檢測豬唾液中偽狂犬病毒gB蛋白特異性抗體的方法
【專利摘要】本發明公開了一種檢測豬唾液中偽狂犬病毒gB蛋白特異性抗體的方法。方法步驟為：1）利用懸掛棉繩法，采集唾液，處理后獲得唾液一抗；2）將唾液一抗，按編號加入抗原包被的反應板上，37℃飽和濕度反應1小時，洗滌；3）將辣根過氧化物酶標記的羊抗豬IgG-FC抗體，按順序加入到反應板上，37℃飽和濕度避光反應30分鐘，洗滌；4）將二甲氧聯苯胺顯色劑，按順序加入到反應板上，避光反應15分鐘，加入終止液；5）放入酶標儀中，讀取OD405數據，判定結果。本發明避免了單個動物采血的問題，適用于豬群大面積的偽狂犬病毒gB蛋白抗體調查。
【專利說明】檢測豬唾液中偽狂犬病毒gB蛋白特異性抗體的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物【技術領域】，尤其涉及一種檢測豬唾液中偽狂犬病毒gB蛋白特異性抗體的方法。
【背景技術】
[0002]偽狂犬病(Pseudorabies)是目前危害我國養豬業最重要的疾病，在世界上的大部分地區呈地方性流行。偽狂犬病由偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus, PRV)引起，也稱奧耶斯基氏病(Aujeszky’s disease),發生于牛而稱“瘋癢病”(mad itch)。偽狂犬病病毒潛伏在受感染豬的唾液和鼻腔分泌物中并主要通過口鼻傳播。感染偽狂犬病的豬通常不會表現出癥狀，但偽狂犬病病毒會導致流產、仔豬的高死亡率以及仔豬和成年豬的咳嗽、噴嚏、高燒、便秘、精神不振、抽搐、轉圈和流涎過度。低于I月齡的仔豬死亡率接近100%，而1-6月齡的豬死亡率低于10%。懷孕母豬可能會吸收胎兒、分娩出木乃伊胎、死胎和弱小仔豬。
[0003]目前，已有成熟的gE基因缺失偽狂犬病毒疫苗，廣泛用于臨床免疫，是目前控制該病最主要的手段。一方面，獸醫可以通過檢測偽狂犬病毒gB蛋白特異性抗體，以檢測疫苗的免疫效果；另一方面，對gE蛋白特異性抗體的監測，可以很好的監控豬群中偽狂犬病毒野毒德感染情況。
[0004]采集免疫后豬只血液樣本，分離血清,并檢測偽狂犬病毒gB蛋白特異性的血清抗體，是目前監控偽狂犬疫苗免疫效果效果的最主要手段，對免疫程序制定、流行狀態監測均具有重要意義。然而這種采樣方式存在諸多限制，一方面這種采集血液、分離血清的方法費時費力，采集的樣本數量不大，占豬群的比例不高，且對動物的應激非常大。固定一頭體重在50公斤左右的生長豬，并從前腔靜脈采集血液，通常需要2-3個人，平均花費10分鐘左右。而本專利設計的唾液樣本采集方法，則以同一欄的豬為單位采集(15-20頭)，只需一個人，平均花費5分鐘，懸掛和收集唾液采集繩，即可。相對而言，唾液采集法獲得的樣本可覆蓋整群動物，數據基本可代表整群動物的平均免疫情況，更能反映豬群抗體的總體水平。

【發明內容】

[0005]本發明的目的是克服現有技術的不足，提供一種檢測豬唾液中偽狂犬病毒gB蛋白特異性抗體的方法。
[0006]檢測豬唾液中偽狂犬病毒gB蛋白特異性抗體的方法包括如下步驟:
1)利用懸掛棉繩法，誘導動物咀嚼，采集唾液，處理后獲得唾液一抗；
2)將唾液一抗，以PBST溶液1:2稀釋后，按編號加入偽狂犬病毒gB抗原包被的96孔聚苯乙烯反應板的反應孔中，每個反應孔加150ul，37°C飽和濕度反應I小時，以PBST洗滌3次；
3)將辣根過氧化物酶標記的羊抗豬IgG-FC抗體，以PBST溶液1:1500稀釋后，按順序加入到96孔聚苯乙烯反應板的反應孔中，每個反應孔加100ul，37°C飽和濕度避光反應30分鐘，以PBST洗滌3次；4)將5%的二甲氧聯苯胺顯色劑，按順序加入到96孔聚苯乙烯反應板的反應孔中，每個反應孔加50ul，避光反應15分鐘，隨后每個反應孔加入50ul 2M濃硫酸；
5)放入酶標儀中，讀取0D405數據，判定結果。
