本發明涉及分子生物學和免疫學領域，具體地說，涉及結核分枝桿菌抗原蛋白Rv2941及其T細胞表位肽在結核病檢測試劑、疫苗和藥物制備中的應用。
背景技術：
：結核病是由結核分枝桿菌引起的慢性傳染性疾病，調查結果顯示全世界有三分之一的人口處于潛伏感染，且有5％～10％在未來的生活中將可能發展為活動性結核病。自1993年世界衛生組織宣布結核病成為全球危機后，結核病的發病率和死亡率一直居高不下，據WHO報告，每年新增結核病人約800萬，每年約有200～300萬人死于結核病。我國在22個結核高負擔國家中位居第2位，全國第5次流行病學抽樣檢查結果顯示：全國130萬人發病，占全球發病率的14.3％，我國也是全球27個耐藥結核病高負擔國家之一，耐多藥結核病患病人數占據全球第一。每個未經治療的活動性肺結核病人能夠傳染10～15人。結核病已經成為全球重要的衛生問題，需引起人們的高度重視。結核的早期診斷和預防治療對結核病的控制至關重要，臨床上常用的是細菌學方法痰涂片鏡檢和痰培養，痰涂片鏡檢是世界范圍內結核病檢查中使用最廣泛的技術，由于此法設備簡便，適合在經濟不發達的地區使用。但是由于對樣本中的菌含量要求高，因此該方法靈敏度不高，導致大量涂陰患者不被發現從而轉陽，且涂陰患者具有傳染性，不容忽視，該方法無種特異性，靈敏度差，受痰液標本和病情的影響。痰培養作為結核病診斷的金標準，但是存在培養時間過長，現在已有BACTECMGIT960系統等快速培養系統可在2周內分離培養結核分枝桿菌，但由于其配制的培養基、營養添加劑、雜菌抑制劑價格昂貴，無法在發展中國家廣泛推廣，并且快速培養與改良L-J培養相比污染率顯著增高，導致假陽性結果出現。常用的用于人群篩查的檢測方法是皮膚結核菌素實驗，使用的是結核菌純蛋白衍生物(PPD)，由于PPD中含有許多分枝桿菌種類(致病性分枝桿菌、環境分枝桿菌和BCG)所共有的抗原分子，因此PPD診斷結核病的特異性較差，不能有效區分結核分枝桿菌感染與卡介苗接種，結核的影像學檢查如常規的X線檢查、CT檢查、MRI檢查、超聲檢查等價格昂貴，且對身體造成一定傷害，特異性低，不適合用于常規的檢查診斷。結核分枝桿菌侵入人體后寄居在巨噬細胞內，人體對結核分枝桿菌主要的免疫反應是細胞免疫應答，主要參與的細胞是CD4+和CD8+T細胞。CD8+T細胞可以通過穿孔素、顆粒酶等途徑將被結核分枝桿菌感染的巨噬細胞或樹突狀細胞殺死從而達到清除結核分枝桿菌的目的。感染結核分枝桿菌的人再次接觸結核分枝桿菌特異性抗原時，T淋巴細胞增殖產生IFN-γ，通過單克隆抗體檢測出IFN-γ即可確定曾經或正在感染結核分枝桿菌。目前以T細胞為基礎的檢測方法T-SPOT是利用IFN-γ特異性抗體捕獲經結核抗原刺激的外周血淋巴細胞培養后產生的IFN-γ，并以酶聯免疫斑點顯色的方式表現出來，從斑點的數量來確定細胞分泌細胞因子的情況，從單細胞水平評價細胞免疫功能。以T細胞為基礎的體外γ干擾素的檢測被用于結核病的輔助診斷，該檢測方法不僅能篩選出活動性結核病人，同時也能檢測出潛伏期病人，從而能更好的預防和控制潛伏期結核，目前已有以結核分枝桿菌基因組RD1區編碼的結核特異性抗原ESAT-6和CFP-10的全蛋白或多肽為刺激物的商品化的IGRA檢測試劑盒，如QuantiFERON-TBGoldtest和T-SPOT，均呈現較高的靈敏性和特異性，但是尚未達到結核病的診斷需求。Rv2941(GI:15610078)位于H37Rv基因組上，全長1743bp，編碼含有580個氨基酸的蛋白，是脂肪酸AMP合成酶，利用生物信息學軟件對其進行抗原表位預測分析，發現Rv2941蛋白存在較多的T細胞表位，具有潛在的診斷效能。本發明建立在反向疫苗學的基礎上，利用計算機篩選出結核分枝桿菌可能的免疫原性抗原庫，然后利用生物信息學軟件TEpredict和IEDB預測結核抗原MHC-I類T細胞表位，通過固態合成法合成這些多肽，先利用人群免疫篩選試驗對結核新抗原進行篩選，篩選出免疫優勢抗原之后，再通過動物實驗對其免疫原性進行驗證，最后經驗證得到的免疫優勢抗原可一方面用于結核診斷，另一方面可用于卡介苗的改造。