本發明涉及細菌培(pei)(pei)養領域，具體涉及一種分枝桿(gan)菌快速分離(li)培(pei)(pei)養方法(fa)。

背景技術：

分(fen)枝(zhi)(zhi)桿(gan)(gan)菌(jun)(jun)(jun)屬(Mycobacterium)是一(yi)類(lei)細長略彎曲的(de)(de)(de)(de)微生物，有(you)時有(you)分(fen)枝(zhi)(zhi)或出(chu)現(xian)(xian)絲狀(zhuang)體。目(mu)前在(zai)(zai)分(fen)類(lei)學(xue)上已將(jiang)分(fen)枝(zhi)(zhi)桿(gan)(gan)菌(jun)(jun)(jun)屬歸納于(yu)放(fang)(fang)線(xian)菌(jun)(jun)(jun)中(zhong)。對(dui)人(ren)致病的(de)(de)(de)(de)放(fang)(fang)線(xian)菌(jun)(jun)(jun)可分(fen)含和不含分(fen)枝(zhi)(zhi)菌(jun)(jun)(jun)酸兩類(lei)。分(fen)枝(zhi)(zhi)桿(gan)(gan)菌(jun)(jun)(jun)可通過(guo)(guo)呼吸(xi)道、消化道或皮膚損(sun)傷侵(qin)入易感機(ji)體，引(yin)起(qi)多種組織器官的(de)(de)(de)(de)結(jie)(jie)核(he)病，其(qi)中(zhong)以(yi)通過(guo)(guo)呼吸(xi)道引(yin)起(qi)肺結(jie)(jie)核(he)為(wei)最多。結(jie)(jie)核(he)病至今(jin)仍(reng)為(wei)重(zhong)(zhong)(zhong)要的(de)(de)(de)(de)傳染(ran)病。據世(shi)界衛生組織統計，分(fen)枝(zhi)(zhi)桿(gan)(gan)菌(jun)(jun)(jun)每(mei)年引(yin)起(qi)全球(qiu)約(yue)300萬(wan)人(ren)死亡。20世(shi)紀80年代后結(jie)(jie)核(he)病的(de)(de)(de)(de)發病率(lv)曾(ceng)有(you)所(suo)降(jiang)低，但近年其(qi)全球(qiu)疫(yi)情(qing)又(you)呈上升(sheng)趨勢，而且由于(yu)分(fen)枝(zhi)(zhi)桿(gan)(gan)菌(jun)(jun)(jun)耐藥(yao)性和多重(zhong)(zhong)(zhong)耐藥(yao)菌(jun)(jun)(jun)株(zhu)的(de)(de)(de)(de)出(chu)現(xian)(xian)，結(jie)(jie)核(he)病對(dui)某(mou)些國(guo)家已構成嚴重(zhong)(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)健康(kang)威脅。我(wo)國(guo)是世(shi)界上22個(ge)結(jie)(jie)核(he)病高負(fu)擔國(guo)家之一(yi)，我(wo)國(guo)三分(fen)之一(yi)左右的(de)(de)(de)(de)人(ren)口已感染(ran)了結(jie)(jie)核(he)分(fen)枝(zhi)(zhi)桿(gan)(gan)菌(jun)(jun)(jun)，受(shou)感染(ran)人(ren)數超過(guo)(guo)4億。我(wo)國(guo)現(xian)(xian)有(you)肺結(jie)(jie)核(he)病人(ren)約(yue)500萬(wan)，主要集(ji)中(zhong)在(zai)(zai)25歲及以(yi)上人(ren)群；其(qi)中(zhong)涂(tu)陽肺結(jie)(jie)核(he)病人(ren)150萬(wan)；每(mei)年約(yue)有(you)25萬(wan)人(ren)死于(yu)結(jie)(jie)核(he)病，死亡平均年齡為(wei)55.2歲。據研究，受(shou)結(jie)(jie)核(he)菌(jun)(jun)(jun)感染(ran)的(de)(de)(de)(de)人(ren)群中(zhong)，10％的(de)(de)(de)(de)人(ren)會發展為(wei)結(jie)(jie)核(he)病。在(zai)(zai)臨(lin)床上，只有(you)快速分(fen)離培養(yang)出(chu)結(jie)(jie)核(he)分(fen)枝(zhi)(zhi)桿(gan)(gan)菌(jun)(jun)(jun)，并(bing)對(dui)其(qi)進行培養(yang)藥(yao)敏測試，才能進一(yi)步找(zhao)到(dao)對(dui)結(jie)(jie)核(he)分(fen)枝(zhi)(zhi)桿(gan)(gan)菌(jun)(jun)(jun)有(you)效的(de)(de)(de)(de)藥(yao)物，因此要求(qiu)提(ti)高結(jie)(jie)核(he)分(fen)枝(zhi)(zhi)桿(gan)(gan)菌(jun)(jun)(jun)的(de)(de)(de)(de)分(fen)離培養(yang)的(de)(de)(de)(de)速度，并(bing)且要求(qiu)盡(jin)量避免培養(yang)過(guo)(guo)程中(zhong)存在(zai)(zai)的(de)(de)(de)(de)雜菌(jun)(jun)(jun)污染(ran)問題(ti)。

