28天注射，共注射三次。第二、三次注射前(即第14和28天)和第三次注射后隔三周(即第49天)分別從眼眶取血。離心收集血清，-80°C保存備用。用ELISA法檢測小鼠血漿中抗CT的IgG、IgGl、IgG2b和IgG2c。[〇〇611如圖5a所示，在第14天(即第二次免疫前)，免疫原蛋白CT組產生抗CT的IgG滴度較低，而在第28天和第49天，該組產生抗CT的IgG滴度分別是第14天的3.0倍和5.5倍，表明免疫原蛋白能夠產生微弱的免疫記憶作用。CT+鋁佐劑組產生的IgG滴度除了在第49天是CT組的2倍外，其它時期的IgG滴度與CT組的IgG滴度相當，表明鋁佐劑在刺激CT產生IgG抗體滴度方面的作用不強。在第14天，inulin-CT組、Cs-CT組和inulin-Cs-CT組產生抗CT的IgG滴度也較低，在第28天有一定程度的增加(4倍之多)，但在第49天，它們的IgG滴度均有大幅度的提高(20多倍)，表明與inulin或Cs與CT共價偶聯后可以引起強烈的免疫記憶并能增強CT 特異性的免疫應答。在第49天，與CT組相比，inulin-CT、Cs-CT和inulin-Cs-CT組產生抗CT 的IgG滴度分別是CT組的14.2倍、8.9倍和51.4倍。這表明inul in-Cs結合物中的菊粉和殼聚糖以協同作用的方式刺激CT產生體液免疫應答。[〇〇62]如圖5b所示，在這五組中，inulin-Cs-CT組產生的IgGl、IgG2b和IgG2c滴度均是最高的，且其IgG2b/IgGl值也是最大的。表明inulin-Cs佐劑能夠促使CT誘導產生趨向于Thl 的免疫應答。
[0063]實施例6:測定疫苗誘導的細胞免疫水平
[0064]第49天取小鼠的新鮮脾臟，研磨分離出脾臟細胞進行細胞培養。在細胞數目達到2 X 106后，用lOyg/ml的免疫原蛋白CT刺激60個小時，離心收集上清。用TNF-a、IFN-y和E-2 細胞因子ELISA檢測試劑盒，測定細胞培養上清中的TNF-a、IFN- y和IL-2水平。如圖6所示， inulin-Cs-CT組產生的TNF-a、IFN- y和IL-2水平均高于其它組，分別是CT組的7.5倍、6.9 倍和4.2倍。這表明inulin-Cs佐劑能夠促進CT誘導機體產生強烈的細胞免疫應答。
[0065]脾臟細胞中CD4+和CD8+T細胞的相對數量由流式細胞分析儀進行檢測。結果如圖6d 所示，CT組、CT+鋁佐劑組、inul in-CT組、Cs-CT組和inul in-Cs-CT組的CD4+和CD8+T細胞數量均表現出逐漸增多的趨勢，其中CD4+T細胞多于CD8+T細胞，表明inulin-Cs佐劑能夠促進CT 誘導機體的T細胞增殖。
【主權項】
1.一種基于菊粉-殼聚糖修飾的結核分枝桿菌亞單位疫苗，其特征在于由菊粉-殼聚糖 結合物共價修飾結核分枝桿菌CFP10-TB10.4融合蛋白制備而成。2.根據權利要求1所述的結核分枝桿菌CFP10-TB10.4融合蛋白，其制備步驟包括:(1) 將CFP10-TB10.4全基因進行PCR擴增，并經雙酶切后插入到表達載體的多克隆位點，構建重 組載體；(2)將重組載體在大腸桿菌中表達CFP10-TB10.4融合蛋白；(3)對大腸桿菌中的包 涵體進行復性與分離純化，得到CFP10-TB10.4融合蛋白。3.