結核分枝桿菌EmbB突變基因及其用圖
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種結核分枝桿菌EmbB突變基因，以及用于檢測導致結核分枝桿菌 乙胺丁醇耐藥基因 EmbB突變c. 233A>G的試劑盒，屬于結核病耐藥基因突變檢測技術領域。
【背景技術】
[0002] 人類結核病是由結核分枝桿菌引發的一類傳染性很強的疾病，會累及全身多個器 官和組織。該病的發生嚴重影響患者的生活和工作，并給家庭和社會帶來了沉重的經濟負 擔。由于發展中國家生活水平和醫療衛生水平低下，結核病在不發達國家的發病率高于發 達國家。中國是人口大國，且屬于發展中國家，因此結核病的發病率位于世界前列。雖然隨 著人們生活水平的提高，抗結核藥物和卡介苗的應用，結核病的發病率有所降低。但是，結 核病的發病率有上升的趨勢。2013年，僅肺結核的患者就達到90萬人，約占我國主要傳染 病患者的1/3,單純肺結核死亡人數為2576人。隨著抗生素耐藥問題的出現和HIV患者的 增多，耐藥結核患者也有增多的趨勢，且是目前結核病防治的難點和重點之一。有數據顯 示，HIV患者中，結核的聯合感染率高達25%以上，且耐藥結核菌株占半數以上。因此，對結 核患者，特別是耐藥結核患者的快速診斷，將有助于臨床對結核患者的治療方案的選擇。
[0003] 乙胺丁醇常與異煙肼、利福平、吡嗪酰胺一起聯合使用治療結核。該藥物可干擾細 胞壁阿拉伯半乳聚糖的合成，抑制細胞壁阿拉伯聚糖層阿拉伯半乳聚糖和脂質阿拉伯甘露 聚糖的聚合作用，誘導D-阿拉伯呋喃糖殘基的積累。已經證實與結核菌耐EMB相關的最常 見突變基因是embB基因，該基因全長3285 bp，編碼阿拉伯糖基轉移酶主要成分(阿拉伯糖 基轉移酶編碼基因 emb操縱子由embA、embB、embC三部分組成)。已有報道表明embB基因 的306和406位氨基酸突變，改變了所編碼酶的結構，產生耐藥。Ramaswamy等通過檢測臨 床耐乙胺丁醇藥物菌株的embA基因，發現存在462和913位氨基酸突變。我們在實驗中發 現了一例乙胺丁醇耐藥的患者存在embB基因78位氨基酸的突變。表明embB基因突變的 檢測可以快速提示乙胺丁醇耐藥，從而選擇適合患者的治療藥物。
[0004] 由于多種原因的影響，結核的發病率和死亡率有逐年增多的趨勢，特別是耐藥結 核患者的增多，給國家和家庭的經濟都帶來了很重的負擔，更給患者帶來了嚴重的壓力。因 此對耐藥結核患者有針對性的進行耐藥基因檢測，會大大縮短藥敏實驗時間，為結核患者 的有效治療提供強有力的參考價值。乙胺丁醇與其他藥物聯合應用，會縮短結核患者的治 療周期，是臨床常用的抗結核藥物之一，因此對EmbB基因 c. 233A>G進行檢測將有助于臨床 對耐藥結核患者的快速診斷和治療。經文獻檢索，未見與本發明檢測突變位點相同的公開 報道。

【發明內容】

[0005] 本發明的目的在于提供一種檢測結核分枝桿菌EmbB突變基因的方法，該結核分 枝桿菌EmbB突變基因具有c. 233A>G突變位點，其核苷酸序列如SEQ ID N0 :3所示。
[0006] 本發明另一目的是提供用于檢測結核分枝桿菌EmbB突變基因的試劑盒，該試劑 盒包括用于檢測結核分枝桿菌EmbB基因 c. 233A>G突變的試劑。
[0007] 所述試劑盒包括核苷酸序列如SEQ ID N0 :1和SEQ ID N0 :2所示的引物。
[0008] 本發明通過檢測來自耐乙胺丁醇結核菌株的樣本中是否存在EmbB基因的 c. 233A>G突變，從而判斷該患者耐乙胺丁醇藥物的耐藥分子機制；其中c. 233A>G突變位點 為EmbB基因的突變，該突變導致EmbB基因第78位的天冬氨酸（Asp)突變為甘氨酸（Gly)， 這個氨基酸的改變，影響了阿拉伯糖基轉移酶的活性，抑制了乙胺丁醇的藥效，從而使該菌 株產生耐藥。