目前(qian)結核(he)病(bing)的(de)實(shi)(shi)驗(yan)室診斷已經發展到基因研究的(de)水(shui)平，國(guo)際上也有許多先進(jin)的(de)技術應用于臨(lin)床實(shi)(shi)驗(yan)室，但固體(ti)培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)法(fa)(fa)及(ji)表型(xing)藥(yao)敏(min)仍然是目前(qian)結核(he)病(bing)診斷領(ling)域的(de)金標(biao)準(zhun)。長期以來我國(guo)大(da)部(bu)分(fen)(fen)的(de)各級實(shi)(shi)驗(yan)室一直采(cai)用羅(luo)氏(shi)固體(ti)培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)基進(jin)行(xing)培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)，但其培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)時(shi)間(jian)需(xu)要(yao)一個月以上。進(jin)行(xing)表型(xing)藥(yao)敏(min)檢測前(qian)需(xu)要(yao)獲得分(fen)(fen)枝桿(gan)(gan)(gan)(gan)菌的(de)分(fen)(fen)離(li)培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)菌落，而(er)羅(luo)氏(shi)固體(ti)培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)基培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)出分(fen)(fen)枝桿(gan)(gan)(gan)(gan)菌陽性(xing)培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)物均為成團(tuan)結塊生長，在(zai)做藥(yao)敏(min)之前(qian)必須磨菌，將成團(tuan)的(de)分(fen)(fen)枝桿(gan)(gan)(gan)(gan)菌打磨分(fen)(fen)散均勻才能進(jin)行(xing)下一步(bu)藥(yao)敏(min)實(shi)(shi)驗(yan)，存在(zai)生物安全風(feng)險高、勞動強度(du)大(da)、耗(hao)時(shi)耗(hao)力的(de)難題(ti)。因此迫切需(xu)要(yao)一種快(kuai)速(su)培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)分(fen)(fen)枝桿(gan)(gan)(gan)(gan)菌以及(ji)簡單的(de)操作(zuo)方法(fa)(fa)用于對接后期的(de)分(fen)(fen)枝桿(gan)(gan)(gan)(gan)菌藥(yao)敏(min)檢測。