根據權利要求2所述的構建重組載體，其構建步驟包括:(1)根據GenBank中結核分支 桿菌標準毒株H37Rv的CFP10和TB10.4的基因序列，中間加入3個甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘 氨酸-絲氨酸重復單元的基因序列，進行全基因合成；(2)設計引物進行PCR擴增全基因序 列，PCR產物經膠回收試劑盒進行純化；(3)用Hind m和BamH I雙酶切CFP10-TB10.4基因和 質粒pET28a并純化后，在T4連接酶的作用下進行連接反應，然后轉化至感受態細胞E.Coli top 10 中，構建重組載體 pET28a (+) -CFP 10-TB10 ? 4。4.根據權利要求2所述的將重組載體在大腸桿菌中表達CFP10-TB10.4融合蛋白，其步 驟包括:(1)將重組載體?￡128&( + )-0??10-1810.4轉化到大腸桿菌此21(063)中，菌落?〇?篩 選陽性克隆并進行測序鑒定；(2)活化菌體，用異丙基-3-D-硫代半乳糖苷進行誘導，振蕩培 養后離心收集菌體;(3)菌體重懸于緩沖液中，于冰浴下超聲破碎菌體，離心收集包涵體。5.根據權利要求2所述的對大腸桿菌中的包涵體進行復性與分離純化，其步驟包括: (1)菌體超聲破碎后離心收集包涵體，用包涵體洗滌液洗滌三次后用包涵體溶解液于37°C 水浴中溶解，然后4°C條件下進行稀釋復性；(2)將低濃度的蛋白復性液用陰離子交換柱Q Sepharose HP介質進行純化，收集對應于目標蛋白的洗脫峰。6.根據權利要求1所述的菊粉-殼聚糖結合物，其制備步驟包括:(1)用高碘酸鈉氧化菊 粉，將菊粉的鄰位羥基氧化為醛基；(2)菊粉的醛基與殼聚糖的氨基在氰基硼氫化鈉的還原 作用下進行結合反應，得到菊粉-殼聚糖結合物。7.根據權利要求6所述的用高碘酸鈉氧化菊粉，其特征在于，高碘酸鈉氧化菊粉的反應 條件為:(1)高碘酸鈉的濃度為1-5〇11^;(2)菊粉的濃度為2.51^/1111;(3)氧化的?11值為5.8; (4)在避光條件下氧化菊粉5-120分鐘。8.根據權利要求6所述的結合反應，其特征在于，菊粉與殼聚糖的質量比為(1-10):1， 結合反應的緩沖體系為20mM梓檬酸緩沖液，pH值為2.0-6.0，反應時間為5-24小時。9.根據權利要求1所述的菊粉-殼聚糖結合物共價修飾結核分枝桿菌CFP10-TB10.4融 合蛋白，其特征在于，制備的步驟包括:(1)菊粉-殼聚糖結合物的巰基化；(2)CFP10-TB10.4 融合蛋白的馬來酰亞胺化；(3)巰基化的結合物與馬來酰亞胺化的融合蛋白共價結合。10.根據權利要求9所述的菊粉-殼聚糖結合物的巰基化，其特征在于用2-亞氨基硫烷 將菊粉_殼聚糖結合物中殼聚糖的氨基轉化為巰基，殼聚糖與2-亞氨基硫烷的質量比為(1-10): 1，反應在室溫下進行1-12小時。11.根據權利要求9所述的CFP10-TB10.4融合蛋白的馬來酰亞胺化，其特征在于用3-馬 來酰亞胺基苯甲酸琥珀酰亞胺酯將融合蛋白的氨基轉化為馬來酰亞胺基團，融合蛋白與3-馬來酰亞胺基苯甲酸琥珀酰亞胺酯的摩爾比為1:(10-100)，于4°C下反應1-6小時。12.根據權利要求9所述的巰基化的結合物與馬來酰亞胺化的融合蛋白共價結合，其特 征在于，在巰基化的菊粉-殼聚糖結合物與馬來酰亞胺化的融合蛋白結合反應中，殼聚糖和抗原蛋白的質量比為(l-1o):1;于4°C下反應8-24小時。
【文檔編號】C12N15/70GK105944094SQ201610416720
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年6月14日
【發明人】胡濤, 于衛立
【申請人】中國科學院過程工程研究所