用于檢測黃曲霉毒素的單克隆抗體及酶聯免疫方法與試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于獸藥殘留分析和免疫學技術領域，具體涉及一種能識別黃曲霉毒素 81、82、61、62的單克隆抗體和一種用于檢測黃曲霉毒素81、82、61、62的酶聯免疫方法 (ELISA)及試劑盒。
【背景技術】
[0002] 黃曲霉毒素主要是由黃曲霉和寄生曲霉分泌的次級代謝產物，是一類結構相似的 化合物，都含有二呋喃環和香豆素，其有20多種，目前分離鑒定的有12種，常見的主要為黃 曲霉毒素8132、61、62、]?1、]\12。黃曲霉毒素主要污染農作物和飼料。使用了污染黃曲霉毒素 的飼料，可引起豬只產死胎和木乃伊胎，并可引起雞產蛋率下降和口腔潰瘍。經研究發現， 黃曲霉毒素具有明顯的"三致"作用，人誤食了污染了黃曲霉毒素的食物會引起中毒，甚至 死亡。
[0003] 目前檢測黃曲霉毒素的方法主要為儀器方法和免疫學方法。儀器方法雖然靈敏、 準確、分離度高并且可進行多殘留檢測的定性、定量研究，但是需要昂貴的儀器、繁瑣的前 處理、熟練的專業操作員。如果采用儀器分析法進行大批量樣品的檢測，其成本將非常高， 而且在目前的國家檢測機構中大部分只有省市級才配備有精密的分析儀器。免疫化學分析 法特別是酶聯免疫吸附分析技術具有快速、靈敏度高、操作簡單、適應性強等優點，適合高 通量樣品篩選，因此對于快速檢測黃曲霉毒素的殘留，ELISA方法更具優勢。而制備較高靈 敏度的抗體是ELISA方法的根本，只有制備出較高靈敏度的抗體，才能制備出具有競爭性的 ELISA試劑盒。王雄等（2008)利用ELISA方法檢測飼料中的黃曲霉毒素 B1，抗體的最低檢測 限為0.05ng/mL，標準曲線的線性范圍為0.05~2.00ng/mL，其抗體靈敏度不高，且使用的樣 品前處理過程較為復雜，不便于在基層使用;王磊等(2012)制備了抗黃曲霉毒素 B1抗體，該 抗體的IC50值為2.58ng/mL;李敏等（2015)采用異源包被的抗原建立了 ELI SA方法，其抗體 靈敏度由1.6ng/mL提高到了0.3ng/mL，同時成功建立了 ELISA方法。

【發明內容】

[0004] 本發明的一個目的是提供一種能識別黃曲霉毒素 B1、B2、G1、G2的單克隆抗體，以 提高識別的靈敏度和特異性;本發明的另一個目的是提供一種用于檢測黃曲霉毒素 B1、B2、 G1、G2的酶聯免疫方法及試劑盒，以提高檢測的靈敏度、準確度和精密度，同時簡化操作程 序。
[0005] 上述目的是通過以下技術方案實現的：
[0006] -種能識別黃曲霉毒素81、82、61、62的單克隆抗體，它是由雜交瘤細胞株六?81/ 3B9所分泌的。
[0007]所述的雜交瘤細胞株AFB1/3B9,保藏在中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCC N0:C201558。
[0008]所述的單克隆抗體，它是以黃曲霉毒素 B2(AFB2)與羧甲基羥胺半鹽酸鹽(CM0)反 應生成黃曲霉毒素 B2肟(AFB20)，AFB20再與載體蛋白偶聯得到的偶聯物作為免疫原制備得 到的。本發明優選的免疫原載體蛋白是血藍蛋白（KLH)。
[0009]所述的單克隆抗體可用于建立檢測黃曲霉毒素 B1、B2、G1、G2的ELISA方法。
[0010]所述的單克隆抗體可用于制備檢測黃曲霉毒素趴』2、61、62的酶聯免疫試劑盒。 [0011] 一種檢測黃曲霉毒素 B1、B2、G1、G2的ELISA方法，包括免疫原、包被原和抗體的制 備，間接競爭ELISA方法的建立，其步驟如下：
[0012] (1)將AFB2與CM0反應得到的半抗原AFB20;
[0013] (2)將AFB20與載體蛋白偶聯，得到免疫原AFB20-DCC-KLH;
[0014] (3)將AFB20與載體蛋白偶聯，得到包被原AFB20-EDC-BSA;
[0015] (4)用步驟(2)得到的免疫原獲得保藏號CCTCC N0:C201558的雜交瘤細胞株AFB1/ 3B9；
