本(ben)(ben)發(fa)明(ming)屬于結核(he)病疫苗(miao)及免疫治療領域。本(ben)(ben)發(fa)明(ming)涉(she)及一種敲(qiao)除c-di-amp分(fen)(fen)解酶的重組(zu)恥垢分(fen)(fen)枝桿菌株。本(ben)(ben)發(fa)明(ming)還(huan)涉(she)及上述重組(zu)恥垢分(fen)(fen)枝桿菌株用于預防和/或治療結核(he)病的疫苗(miao)及制(zhi)劑中的應用。

背景技術：

結核病流行現狀

結核病(bing)(tuberculosis，tb)是全球范圍(wei)內嚴重危(wei)害(hai)(hai)人(ren)類(lei)健康(kang)的(de)(de)慢性傳染病(bing)。結核分枝桿(gan)菌(jun)(mycobacteriumtuberculosis，mtb)是tb的(de)(de)病(bing)原體，據who報(bao)告，2015年，全球估計新發病(bing)例(li)1040萬，新發病(bing)例(li)中有120萬(11％)hiv患者，共計140萬人(ren)死(si)于tb。tb在(zai)死(si)亡原因中仍排(pai)在(zai)前十位。印度(du)(du)、印度(du)(du)尼西亞、中國、尼日利亞、巴基斯坦和南非這六個國家占了新發病(bing)例(li)總(zong)數的(de)(de)60％。積極(ji)的(de)(de)tb防治研究(jiu)及措施在(zai)2000年至2015年避(bi)免了4900萬tb死(si)亡，但目前tb流行態(tai)勢和危(wei)害(hai)(hai)程度(du)(du)表明(ming)，在(zai)tb預(yu)防、診斷和治療方面的(de)(de)缺口還(huan)很大。

結核病防治現狀

卡介苗(miao)(bacilluscalmette-guérinvaccine，bcg)是目前(qian)用(yong)于(yu)(yu)結(jie)核病(bing)預防的(de)唯(wei)一(yi)疫(yi)苗(miao)。bcg主要(yao)作(zuo)為mtb感染(ran)(ran)前(qian)的(de)預防性疫(yi)苗(miao)，并針對mtb的(de)早期感染(ran)(ran)，不能(neng)預防和控(kong)制潛伏(fu)感染(ran)(ran)狀態mtb的(de)復發(fa)，但其存在著保(bao)護期短(duan)、保(bao)護性免(mian)疫(yi)應答不強等缺點，并且作(zuo)為一(yi)種(zhong)(zhong)減(jian)毒活疫(yi)苗(miao)，不能(neng)用(yong)于(yu)(yu)免(mian)疫(yi)低(di)下人群(qun)的(de)接種(zhong)(zhong)，因此研制開發(fa)安(an)全、可靠的(de)新型(xing)tb疫(yi)苗(miao)迫在眉睫。

在tb的治療方面，由于tb化療療程長達6個月以上，導致患者不能堅持服藥和依從性差，并往往引起耐藥，特別是出現廣泛結核耐藥和超級耐藥結核菌。隨著對mtb本質認識的逐步深入，已證實tb患者th1型細胞免疫反應較低，因此可提高機體免疫功能、尤其是th1型反應的治療性疫苗具有較好的應用前景。該類疫苗主要用于己感染mtb無癥狀攜帶者或是己發病的患者，選擇性地誘導人體的特異性和非特異性免疫應答，最終達到治療的目的(mi,etal.therapeuticvaccinesfortuberculosis--asystematicreview.vaccine.2014,32(26):3162-8)。目前正(zheng)在開發的tb新型疫(yi)苗(miao)主要包括亞單位(wei)疫(yi)苗(miao)、基因疫(yi)苗(miao)、重組(zu)bcg疫(yi)苗(miao)、減毒(du)或(huo)增強的全菌體活疫(yi)苗(miao)、營養缺陷型活疫(yi)苗(miao)、結合dc的疫(yi)苗(miao)等，但目前還沒有一種新型疫(yi)苗(miao)可以替(ti)代傳統的bcg或(huo)用(yong)于tb的免(mian)疫(yi)治(zhi)療。

重組分枝(zhi)桿菌疫苗的研究

將外(wai)源(yuan)性(xing)基因導入分枝桿(gan)(gan)菌(jun)構建成重組活疫苗是該領(ling)域研(yan)究重要方向(xiang)之一。bcg是研(yan)究較多的(de)分枝桿(gan)(gan)菌(jun)活疫苗載體，但存在生長緩慢(man)、轉化效率低、遺傳操作(zuo)復雜等問題，且bcg本身為減毒株，不能(neng)用于免疫低下人群(qun)接種。