技術實現要素：

本發明所要解決的(de)技術問題是克服現有技術的(de)不足，提供一種步驟簡單、培養時間(jian)短、無需磨菌的(de)分枝(zhi)桿菌快速分離培養方法。

本發明(ming)方(fang)法所采用(yong)的技術方(fang)案是(shi)，該方(fang)法是(shi)在(zai)分(fen)(fen)支(zhi)桿(gan)菌(jun)(jun)培養(yang)(yang)基(ji)(ji)上(shang)進行培養(yang)(yang)，所述分(fen)(fen)支(zhi)桿(gan)菌(jun)(jun)培養(yang)(yang)基(ji)(ji)包括(kuo)液(ye)體培養(yang)(yang)基(ji)(ji)、無菌(jun)(jun)稀釋(shi)液(ye)和雜菌(jun)(jun)抑(yi)制劑(ji)(ji)，所述液(ye)體培養(yang)(yang)基(ji)(ji)包括(kuo)基(ji)(ji)礎培養(yang)(yang)基(ji)(ji)、促生長劑(ji)(ji)、抑(yi)菌(jun)(jun)劑(ji)(ji)和分(fen)(fen)散劑(ji)(ji)，在(zai)所述分(fen)(fen)枝桿(gan)菌(jun)(jun)培養(yang)(yang)基(ji)(ji)內加入(ru)有磁力(li)攪拌子，該方(fang)法包括(kuo)以下步驟：

（1）通過堿處(chu)理中(zhong)和(he)離心(xin)沉(chen)淀法對分支(zhi)桿菌待檢(jian)標本進行(xing)抗污染液化處(chu)理；

（2）取出(chu)凍干雜菌抑制(zhi)劑(ji)，加入無菌稀釋液后充分搖(yao)勻；

（3）取(qu)出液(ye)體培(pei)(pei)養基，恢復至室溫，吸取(qu)混(hun)合均勻的雜(za)菌抑制(zhi)劑(ji)加入液(ye)體培(pei)(pei)養基，充分混(hun)合均勻；

（4）取所述步(bu)驟(zou)（2）處理(li)后的標本溶(rong)液，在無菌條件下接種于所述步(bu)驟(zou)（3）中的培養(yang)基里，并置于多通道磁力(li)攪拌機上，恒溫37℃全程進行混懸培養(yang)；

（5）用(yong)實時(shi)濁(zhuo)度分(fen)析儀檢測(ce)，實時(shi)記錄液體培養(yang)基的(de)濁(zhuo)度值(zhi)(zhi)變化，經過7-14天時(shi)間培養(yang)，當檢測(ce)到(dao)的(de)麥(mai)氏濁(zhuo)度值(zhi)(zhi)達(da)到(dao)1.0或以上并呈現特殊的(de)生長曲線，此培養(yang)可(ke)判斷為陽性(xing)，結(jie)束(shu)培養(yang)。

進一(yi)步(bu)地，所述(shu)無菌稀釋液為鉀鹽或鈉鹽的無菌溶(rong)液。

另進(jin)一步地，所述雜菌(jun)抑(yi)制劑和所述抑(yi)菌(jun)劑為含有至少一種抗生素(su)的(de)凍干制劑，所述抗生素(su)包括但不限于多(duo)粘菌(jun)素(su)B、兩性霉(mei)素(su)B、林可(ke)霉(mei)素(su)、甲(jia)氧芐啶和萘啶酸。

再進一步(bu)地，所述分散劑(ji)為吐溫20或(huo)吐溫80或(huo)曲拉通X-100。

又再進(jin)一步地，所述基(ji)礎培養基(ji)包(bao)括(kuo)但(dan)不限于(yu)7H9干(gan)粉、甘油(you)和純化(hua)水(shui)。