[0007]所述的步驟I)為:以6股、直徑3mm、長Im的全棉繩索懸掛于豬群中間或圍欄上，底端高度與動物肩部齊平，并將繩索的懸掛端解松，待豬群撕咬30min后，回收繩索，并置于無菌的樣品收集袋中，用雙手放在樣品袋外擠出浸潤在繩索上的唾液，并收集與無菌的50ml離心管中，以3000g離心15min，取上清，獲得唾液一抗，保存備用。
[0008]所述的步驟5)為:將終止后的96孔聚苯乙烯反應板，放入預熱的酶標儀中，讀取各反應孔的0D405數值，并根據以下公式判定結果:S/P值=(樣品OD-陰性對照0D)/(陽性對照OD-陰性對照0D)。S/P值≤0.2，判為陽性，對應群體陽性率≤80% ；S/P值< 0.2，判為陽性，對應群體陽性率< 80%。
[0009]本發明提供的偽狂犬病毒唾液抗體采集和檢測方法，避免了對單個動物采血的問題，相對于傳統的血清抗體采集和檢測方法，具有以下優點:1)唾液抗體的棉繩采集法對豬群沒有任何應激，2)節省采樣時間達80%以上，3)節省2/3的采樣人員，4)唾液樣品對溫度、環境、污染物的抵抗力更強，運輸和保存更方便，4)可以對整個豬群實行大面積采樣，所得結果更客觀全面，5)偽狂犬病毒gB蛋白病毒唾液抗體檢測與血清抗體檢測的符合率在
100% ο
【專利附圖】

【附圖說明】
[0010]圖1是檢測豬唾液 中偽狂犬病毒gB特異性抗體的方法的過程示意圖；
圖2是本發明的利用懸掛棉繩法，誘導動物咀嚼，采集唾液，處理后獲得唾液一抗的示意圖。
【具體實施方式】
[0011]檢測豬唾液中偽狂犬病毒gB蛋白特異性抗體的方法包括如下步驟:
1)利用懸掛棉繩法，誘導動物咀嚼，采集唾液，處理后獲得唾液一抗；
2)將唾液一抗，以PBST溶液1:2稀釋后，按編號加入偽狂犬病毒gB抗原包被的96孔聚苯乙烯反應板的反應孔中，每個反應孔加150ul，37°C飽和濕度反應I小時，以PBST洗滌3次；
3)將辣根過氧化物酶標記的羊抗豬IgG-FC抗體，以PBST溶液1:1500稀釋后，按順序加入到96孔聚苯乙烯反應板的反應孔中，每個反應孔加100ul，37°C飽和濕度避光反應30分鐘，以PBST洗滌3次；
4)將5%的二甲氧聯苯胺顯色劑，按順序加入到96孔聚苯乙烯反應板的反應孔中，每個反應孔加50ul，避光反應15分鐘，隨后每個反應孔加入50ul 2M濃硫酸；
5)放入酶標儀中，讀取0D405數據，判定結果。
[0012]所述的步驟I)為:以6股、直徑3mm、長Im的全棉繩索懸掛于豬群中間或圍欄上，底端高度與動物肩部齊平，并將繩索的懸掛端解松，待豬群撕咬30min后，回收繩索，并置于無菌的樣品收集袋中，用雙手放在樣品袋外擠出浸潤在繩索上的唾液，并收集與無菌的50ml離心管中，以3000g離心15min，取上清，獲得唾液一抗，保存備用。[0013]所述的步驟5)為:將終止后的96孔聚苯乙烯反應板，放入預熱的酶標儀中，讀取各反應孔的0D405數值，并根據以下公式判定結果:S/P值=(樣品OD-陰性對照0D)/(陽性對照OD-陰性對照0D)。S/P值≥0.2，判為陽性，對應群體陽性率≥80% ；S/P值< 0.2，判為陽性，對應群體陽性率< 80%。
實施例
[0014]I)以定制全棉繩索(6股、直徑3mm、長Im)懸掛于豬群中間或圍欄上，底端高度與動物肩部齊平，并將繩索的懸掛端解松，待豬群撕咬30min后，回收繩索，并置于無菌的樣品收集袋中，用雙手放在樣品袋外，用力擰繩索，擠出浸潤在繩索上的唾液，并收集于無菌的50ml離心管中，用于初步保存和運輸(常溫下、6小時內，或4°C下、72小時內運至實驗室)。將唾液以3000g離心15min，取上清，獲得唾液一抗，并與4°C (<7d)或_20°C (<60d)保存備用，見圖2。
[0015]3)將處理備用的唾液一抗，以PBST(1:2)稀釋后，按編號加入抗原包被的反應板上(購自荷蘭biochek，貨號S109)，IOOul/孔，每個樣品3個重復，同時設置PBST陰性和血清陽性抗體對照個3個孔。飽和濕度下，37°C孵育lh。隨后棄去包被液，拍干ELISA板，每孔加入PBST 150 uI洗液(PBST )，洗滌5 min X 3次，拍干ELISA板，備用，見圖1。