恥垢分枝桿菌(mycobacteriumsmegmatis，ms)是一種生長快，轉化效率高的非致病菌分枝桿菌和強細胞免疫佐劑，具有與bcg相似的免疫學特性。如zhudy,etal.(recombinantm.smegmatisvaccinetargeteddeliveringil-12/glsintomacrophagescaninducespecificcellularimmunityagainstm.tuberculosisinbalb/cmice.vaccine,2007,25(4):638-648.)等構建了表達il12和gls融合基因的rms，該疫苗能夠刺激t淋巴細胞增殖，啟動th1細胞免疫應答，促使細胞因子分泌，提高機體對分枝桿菌的免疫清除。tulliusmv等(highextracellularlevelsofmycobacteriumtuberculosisglutaminesynthetaseandsuperoxidedismutaseinactivelygrowingculturesareduetohighexpressionandextracellularstabilityratherthantoaprotein-specificexportmechanism.immunolcellbiol.2003,87(7):209-215.)將mtb蛋白轉入ms表達，結果表明重組蛋白與天然蛋白的生化及免疫特性幾乎完全相同。另外，ms生長速度快，goldstonerm等(anewvectorandexpressionprotocolforfastandefficientrecombinantproteinexpressioninmycobacteriumsmegmatis.proteinexpressionandpurification,2008,57(1):81-87.)建立了在ms菌株中(zhong)可溶表(biao)達mtb蛋白(bai)的方法，其(qi)研究表(biao)明，ms表(biao)達外源(yuan)蛋白(bai)產(chan)量(liang)(liang)高(gao)且其(qi)產(chan)量(liang)(liang)為(wei)bcg的5～10倍。bashiri等用ms作為(wei)宿主(zhu)菌表(biao)達的重組蛋白(bai)，可用于結構和功能研究(bashirig,bakeren.productionofrecombinantproteinsinmycobacteriumsmegmatisforstructuralandfunctionalstudies.proteinsci.2015,24(1):1-10.)。因(yin)此，ms是分枝桿菌活(huo)疫(yi)苗的優良載體。

重組(zu)恥(chi)垢(gou)分(fen)(fen)(fen)枝桿(gan)(gan)菌(jun)(rms)活疫(yi)(yi)(yi)苗(miao)(miao)(miao)(miao)用(yong)于(yu)(yu)mtb感染的(de)(de)(de)治(zhi)(zhi)療(liao)(liao)，可以通過(guo)恢復(fu)保護性(xing)免(mian)(mian)(mian)疫(yi)(yi)(yi)，促進單(dan)核(he)巨噬(shi)(shi)細(xi)胞(bao)產(chan)生更多的(de)(de)(de)h2o2和(he)no，有(you)(you)效清(qing)除mtb，增強(qiang)機(ji)體免(mian)(mian)(mian)疫(yi)(yi)(yi)應答能力(徐(xu)(xu)苗(miao)(miao)(miao)(miao),等(deng).恥(chi)垢(gou)分(fen)(fen)(fen)枝桿(gan)(gan)菌(jun)疫(yi)(yi)(yi)苗(miao)(miao)(miao)(miao)對(dui)小鼠(shu)巨噬(shi)(shi)細(xi)胞(bao)產(chan)生一氧(yang)化氮(dan)的(de)(de)(de)影(ying)響(xiang).中(zhong)(zhong)國(guo)醫學(xue)(xue)科學(xue)(xue)院學(xue)(xue)報,2009,(4):410-412.)；還可改變(bian)免(mian)(mian)(mian)疫(yi)(yi)(yi)應答的(de)(de)(de)th1/th2模式，使(shi)(shi)免(mian)(mian)(mian)疫(yi)(yi)(yi)應答從th2型(xing)向(xiang)th1型(xing)偏移，從而有(you)(you)助于(yu)(yu)機(ji)體免(mian)(mian)(mian)疫(yi)(yi)(yi)細(xi)胞(bao)殺滅mtb持(chi)留菌(jun)和(he)耐藥(yao)菌(jun)，縮短化療(liao)(liao)療(liao)(liao)程(cheng)(徐(xu)(xu)苗(miao)(miao)(miao)(miao)等(deng).恥(chi)垢(gou)分(fen)(fen)(fen)枝桿(gan)(gan)菌(jun)疫(yi)(yi)(yi)苗(miao)(miao)(miao)(miao)對(dui)小鼠(shu)細(xi)胞(bao)因子產(chan)生及th1/th2應答的(de)(de)(de)影(ying)響(xiang).中(zhong)(zhong)華(hua)結核(he)和(he)呼吸雜志(zhi),2005,(11):49-52.)。ms為(wei)無(wu)毒(du)(du)的(de)(de)(de)分(fen)(fen)(fen)枝桿(gan)(gan)菌(jun)，許多實驗已證實其安(an)全性(xing)，國(guo)內徐(xu)(xu)苗(miao)(miao)(miao)(miao)、王國(guo)治(zhi)(zhi)等(deng)(無(wu)細(xi)胞(bao)恥(chi)垢(gou)分(fen)(fen)(fen)枝桿(gan)(gan)菌(jun)疫(yi)(yi)(yi)苗(miao)(miao)(miao)(miao)對(dui)豚鼠(shu)的(de)(de)(de)長(chang)(chang)期毒(du)(du)性(xing)研(yan)究.中(zhong)(zhong)國(guo)新藥(yao)雜志(zhi),2006,(19):1640-1643.)研(yan)究表明(ming)，長(chang)(chang)期使(shi)(shi)用(yong)無(wu)細(xi)胞(bao)ms疫(yi)(yi)(yi)苗(miao)(miao)(miao)(miao)對(dui)豚鼠(shu)無(wu)顯著(zhu)(zhu)毒(du)(du)性(xing)作(zuo)用(yong)，并且他們制備的(de)(de)(de)無(wu)細(xi)胞(bao)ms菌(jun)用(yong)于(yu)(yu)tb的(de)(de)(de)免(mian)(mian)(mian)疫(yi)(yi)(yi)治(zhi)(zhi)療(liao)(liao)，取得了比較好(hao)的(de)(de)(de)效果(恥(chi)垢(gou)分(fen)(fen)(fen)枝桿(gan)(gan)菌(jun)作(zuo)為(wei)免(mian)(mian)(mian)疫(yi)(yi)(yi)調(diao)節劑的(de)(de)(de)研(yan)究.中(zhong)(zhong)華(hua)微生物學(xue)(xue)和(he)免(mian)(mian)(mian)疫(yi)(yi)(yi)學(xue)(xue)雜志(zhi),2005,(9):752-755.)。因此(ci)，rms具有(you)(you)高效、安(an)全性(xing)好(hao)等(deng)顯著(zhu)(zhu)優勢，是(shi)tb新型(xing)預防和(he)治(zhi)(zhi)療(liao)(liao)性(xing)疫(yi)(yi)(yi)苗(miao)(miao)(miao)(miao)的(de)(de)(de)重要工(gong)具。