再又(you)進一(yi)步地(di)，所述(shu)促生長劑包括但不限(xian)于葡萄糖、氯化(hua)鈉和過氧化(hua)氫酶。

本發明(ming)的(de)有益效果是(shi)：本發明(ming)中(zhong)，分(fen)(fen)枝(zhi)桿(gan)(gan)菌(jun)(jun)(jun)培(pei)(pei)(pei)(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)基(ji)(ji)(ji)由(you)磁力(li)攪拌(ban)子和(he)(he)液(ye)(ye)體(ti)(ti)培(pei)(pei)(pei)(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)基(ji)(ji)(ji)兩部分(fen)(fen)組成(cheng)，液(ye)(ye)體(ti)(ti)部分(fen)(fen)由(you)基(ji)(ji)(ji)礎(chu)培(pei)(pei)(pei)(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)基(ji)(ji)(ji)、促(cu)生(sheng)長(chang)(chang)劑、抑菌(jun)(jun)(jun)劑和(he)(he)分(fen)(fen)散劑組成(cheng)。該(gai)培(pei)(pei)(pei)(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)基(ji)(ji)(ji)既(ji)能選擇性(xing)(xing)地促(cu)進分(fen)(fen)枝(zhi)桿(gan)(gan)菌(jun)(jun)(jun)的(de)快(kuai)速(su)生(sheng)長(chang)(chang)，又(you)能抑制其它雜(za)菌(jun)(jun)(jun)生(sheng)長(chang)(chang)，分(fen)(fen)枝(zhi)桿(gan)(gan)菌(jun)(jun)(jun)在(zai)(zai)液(ye)(ye)體(ti)(ti)培(pei)(pei)(pei)(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)基(ji)(ji)(ji)里經磁力(li)攪拌(ban)子的(de)旋轉培(pei)(pei)(pei)(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)，在(zai)(zai)液(ye)(ye)體(ti)(ti)培(pei)(pei)(pei)(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)基(ji)(ji)(ji)中(zhong)形成(cheng)一定的(de)濁度，麥氏(shi)濁度值達(da)到1.0或(huo)以上之后(hou)的(de)分(fen)(fen)枝(zhi)桿(gan)(gan)菌(jun)(jun)(jun)液(ye)(ye)體(ti)(ti)培(pei)(pei)(pei)(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)基(ji)(ji)(ji)，可以直接(jie)進行下一步的(de)藥敏測(ce)試。本發明(ming)采用(yong)的(de)液(ye)(ye)體(ti)(ti)培(pei)(pei)(pei)(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)基(ji)(ji)(ji)提供(gong)分(fen)(fen)枝(zhi)桿(gan)(gan)菌(jun)(jun)(jun)快(kuai)速(su)生(sheng)長(chang)(chang)所需的(de)營養(yang)(yang)縮(suo)短培(pei)(pei)(pei)(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)耗時(shi)，利用(yong)培(pei)(pei)(pei)(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)基(ji)(ji)(ji)內特殊的(de)分(fen)(fen)散劑及(ji)混(hun)懸培(pei)(pei)(pei)(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)的(de)方式避免(mian)分(fen)(fen)枝(zhi)桿(gan)(gan)菌(jun)(jun)(jun)成(cheng)團(tuan)生(sheng)長(chang)(chang)，陽(yang)性(xing)(xing)培(pei)(pei)(pei)(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)物無需磨菌(jun)(jun)(jun)即可對(dui)接(jie)藥敏實驗；分(fen)(fen)枝(zhi)桿(gan)(gan)菌(jun)(jun)(jun)液(ye)(ye)體(ti)(ti)培(pei)(pei)(pei)(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)基(ji)(ji)(ji)7-14天即可獲(huo)得陽(yang)性(xing)(xing)培(pei)(pei)(pei)(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)結果，比傳統(tong)的(de)固(gu)體(ti)(ti)羅(luo)氏(shi)培(pei)(pei)(pei)(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)檢測(ce)時(shi)間(jian)大(da)大(da)縮(suo)短，陽(yang)性(xing)(xing)培(pei)(pei)(pei)(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)物無需磨菌(jun)(jun)(jun)直接(jie)對(dui)接(jie)藥敏實驗，具(ju)有耗時(shi)短、生(sheng)物安全性(xing)(xing)高、省(sheng)時(shi)省(sheng)力(li)的(de)優點，具(ju)有良好的(de)推廣應用(yong)前景(jing)，適合在(zai)(zai)我(wo)國(guo)各級結核病專業收治機構推廣使用(yong)。