技術實現要素：本發明的目的是提供結核分枝桿菌抗原蛋白Rv2941的應用。本發明的另一目的是提供結核分枝桿菌抗原蛋白Rv2941T細胞表位肽及其應用。本發明基于T細胞IFN-γ釋放技術，利用生物信息學軟件TEpredict和IEDB對Rv2941編碼基因上T細胞抗原表位進行預測，利用固態合成法合成表位多肽，再通過T-SPOT法(酶聯免疫斑點實驗)對結核病人、肺部其他疾病患者、健康人體內的特異性T淋巴細胞進行檢測，從而評價該抗原用于結核檢測的靈敏度和特異性，同時通過人群免疫學實驗篩選出Rv2941抗原蛋白上的免疫優勢表位肽，確定免疫優勢T細胞表位肽的免疫原性。為了實現本發明目的，本發明提供結核分枝桿菌抗原蛋白Rv2941在制備結核檢測試劑、疫苗和藥物中的應用；其中，所述抗原蛋白Rv2941的氨基酸序列如SEQIDNO:5所示，或該序列經替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有相同免疫原性和相同抗原性的氨基酸序列。本發明還提供結核分枝桿菌抗原蛋白Rv2941T細胞表位肽，所述表位肽選自P327、P330、P332、P334，其氨基酸序列分別如SEQIDNO:1～4所示。本發明還提供由所述T細胞表位肽衍生的表位肽或其類似物。本發明還提供編碼所述表位肽的DNA分子。本發明還提供含有編碼所述表位肽的DNA分子的表達盒及表達載體。本發明還提供含有編碼所述表位肽的DNA分子的轉基因細胞系。本發明還提供含有編碼所述表位肽的DNA分子的重組菌及其表達純化的重組蛋白。本發明還提供所述表位肽、編碼所述表位肽的DNA分子、所述轉基因細胞系或所述重組菌及其表達純化的重組蛋白在制備結核檢測試劑、疫苗和藥物中的應用。本發明還提供一種結核診斷試劑，所述診斷試劑中含有結核分枝桿菌抗原蛋白Rv2941，或編碼所述抗原蛋白Rv2941的DNA分子，或由含有所述DNA分子的重組菌產生的重組蛋白；和/或，所述表位肽、編碼所述表位肽的DNA分子和/或所述重組蛋白。本發明還提供含有上述診斷試劑的結核T-SPOT檢測試劑盒。所述試劑盒還包括以下材料或試劑：①一抗：抗人或動物IFN-γ的小鼠IgG單克隆抗體。②酶標試劑：辣根過氧化物酶標記的抗人或動物IFN-γ不同表位的另一種小鼠IgG單克隆抗體。③標準品：培養板：含有PVDF膜或硝酸纖維素膜的96孔微孔反應板，陽性對照孔中含有結核非特異性刺激抗原(如PHA等)，陰性對照孔含有PBS或基底液。④其他T-SPOT檢測所需的試劑及耗材。優選地，一抗固定在上述微孔反應板上。本發明是基于雙抗體夾心原理，采用T-SPOT法檢測抗原，實驗過程為：PVDF膜上包被的一抗作為捕獲抗體能夠結合細胞上清中的IFN-γ，而IFN-γ又能被酶標二抗捕獲、顯色。兩種抗體為識別IFN-γ不同抗原表位的單克隆抗體。本發明還提供結核分枝桿菌抗原蛋白Rv2941和/或所述表位肽、編碼所述表位肽的DNA分子、所述轉基因細胞系或所述重組菌及其表達純化的重組蛋白在制備結核疫苗和抗結核藥物中的應用。本發明還提供一種結核疫苗，其有效成分為結核分枝桿菌抗原蛋白Rv2941，或編碼所述抗原蛋白Rv2941的DNA分子，或由含有所述DNA分子的重組菌產生的重組蛋白；和/或，所述表位肽、編碼所述表位肽的DNA分子和/或所述重組蛋白。發明還提供一種抗結核藥物，其有效成分包括以結核分枝桿菌抗原蛋白Rv2941和/或所述表位肽作為免疫原，輔以佐劑免疫實驗動物，制備的多克隆抗體，或者以結核分枝桿菌抗原蛋白Rv2941和/或所述表位肽作為免疫原，輔以佐劑免疫實驗動物，采用雜交瘤技術和DNA重組技術，制備的識別所述結核分枝桿菌抗原蛋白Rv2941及其T細胞表位肽抗原的人源化單克隆抗體。本發明進一步提供結核分枝桿菌抗原蛋白Rv2941和/或所述表位肽及其衍生的表位肽或其類似物在檢測結核分枝桿菌感染引起的特異性T細胞和B細胞免疫反應中的應用。