選擇合適的(de)靶(ba)抗原可顯著提高(gao)疫苗(miao)的(de)保護(hu)效(xiao)率。對于(yu)mtb保護(hu)性抗原的(de)研究已(yi)持續多年，主要有分泌蛋(dan)白(bai)如(ru)esat-6、cfp10、ag85、tb10.4、mtb39和(he)mtb32等(deng)，熱休克家(jia)族(zu)如(ru)hsp65、hsp70、hspx等(deng)，及融(rong)合蛋(dan)白(bai)mtb72f等(deng)抗原。但(dan)是(shi)，目(mu)前(qian)仍(reng)未獲得(de)可用(yong)于(yu)預防(fang)和(he)治(zhi)療的(de)重組疫苗(miao)，表明仍(reng)需(xu)廣(guang)泛篩選新的(de)mtb抗原，以獲得(de)免疫效(xiao)果更好的(de)重組分枝桿菌，用(yong)于(yu)tb的(de)防(fang)治(zhi)。

第二信號分子(zi)c-di-amp成為(wei)細菌(jun)性疫苗研究新靶點

2008年，新發現(xian)一種(zhong)細(xi)(xi)(xi)菌(jun)(jun)(jun)信號(hao)分子(zi)——環二腺苷(cyclicdi-adenosinemonophosphate，c-di-amp)(witte,g.,etal.structuralbiochemistryofabacterialcheckpointproteinrevealsdiadenylatecyclaseactivityregulatedbydnarecombinationintermediates.molcell,2008.30(2):167-78.)。c-di-amp參與(yu)金黃(huang)色葡萄球菌(jun)(jun)(jun)、鏈球菌(jun)(jun)(jun)、枯草芽胞桿菌(jun)(jun)(jun)、李斯特(te)假單(dan)胞菌(jun)(jun)(jun)等細(xi)(xi)(xi)菌(jun)(jun)(jun)的細(xi)(xi)(xi)胞壁合成(cheng)、壓力感應(ying)、生(sheng)物(wu)被膜(mo)形(xing)成(cheng)、離子(zi)代(dai)謝等多種(zhong)生(sheng)理過(guo)程(krastevapvetal.versatilemodesofcellularregulationviacyclicdinucleotides.natchembiol.2017,13(4):350-359)。研究表明，c-di-amp調節(jie)mtb菌(jun)(jun)(jun)體長度、細(xi)(xi)(xi)胞壁形(xing)成(cheng)、脂(zhi)代(dai)謝以及(ji)致病性。研究還表明，c-di-amp可直接激活sting，誘導宿主細(xi)(xi)(xi)胞i型干擾素釋放為特(te)征的固有(you)免(mian)疫(yi)應(ying)答(andradewa,etal.groupbstreptococcusdegradescyclic-di-amptomodulatesting-dependenttypeiinterferonproduction.cellhostmicrobe.2016,20(1):49-59.)，而且c-di-amp單(dan)獨或聯合抗(kang)原免(mian)疫(yi)，可調節(jie)th1/th2/th17適應(ying)性免(mian)疫(yi)應(ying)答，具(ju)有(you)顯著的免(mian)疫(yi)佐劑作(zuo)用(yong)(ebensen,t,etal.bis-(3',5')-cyclicdimericadenosinemonophosphate:strongth1/th2/th17promotingmucosaladjuvant.vaccine,2011,29(32):5210-20.)。c-di-amp僅存在于(yu)細(xi)(xi)(xi)菌(jun)(jun)(jun)中，而真核細(xi)(xi)(xi)胞中沒有(you)，因(yin)此c-di-amp成(cheng)為細(xi)(xi)(xi)菌(jun)(jun)(jun)性疫(yi)苗和藥(yao)物(wu)研究的新靶點。

