結核分枝桿菌rpoB突變基因及其用圖
【技術領域】[0001] 本發明設及一種結核分枝桿菌rpoB突變基因，W及用于檢測導致結核分枝桿菌利福 平耐藥基因rpoB突變C. 1843G〉A的試劑盒，屬于結核病耐藥基因突變檢測技術領域。
【背景技術】
[0002] 結核病（ii/Aerci/iosis，TB)是由結核分枝桿菌（i知oAac妃ri"曲ii/Aerci/iosis， MTB)引起的慢性傳染病。主要累及臟器為肺，此外還會侵犯皮膚、骨骼等全身多個組織和 器官。目前，我國結核病患者數居世界第二位，而耐藥率居全球第一。約2/3的結核病患 者處于發生耐多藥結核病（multi-化ugresistancetuberculosis,MDR-TB)至少對利福平 (rifampicin，RFP)和異煙阱（Isoniazid，INH)同時耐藥的危險之中）。據報道我國每年新 發耐多藥結核病患者多達15萬，給結核病患者治愈帶來巨大挑戰。而耐利福平MTB菌株的 傳播往往是結核病短程化療失敗的主要原因之一。
[0003]自1971年發現利福平具有全效能殺結核分枝桿菌復合物W來，利福平一直是結 核病化療方案中的一個關鍵藥物。目前研究表明利福平對生長和靜止期的結核菌具有很強 的殺傷效果，該藥物的應用使臨床治愈結核病患者周期由12-18月縮減至9個月。利福平通 過與RNA聚合酶的β亞基結合，干擾RNA鏈的開始和延伸，阻止RNA的合成。而編碼結核分 枝桿菌RNA聚合酶的β亞基的基因為rpoB基因，該基因的突變直接影響利福平治療結核 患者的效果。該基因熱點突變區域(突變發生率為90-95%)主要集中在長8化P(對應編碼 507-533位氨基酸）的核屯、區域-耐利福平決定區（rifampicinresistance-determining region,R畑R)，包括點突變或短的插入、缺失突變等，使DM依賴性RNA聚合酶B亞單位酶 活性改變，利福平不能與RNA聚合酶B亞單位結合而表現為耐藥。
[0004] 進入21世紀W來，由于抗生素濫用、環境污染和艾滋病患者增多等原因，結核作 為機會性致病菌，其發病率呈現逐年增多的趨勢。因此對結核患者早期進行診斷，并且對耐 藥結核患者的具體耐藥機制進行確診，提前調整對該類患者的臨床用藥，將大大縮短臨床 診斷時間，有助于早期發現其耐藥機制，特別是對一些耐多藥患者進行突變熱點的基因診 斷，從而采取有效的臨床治療措施，將大大提高該類患者的治愈率。利福平與異酷阱搭配治 療方案是臨床常用治療結核病患者主要手段，也是一線常規用藥，因此對結核桿菌耐利福 平rpoB基因的突變熱點區進行基因檢測，將有利于臨床快速診斷和治療。
[0005] 經文獻檢索，未見與本發明檢測突變位點相同的公開報道。

【發明內容】

[0006] 本發明的目的在于提供一種檢測結核分枝桿菌rpoB突變基因的方法，該結核分 枝桿菌巧oB突變基因具有C. 1843G〉A突變位點，其核巧酸序列如SEQIDNO:3所示。
[0007] 本發明另一目的是提供用于檢測結核分枝桿菌rpoB突變基因的試劑盒，該試劑 盒包括用于檢測結核分枝桿菌巧oB基因C. 1843G〉A突變的試劑。
[0008] 所述試劑盒包括核巧酸序列如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示的引物。
[0009] 本發明通過檢測來自耐利福平結核菌株的樣本中是否存在rpoB基因的 C.1843G〉A突變(根據大腸桿菌該基因位點定位)，從而判斷該患者耐利福平藥物的耐藥分 子機制。其中C.1843G〉A突變位點為巧oB基因的突變，該突變導致巧oB基因第615位的 鄉氨酸（Val)突變為甲硫氨酸（Met)。運個氨基酸的改變，影響了藥物利福平轉化為活性物 質成分，發揮其抗結核分枝桿菌的作用，從而使該菌株產生耐藥。