附圖說明

圖1是結核分(fen)枝桿菌濁(zhuo)度變(bian)化曲線圖。

具體實施方式

本(ben)發明方法是在(zai)分(fen)(fen)支桿(gan)菌(jun)培(pei)養(yang)(yang)(yang)基(ji)(ji)上(shang)進(jin)行培(pei)養(yang)(yang)(yang)，所(suo)(suo)述(shu)分(fen)(fen)支桿(gan)菌(jun)培(pei)養(yang)(yang)(yang)基(ji)(ji)包(bao)(bao)括(kuo)(kuo)(kuo)液(ye)(ye)(ye)體培(pei)養(yang)(yang)(yang)基(ji)(ji)、無菌(jun)稀(xi)釋液(ye)(ye)(ye)和雜(za)菌(jun)抑制(zhi)劑(ji)(ji)，所(suo)(suo)述(shu)液(ye)(ye)(ye)體培(pei)養(yang)(yang)(yang)基(ji)(ji)包(bao)(bao)括(kuo)(kuo)(kuo)基(ji)(ji)礎(chu)(chu)培(pei)養(yang)(yang)(yang)基(ji)(ji)、促(cu)生(sheng)(sheng)長劑(ji)(ji)、抑菌(jun)劑(ji)(ji)和分(fen)(fen)散劑(ji)(ji)，在(zai)所(suo)(suo)述(shu)分(fen)(fen)枝(zhi)桿(gan)菌(jun)培(pei)養(yang)(yang)(yang)基(ji)(ji)內(nei)加入有(you)磁力(li)攪拌(ban)子(zi)。其(qi)中，所(suo)(suo)述(shu)雜(za)菌(jun)抑制(zhi)劑(ji)(ji)或(huo)(huo)抑菌(jun)劑(ji)(ji)為(wei)含有(you)至少一種抗(kang)(kang)生(sheng)(sheng)素(su)(su)(su)(su)的(de)凍干(gan)制(zhi)劑(ji)(ji)，所(suo)(suo)述(shu)抗(kang)(kang)生(sheng)(sheng)素(su)(su)(su)(su)為(wei)多(duo)(duo)粘(zhan)菌(jun)素(su)(su)(su)(su)B、兩(liang)性(xing)霉素(su)(su)(su)(su)B、林(lin)可霉素(su)(su)(su)(su)、甲氧芐啶(ding)和萘啶(ding)酸，或(huo)(huo)其(qi)它。所(suo)(suo)述(shu)分(fen)(fen)散劑(ji)(ji)選自吐溫20或(huo)(huo)吐溫80或(huo)(huo)曲(qu)拉通(tong)X-100。所(suo)(suo)述(shu)基(ji)(ji)礎(chu)(chu)培(pei)養(yang)(yang)(yang)基(ji)(ji)包(bao)(bao)括(kuo)(kuo)(kuo)7H9干(gan)粉(fen)、甘油(you)和純化水(shui)。所(suo)(suo)述(shu)促(cu)生(sheng)(sheng)長劑(ji)(ji)包(bao)(bao)括(kuo)(kuo)(kuo)葡(pu)萄糖、氯化鈉和過(guo)氧化氫(qing)酶，也可選擇(ze)其(qi)它促(cu)生(sheng)(sheng)長劑(ji)(ji)。在(zai)本(ben)實施例中，將基(ji)(ji)礎(chu)(chu)培(pei)養(yang)(yang)(yang)基(ji)(ji)、促(cu)生(sheng)(sheng)長劑(ji)(ji)、抑菌(jun)劑(ji)(ji)按照900：100：1的(de)比例混合(he)均勻后(hou)，用玻璃(li)螺口瓶（內(nei)含磁力(li)攪拌(ban)子(zi)1個）灌(guan)裝(zhuang)為(wei)6ml/支，共20支/盒。無菌(jun)稀(xi)釋液(ye)(ye)(ye)為(wei)3ml/支的(de)鉀(jia)鹽、鈉鹽無菌(jun)溶(rong)液(ye)(ye)(ye)，用防盜滴瓶灌(guan)裝(zhuang)，1支/盒。雜(za)菌(jun)抑制(zhi)劑(ji)(ji)為(wei)多(duo)(duo)粘(zhan)菌(jun)素(su)(su)(su)(su)B、兩(liang)性(xing)霉素(su)(su)(su)(su)B等抗(kang)(kang)生(sheng)(sheng)素(su)(su)(su)(su)的(de)凍干(gan)制(zhi)劑(ji)(ji)，將多(duo)(duo)粘(zhan)菌(jun)素(su)(su)(su)(su)B、兩(liang)性(xing)霉素(su)(su)(su)(su)B等抗(kang)(kang)生(sheng)(sheng)素(su)(su)(su)(su)的(de)混合(he)藥液(ye)(ye)(ye)通(tong)過(guo)真空冷凍干(gan)燥工藝制(zhi)得，1支/盒。