其是將人或動物的淋巴細胞經所述表位肽及其衍生的表位肽或其類似物抗原或它們的組合物刺激后，檢測T細胞或B細胞分泌的細胞因子。其中，結核特異性T細胞分泌的細胞因子包括：γ干擾素(IFN-γ)、白細胞介素2(IL-2)、白細胞介素4(IL-4)、白細胞介素10(IL-10)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)等。B細胞分泌的細胞因子包括抗體。針對結核特異性T細胞分泌的細胞因子的檢測方法包括酶聯免疫斑點試驗(ELISPOT)、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)、免疫膠體金試驗、細胞因子內染色和T細胞增殖試驗等。B細胞分泌的細胞因子的檢測方法包括酶聯免疫吸附試驗(ELISA)等。所述淋巴細胞來自人或動物的外周血、靜脈血、腦脊液、胸腔積液或胸水等。本發明具有以下優點：(一)本發明利用結核分枝桿菌Rv2941蛋白抗原及其T細胞表位肽作為刺激物用于結核分枝桿菌感染引起的特異性T細胞和B細胞免疫反應，與以往采用完全抗原相比，能夠降低由于抗原不純造成的假陽性。(二)研究證明，本發明提供的抗原表位均能夠刺激機體產生較強的T細胞免疫反應，因此當使用上述表位作為刺激物進行體外T細胞γ干擾素釋放實驗時，靈敏度顯著提高。(三)采用固相合成的方法合成表位多肽，有利于質量控制，且成本較低，純度高，適合大規模商業化生產。實施方式以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段，所用原料均為市售商品。實施例1結核分枝桿菌抗原基因Rv2941的克隆及蛋白的表達純化Rv2941(GI:15610078)是結核分枝桿菌H37Rv基因組編碼的保守膜蛋白，含580個氨基酸，其氨基酸序列如SEQIDNO:5所示。根據其編碼基因序列，設計引物，利用原核表達系統(如大腸桿菌)表達并純化獲得抗原蛋白Rv2941。實施例2結核分枝桿菌抗原蛋白Rv2941T細胞表位肽的合成基于T細胞IFN-γ釋放技術，利用生物信息學軟件TEpredict和IEDB對Rv2941編碼基因上T細胞抗原表位進行預測，利用固態合成法合成表位多肽，再通過T-SPOT法對結核病人、肺部其他疾病患者、健康人體內的特異性T淋巴細胞進行檢測，從而評價該抗原用于結核檢測的靈敏度和特異性。本實施例提供的結核分枝桿菌抗原蛋白Rv2941T細胞表位肽選自P327、P330、P332、P334，其氨基酸序列分別如SEQIDNO:1～4所示。實施例3結核T-SPOT檢測試劑盒的制備所述試劑盒基本組成如下：①實施例1制備的蛋白抗原Rv2941和/或實施例2合成的表位肽抗原：所述表位肽選自如氨基酸序列SEQIDNO:1～4中的至少一種。②一抗：抗人或動物IFN-γ的小鼠IgG單克隆抗體。酶標試劑：辣根過氧化物酶標記的抗人或動物IFN-γ不同表位的另一種小鼠IgG單克隆抗體。③標準品：培養板：含有PVDF膜或硝酸纖維素膜的96孔微孔反應板，陽性對照孔中含有結核非特異性刺激抗原(如PHA等)，陰性對照孔含有PBS或基底液。④其他T-SPOT檢測所需的試劑及耗材。將一抗固定在上述微孔反應板上。該試劑盒是基于雙抗體夾心原理設計的，采用T-SPOT法檢測抗原，實驗過程為：PVDF膜上包被的一抗作為捕獲抗體能夠結合細胞上清中的IFN-γ，而IFN-γ又能被酶標二抗捕獲、顯色。兩種抗體為識別IFN-γ不同抗原表位的單克隆抗體。實施例4抗原表位肽用于結核感染的臨床檢測1.外周血淋巴細胞的分離1.1受試對象①志愿者病例的篩選標準：臨床表現癥狀、體征及胸部影像學檢查診斷為肺結核的，且痰培養為陽性的肺結核患者。②肺部疾病患者的篩選標準：痰培養和痰涂片為陰性的肺部其他疾病，如塵肺、慢阻肺等肺部疾病患者。③健康志愿者的篩選標準：無結核臨床癥狀、無結核病人密切接觸史、無其他疾病或感染。入選的結核病患者和志愿者年齡在15-80歲之間，從到結核病室就診的連續時間樣本中隨機選取。