[0010] 發明人用候選基因篩查的方法，在中國33株耐利福平結核菌株中進行檢測，在 一株耐藥結核菌種發現與耐利福平相關的rpoB基因新突變C.1843G〉A;該突變的頻率為 3. 03%，運說明在耐利福平的結核菌株中，rpoB基因突變C.1843G〉A具有一定的發生頻率， 因此rpoB基因突變C.1843G〉A可W作為臨床利福平耐藥菌株耐藥分子機制的診斷依據。并 且目前，在國際和國內均未見該突變的報道。
[0011] 本發明用于檢測rpoB基因突變C. 1843G〉A的試劑盒，包括用于檢測rpoB基因的 突變C.1843G〉A所需的試劑和能選用的用于擴增rpoB基因的試劑和PCR引物。
[0012] 用于檢測巧oB基因突變C. 1843G〉A的試劑盒，包括W下一種或幾種試劑的組合： (1) 從待檢樣品中提取DNA的試劑； (2) 用于擴增結核菌樣本DNA的巧oB基因C. 1843G〉A突變的PCR引物和相關的PCR反 應試劑； (3)PCR產物純化試劑； (4) 對PCR產物進行直接測序的試劑。
[001引用于檢測巧oB基因突變C.1843G〉A的試劑盒，所用的PCR引物為： 巧oB-F:5> -CAAGGAGTTCTTCGGCACC-3' 巧oB-R:5' -CGTCCATGTAGTCCACCTC-3' 用于檢測rpoB基因突變C.1843G〉A的試劑盒，所述檢測PCR擴增產物的試劑選自測序 檢測試劑、限制性內切酶長度多態性檢測試劑、序列特異性引物檢測試劑、探針雜交檢測試 劑及SNP分型檢測試劑。
[0014] 采用PCR擴增-直接測序的方法來檢測樣本的突變情況，具體操作步驟如下： (1) 采集待測個體的樣本，為培養的結核菌樣本，提取全基因組DNA (2)W提取的DNA為模板，W本發明設計的針對rpoB基因C. 1843G〉A突變的引物進行 突變區段DNA序列的擴增，得到相應的PCR擴增產物； (3) 將得到的PCR產物純化后，進行直接測序分析，將所測得的序列與rpoB基因的正常 序列進行比對，確定C.1843G〉A突變是否存在； (4) 根據W上實驗結果分析患者是否為rpoB基因突變C. 1843G〉A導致的耐利福平結核 分枝桿菌菌株； (5) 按照正常編碼序列閱讀框對突變序列進行翻譯，進一步確定P.V615M突變的存在。
[0015] 發明人在收集耐藥結核分枝桿菌進行實驗的過程中，收集到33株耐利福平的結 核菌株，在取得患者同意的前提下，對患者感染的結核分枝桿菌進行基因檢測。同時，我們 還收集了患者的基本信息和臨床信息，詳細詢問了其感染和發病過程，建立了結核分枝桿 菌耐藥株的樣本庫。將滅活的結核分枝桿菌凍存于-80°C冰箱。用柱吸附的方法提取結核菌 的基因組DNA，保存于-40°C冰箱，每份DNA樣本具有對應的患者資料和耐藥信息。用引物設 計軟件Prime巧和01igo6設計PCR擴增引物，包括了結核菌巧oB基因1263位到1705位堿 基的DNA片段，用于PCR擴增。PCR擴增產物直接用PCR引物進行正向測序(測序所用儀器 為ABI公司3730型DNA測序儀)。將得到的序列與GenBank中的序列(序列號：KC692347. 1) 進行比對，確定rpoB基因突變C. 1843G〉A的存在，按照開放閱讀框進行翻譯，確定氨基酸突 變P.V615M的存在。
[0016]巧oB基因C.1843G〉A突變的核巧酸和氨基酸序列如下：
rpoB基因C. 1843G〉A突變的核巧酸和氨基酸序列中，用方框標出的是突變的堿基和氨 基酸，突變前第615位氨基酸是鄉氨酸，突變后為甲硫氨酸。該突變位于rpoB基因編碼序 列的第1843位堿基，由野生型的鳥嚷嶺（G)變為胞喀晚（C)，該突變使野生型的rpoB蛋白 的第615位鄉氨酸突變成甲硫氨酸，導致rpoB蛋白的功能發生改變，進而引起利福平的耐 藥。rpoB基因突變C. 1843G〉A的檢測能夠用遺傳領域的任意一種點突變檢測方法進行，如 PCR(聚合酶鏈反應）-R化P法(限制性內切酶片段多態性)、PCR-測序法、DNA探