本發明(ming)方法(fa)包括以下步驟：

（1）參照《結(jie)核病診斷實(shi)驗室檢驗規程》中的堿處(chu)理中和離心沉淀法對分支(zhi)桿菌(jun)待檢標(biao)本(ben)進行抗污染(ran)液(ye)化(hua)處(chu)理。

（2）取(qu)出凍干雜菌(jun)抑制劑，旋開(kai)瓶蓋，加入無(wu)菌(jun)稀釋液后充分搖勻。

（3）取出液(ye)體(ti)培(pei)養(yang)基，恢復至室溫，吸取混合(he)均勻的雜菌抑制(zhi)劑加入液(ye)體(ti)培(pei)養(yang)基，充分混合(he)均勻。

（4）取所述步驟(zou)（2）處理(li)后的(de)標本溶液0.1ml，在無菌條件(jian)下(xia)接種于所述步驟(zou)（3）中的(de)培養基(ji)里(li)，并置于多通道磁(ci)力攪(jiao)(jiao)拌機(ji)上，設置好(hao)轉速(su)，轉速(su)范圍為(wei)80轉/分鐘(zhong)～100轉/分鐘(zhong)，恒溫37℃全程進行混(hun)懸培養。其中的(de)多通道磁(ci)力攪(jiao)(jiao)拌機(ji)選自由賽洛(luo)捷克提供(gong)的(de)型號為(wei)MS-H-S10的(de)磁(ci)力攪(jiao)(jiao)拌機(ji)。

（5）如(ru)圖1所示的(de)(de)(de)(de)(de)是結核分枝桿菌(jun)濁(zhuo)度變化(hua)曲(qu)線圖。用(yong)實時濁(zhuo)度分析儀檢測，實時記錄液體培(pei)養(yang)(yang)基的(de)(de)(de)(de)(de)濁(zhuo)度值變化(hua)，經(jing)過7-14天時間培(pei)養(yang)(yang)，當檢測到(dao)的(de)(de)(de)(de)(de)麥氏濁(zhuo)度值達(da)到(dao)1.0或以上(shang)并呈現特殊的(de)(de)(de)(de)(de)生(sheng)長曲(qu)線，此(ci)培(pei)養(yang)(yang)可判斷為陽性，結束培(pei)養(yang)(yang)。進行下一步的(de)(de)(de)(de)(de)微孔板的(de)(de)(de)(de)(de)藥敏測試結果。

采用分枝桿(gan)菌(jun)液體培(pei)養(yang)基進行分枝桿(gan)菌(jun)分離(li)培(pei)養(yang)報陽后的菌(jun)液進行藥敏測試按以下(xia)步驟進行：

（a）將(jiang)混懸液體(ti)培養(yang)后(hou)陽(yang)性菌稀釋至1.0麥氏(shi)濁度，直接接種(zhong)于藥敏(min)羅氏(shi)培養(yang)基或分(fen)枝(zhi)桿菌藥敏(min)液體(ti)培養(yang)基中(zhong)，按各(ge)自的說明書要求進(jin)行操作。

（b）剩(sheng)余的混懸液體培養后陽性菌，可(ke)繼續保留培養7天左右的時間作(zuo)為菌種保存等(deng)其他用(yong)處，或者直接高壓滅菌處理。

本發明用于解(jie)決當(dang)前分枝(zhi)桿菌固(gu)體分離培養(yang)及傳(chuan)統羅氏藥敏檢測(ce)報陽時間長(chang)的(de)問題，并(bing)且解(jie)決分枝(zhi)桿菌藥敏實驗(yan)前的(de)繁瑣的(de)磨菌問題，解(jie)決磨菌過程中(zhong)存在的(de)生(sheng)物安(an)全風險高、勞動強(qiang)度(du)大以及耗(hao)時耗(hao)力的(de)問題。

本發(fa)明可應用于細菌培(pei)養技(ji)術領域。