[0009] 發明人用候選基因篩查的方法，在中國18株耐乙胺丁醇結核菌株中進行檢測，在 一株耐藥結核菌種發現與耐乙胺丁醇相關的EmbB基因新突變c. 233A>G，該突變的頻率為 5. 6%，這說明在耐乙胺丁醇的結核菌株中，EmbB基因突變c. 233A>G具有一定的發生頻率， 因此EmbB基因突變c. 233A>G可以作為臨床異乙胺丁醇耐藥菌株耐藥分子機制的診斷依 據，并且目前，在國際和國內均未見該突變的報道。
[0010] 本發明用于檢測EmbB基因突變c. 233A>G的試劑盒，包括用于檢測EmbB基因的突 變c. 233A>G所需的試劑和能選用的用于擴增EmbB基因的試劑和PCR引物。
[0011] 用于檢測EmbB基因 c. 233A>G突變的試劑盒，包括以下一種或幾種試劑的組合： (1) 從待檢樣品中提取DNA的試劑； (2) 用于擴增結核菌樣本DNA的EmbB基因 c. 233A>G突變的PCR引物和相關的PCR反 應試劑； (3) PCR產物純化試劑； (4) 對PCR產物進行直接測序的試劑。
[0012] 用于檢測EmbB基因突變c. 233A>G的試劑盒，所用的PCR引物為： EmbB-F :5' -TGATTGGCTTTGTGTTGTCG-3' EmbB-R :5' -GAACACCCCGACAATCTGCG-3' 用于檢測EmbB基因突變c. 233A>G的試劑盒，所述檢測PCR擴增產物的試劑選自測序 檢測試劑、限制性內切酶長度多態性檢測試劑、序列特異性引物檢測試劑、探針雜交檢測試 劑及SNP分型檢測試劑。
[0013] 采用PCR擴增-直接測序的方法來檢測樣本的突變情況，具體操作步驟如下： (1) 采集待測個體的樣本，為培養的結核菌樣本，提取全基因組DNA ; (2) 以提取的DNA為模板，以本發明設計的針對EmbB基因 c. 233A>G突變的引物進行突 變區段DNA序列的擴增，得到相應的PCR擴增產物； (3) 將得到的PCR產物純化后，進行直接測序分析，將所測得的序列與EmbB基因的正常 序列進行比對，確定c. 233A>G突變是否存在； (4) 根據以上實驗結果分析患者是否為EmbB基因突變c. 233A>G導致的耐乙胺丁醇結 核分枝桿菌菌株； (5) 按照正常編碼序列閱讀框對突變序列進行翻譯，進一步確定p. D78G突變的存在。
[0014] 發明人在收集耐藥結核分枝桿菌進行實驗的過程中，收集到18株耐乙胺丁醇的 結核菌株，在取得患者同意的前提下，對患者感染的結核分枝桿菌進行基因檢測。同時，我 們還收集了患者的基本信息和臨床信息，詳細詢問了其感染和發病過程，建立了結核分枝 桿菌耐藥株的樣本庫。將滅活的結核分枝桿菌凍存于-80°C冰箱。用柱吸附的方法提取 結核菌的基因組DNA，保存于-40°C冰箱，每份DNA樣本具有對應的患者資料和耐藥信息。 用引物設計軟件Primer5和Olig〇6設計PCR擴增引物，包括了結核菌EmbB基因104位到 548位堿基的DNA片段，用于PCR擴增。PCR擴增產物直接用PCR引物進行正反向測序(測 序所用儀器為ABI公司3730型DNA測序儀)。將得到的序列與GenBank中的序列(序列號： KM189805)進行比對，確定EmbB基因突變c. 233A>G的存在，按照開放閱讀框進行翻譯，確定 氨基酸突變P. SD78G的存在。
[0015] EmbB基因 c. 233A>G突變的核苷酸和氨基酸序列如下：
EmbB基因 c. 233A>G突變的核苷酸和氨基酸序列中，用方框標出的是突變的堿基和氨 基酸，突變前第78位氨基酸是天冬酰胺，突變后為甘氨酸。該突變位于EmbB基因編碼序列 的第78位堿基，由野生型的腺嘌呤(A)變為鳥嘌呤（G)，該突變使野生型的EmbB蛋白的第 78位天冬酰胺突變成甘氨酸，導致EmbB蛋白的功能發生改變，進而引起乙胺丁醇的耐藥。 EmbB基因突變c. 233A>G的檢測能夠用遺傳領域的任意一種點突變檢測方法進行，如PCR (聚合酶鏈反應）-RFLP法(限制性內切酶片段多態性)、PCR-測序法、DNA