共采集了50例結核病志愿者、42例肺部疾病患者及55例健康志愿者血液樣本，采血時使用無內毒素的肝素抗凝真空采血管采集外周靜脈血，每名志愿者采血約5ml～10ml。1)樣品于4小時內用Ficoll-Hypaque分離液分離PBMCs。2)先將全血用RPMI-1640培養基1:1稀釋混勻，在離心管中加入一定體積的分離液，將稀釋后的血樣平鋪到分離液液面上方，保持兩液面界面清晰，分離液、抗凝未經稀釋全血、RPMI1640培養基體積為1:1:1，室溫(18～26℃)，800g離心20分鐘。3)離心結束后，管底是紅細胞，中間層是分離液，最上層是血漿層，血漿層與分離液層之間是白色云霧狀的單個核細胞(包括淋巴細胞和單核細胞)層。用吸管吸取白色云霧狀細胞層并轉移至15ml無菌離心管中，加入RPMI1640培養基至10ml，室溫下800g離心10分鐘。4)棄去上清，重懸后加入7mlRPMI1640培養基，700g離心10分鐘。5)棄去上清加0.5mlAIM-V培養基重懸沉淀。6)利用自動細胞計數儀對細胞計數，用AIM-V培養基配制500μL細胞濃度為2.5×106/ml的細胞懸液。2.抗原表位肽的準備將實施例2中固相合成法合成的抗原表位肽用DMSO溶解，各條表位肽分別用含10％胎牛血清的RPIM1640培養基稀釋至一定濃度后使用。3.T-SPOT檢測抗原表位肽特異性T細胞采用實施例3的試劑盒，向預包被一抗的微孔板中加入以下試劑，每個病人分別設6個檢測孔：陽性對照孔(加100μL濃度為15μg/ml的植物血凝素PHA作為陽性刺激物)、陰性對照孔(加100μLPBS作為陰性對照)、4個檢測孔(兩個孔中分別加入100μL濃度為20μg/ml的多肽P327、P330、P332、P334)，每個孔中加入100μL上述稀釋好的PBMC，使每孔中PBMC的數量達25萬個，將抗原與PBMC細胞置于37℃，5％CO2的培養箱中培養20小時。4.洗板及結果判定洗去PBMC細胞和抗原刺激物，加100μL一抗室溫下孵育1小時，用PBS洗5遍，加二抗室溫孵育1小時，再用PBS洗5遍，加底物避光顯色7分鐘后，用純化水終止顯色，將培養板放在通風口處晾干觀察板上的斑點數。結果判定(表1)：空白對照孔斑點數＝N、檢測孔斑點數＝T、陽性質控孔斑點數＝P。表1T-SPOT結果判斷標準其中兩條表位肽檢測50例結核病人、42例肺部其他疾病患者和55個健康人的結果統計見表2。表2Rv2941蛋白抗原四條表位肽檢測靈敏度和特異度統計表位肽靈敏度(％)特異度(％)P3278100P330497.94P33212100P33412100四條多肽聯合2497.94檢測靈敏度＝(結核病患者檢測陽性數/結核病患者總數)×100％檢測特異度＝1-(肺結核病患者檢測陽性數+健康志愿者檢測陽性數)/(肺部疾病患者總數+健康志愿者總數)按照單條多肽檢測出陽性即為陽性的原則，經計算得出Rv2941蛋白抗原P327、P330、P332、P334四條表位肽聯合檢測出結核病人的靈敏度為24％，特異度為97.94％。優選地，在本發明的結核病診斷試劑盒中采用ESAT6和CFP10聯合抗原可提高結核病的診斷效率，本實施例中結核病人PBMC對Rv2941及其表位多肽具有細胞免疫應答，而肺部其他疾患病人和健康人的PBMC對Rv2941及其表位多肽無免疫應答，證實Rv2941蛋白表位多肽能夠被結核病人特異性識別，且四條多肽的聯合診斷效率相對于單條多肽的診斷效率提高，因此Rv2941及其表位肽具有潛在的診斷性能，可以考慮作為聯合抗原，用于結核病的檢測試劑中。另外，人群篩選試驗也證實了Rv2941表位多肽能刺激機體產生的IFN-γ，IFN-γ可以激活巨噬細胞從而促進巨噬細胞對結核分枝桿菌的清除，因此可以考慮將Rv2941及其表位多肽用于結核的疫苗的構建和制備。雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳盡的描述，但在本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發明要求保護的范圍。當前第1頁1 2 3