[0016] (5)用保藏號為CCTCC N0:C201558的雜交瘤細胞株AFB1/3B9制備單克隆抗體；
[0017] (6)用步驟(3)得到的包被原包被固相載體；
[0018] (7)樣品處理:準確稱取飼料樣品1 ±0.05g于50mL離心管中，加入4mL乙腈、lmL丙 酮，混合均勻，4000r/min離心5min，取上清lmL吹干，加入2mL的PBS緩沖溶液溶解，作為待測 樣品溶液；
[0019] (8)對步驟(7)中的待測樣品溶液進行酶聯免疫檢測。
[0020] 優選地，免疫原載體蛋白是血藍蛋白（KLH)，包被原載體蛋白是牛血清白蛋白 (BSA)〇
[0021] 本發明的有益效果是：
[0022] (1)本發明在制備單克隆抗體時，采用黃曲霉毒素 B2肟為半抗原，將該半抗原與載 體蛋白偶聯后得到免疫原，由該免疫原制備的單克隆抗體可特異性地識別黃曲霉毒素 B1、 B2、G1、G2，而且識別靈敏度高于現有的單克隆抗體，其中對黃曲霉毒素 B1的IC50值達到了 46.32ng/L；
[0023] (2)本發明建立的ELISA方法和試劑盒可以同時檢測黃曲霉毒素價、82、61、62四種 毒素，不僅具有檢測靈敏度、準確度高，精密度好等特點，而且樣品處理和操作程序簡單，具 有檢測成本低、周期短等優點。
【附圖說明】
[0024]圖1為本發明的技術路線圖。
【具體實施方式】
[0025]下面通過實施例對本發明作進一步說明，但不限制本發明。
[0026]實施例1免疫原和包被原的制備
[0027] 1.1免疫原 AFB20-DCC-KLH 的制備
[0028] 取2mL濃度為lmg/mL的AFB2甲醇溶液，加入3mg的羧甲基羥胺半鹽酸鹽(CM0)和5mg 的碳酸鈉，在室溫下攪拌反應24h，然后用氮氣吹干，加入0.05mol/L的鹽酸2mL，將其充分溶 解，加入2mL的乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯層，重復3次;將取得的液體在氮氣下吹干，即得到 半抗原黃曲霉毒素 B2肟(AFB20)。
[0029]用DMF將得到半抗原溶解，并加入12mg的DCC和5mg的NHS，活化12h，為A液;將2mL的 KLH溶于5mL的PBS溶液中，為B液。然后將A液緩慢加入B液中，在冰浴條件下反應12h;待反應 完全后，經其裝入透析袋中，于PBS溶液中透析3~5天，每天換液3次。即得到完全抗原 AFB20-DCC-KLH。
[0030] 1 · 2包被原 AFB20-EDC-BSA的制備
[0031] 將得到的半抗原AFB20溶于DMF中，加入12mg的EDC和5mg的NHS，活化4h，為A液；將 16mg的牛血清白蛋白（BSA)溶于5mL的PBS溶液中，為B液;然后將A液緩慢加入B液中，在冰浴 條件下反應12h;待反應完全后，經其裝入透析袋中，于PBS溶液中透析3~5天，每天換液3 次。即得到完全抗原AFB20-EDC-BSA。
[0032]實施例2單克隆抗體的制備 [0033] 2.1動物免疫
[0034]利用發明人所在的國家獸藥殘留基準實驗室制備的免疫原(AFB20-DCC-KLH)免疫 Balb/C小鼠（購自湖北省醫學科學院實驗動物中心）。免疫程序是取含AFB20-DCC-KLH偶聯 物50~80yg的蛋白溶液與佐劑等量混合后注入小鼠體內，使其產生特異性血清。
[0035] 2.2細胞融合和克隆化
[0036]參照楊漢春《動物免疫學》，利用發明人所在國家獸藥殘留基準實驗室制備的 AFB20-DCC-KLH免疫原免疫Balb/C小鼠（購自湖北省疾病預防控制中心實驗動物中心），免 疫程序為:基礎免疫將免疫原與等體積的弗氏完全佐劑乳化后，于小鼠背部皮下多點注射， 以后每間隔2周加強免疫一次，換用不完全佐劑乳化。最后于融合前三天(最好于免疫結束 后休整1月）腹腔注射，強化免疫，抗原量加倍，不加佐劑。
[0037] 融合時，取經最后強化免疫的Balb/C鼠一只，眼眶放血處死(收集血清，即為陽性 血清），在75%酒精中浸泡5min消毒。無菌取出小鼠脾臟，分離出脾細胞，與新鮮制備的SP2/ 〇骨髓瘤細胞(SP2/0骨髓瘤細胞