[0016]4)將辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗豬IgG-FC抗體，以PBST為稀釋液，作1:2000倍稀釋后，按IOOul/孔加入到上述一抗包被的反應孔中，37°C /飽和濕度反應30分鐘，隨后棄去包被液，拍干ELISA板，每孔加入PBST 150 ul洗液(PBST)，洗滌5 minX 3次，拍干ELISA板,備用，見圖1。
[0017]5)將二甲氧聯苯胺顯色劑(5%)按50ul/孔加入到上述反應孔中，室溫避光反應15min，隨后加入50ul/孔終止液(2M濃硫酸)，終止反應，見圖1。
[0018]5)將終止后的96孔聚苯乙烯反應板，放入預熱的酶標儀中，讀取各反應孔的0D405數值，并根據以下公式判定結果:S/P值=(樣品OD-陰性對照0D) / (陽性對照OD-陰性對照0D)。S/P值≥0.2，判為陽性，對應群體陽性率≥80% ;S/P值< 0.2，判為陽性，對應群體陽性率< 80%。
[0019]本發明以相同的抗原包被板和分別優化的反應程序，對浙江省某4000頭基礎母豬的地規模化豬場，進行了唾液抗和血清抗體的檢測對照實驗。實際采樣覆蓋動物180頭，采集唾液樣本17個,采集血清樣本180份。如表1所示，相對血清抗體的采集(前腔靜脈采血),唾液抗體樣本的采集在時間和人力需求上,具有明顯優勢。如表2所示，唾液抗體和血清抗體在最終結果的判斷上，符合率在100%，完全可以滿足臨床大樣本的抗體調查需要。
[0020]表1兩種抗體田間采樣所需人員和時間的對比
【權利要求】
1.一種檢測豬唾液中偽狂犬病毒gB蛋白特異性抗體的方法，其特征在于包括如下步驟: 1)利用懸掛棉繩法，誘導動物咀嚼，采集唾液，處理后獲得唾液一抗； 2)將唾液一抗，以PBST溶液1:2稀釋后，按編號加入偽狂犬病毒gB抗原包被的96孔聚苯乙烯反應板的反應孔中，每個反應孔加150ul，37°C飽和濕度反應I小時，以PBST洗滌3次； 3)將辣根過氧化物酶標記的羊抗豬IgG-FC抗體，以PBST溶液1:1500稀釋后，按順序加入到96孔聚苯乙烯反應板的反應孔中，每個反應孔加IOOul，37°C飽和濕度避光反應30分鐘，以PBST洗滌3次； 4)將5%的二甲氧聯苯胺顯色劑，按順序加入到96孔聚苯乙烯反應板的反應孔中，每個反應孔加50ul，避光反應15分鐘，隨后每個反應孔加入50ul 2M濃硫酸； 5)放入酶標儀中，讀取0D405數據，判定結果。
2.根據權利要求1所述的一種檢測豬唾液中偽狂犬病毒gB蛋白特異性抗體的方法，其特征在于， 所述的步驟I)為:以6股、直徑3mm、長Im的全棉繩索懸掛于豬群中間或圍欄上，底端高度與動物肩部齊平，并將繩索的懸掛端解松，待豬群撕咬30min后，回收繩索，并置于無菌的樣品收集袋中，用雙手放在樣品袋外擠出浸潤在繩索上的唾液，并收集與無菌的50ml離心管中，以3000g離心15min，取上清，獲得唾液一抗，保存備用。
3.根據權利要求1所述的一種檢測豬唾液中偽狂犬病毒gB蛋白特異性抗體的方法，其特征在于，所述的步驟5)為:將終止后的96孔聚苯乙烯反應板，放入預熱的酶標儀中，讀取各反應孔的OD405數值，并根據以下公式判定結果:S/P值=(樣品OD-陰性對照0D) / (陽性對照OD-陰性對照0D)，S/P值≥0.2，判為陽性，對應群體陽性率≥80% ;S/P值< 0.2，判為陽性，對應群體陽性率< 80%。
【文檔編號】G01N33/68GK103995125SQ201410147289
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2014年4月14日 優先權日:2014年4月14日
【發明者】李龍, 章葉恩, 曹洋洋 申請人:杭州貝爾塔生物技術有限公司