c-di-amp由兩分(fen)子atp經(jing)二腺苷酸環化酶(diadenylatecyclasea，daca)催化合(he)成(cheng)。rv3586是mtb中合(he)成(cheng)c-di-amp的(de)(de)(de)(de)dac酶。junyang等(deletionofthecyclicdi-ampphosphodiesterasegene(cnpb)inmycobacteriumtuberculosisleadstoreducedvirulenceinamousemodelofinfection.2014,93(1):65-79.)研(yan)究證(zheng)明(ming)，含有(you)dhh結(jie)構域的(de)(de)(de)(de)rv2837c為mtb的(de)(de)(de)(de)c-di-amp降解(jie)酶，并將(jiang)其命名為cnpb。manikandank等(two-stepsynthesisandhydrolysisofcyclicdi-ampinmycobacteriumtuberculosis.plosone.201423；9(1):e86096.)發現(xian)rv2837c可先將(jiang)c-di-amp降解(jie)為papa，進(jin)(jin)一步降解(jie)為5'-amp。posticg等(characterizationofnrnahomologsfrommycobacteriumtuberculosisandmycoplasmapneumoniae.201218(1):155-65.)發現(xian)rv2837c具有(you)rna酶活(huo)(huo)性，推測其在(zai)細菌致病過(guo)程中具有(you)重要的(de)(de)(de)(de)調(diao)節作(zuo)用。junyang等進(jin)(jin)一步研(yan)究發現(xian)，rv2837c突(tu)變株c-di-amp水平升高，該(gai)(gai)突(tu)變株感染sting-/-缺(que)陷小鼠mφ，il-1β釋放顯著增(zeng)加。動(dong)物(wu)實驗(yan)表明(ming)，該(gai)(gai)菌株促進(jin)(jin)宿主免疫(yi)清(qing)(qing)除(chu)mtb，動(dong)物(wu)存活(huo)(huo)時間延長。deyrj等(inhibitionofinnateimmunecytosolicsurveillancebyanm.tuberculosisphosphodiesterase.natchembiol.2017,13(2):210-217.)研(yan)究發現(xian)，突(tu)變c-di-amp分(fen)解(jie)酶rv2837c可使(shi)mtb毒性降低，而(er)rv2837c抑制劑的(de)(de)(de)(de)使(shi)用，可通(tong)過(guo)胞漿(jiang)cgas-sting通(tong)路(lu)的(de)(de)(de)(de)激活(huo)(huo)，改變mtb感染的(de)(de)(de)(de)結(jie)局。綜上(shang)所述，含有(you)dhh結(jie)構域的(de)(de)(de)(de)rv2837c蛋(dan)白具有(you)降解(jie)c-di-amp的(de)(de)(de)(de)酶活(huo)(huo)性，在(zai)mtb中突(tu)變該(gai)(gai)酶，不僅使(shi)菌株毒力下降，還可使(shi)細菌c-di-amp水平顯著上(shang)升，分(fen)泌的(de)(de)(de)(de)c-di-amp可激活(huo)(huo)胞漿(jiang)sting通(tong)路(lu)介導的(de)(de)(de)(de)固有(you)免疫(yi)應答，最終(zhong)促進(jin)(jin)胞內菌的(de)(de)(de)(de)免疫(yi)清(qing)(qing)除(chu)，因此，還有(you)dhh結(jie)構域的(de)(de)(de)(de)c-di-amp降解(jie)酶成(cheng)為疫(yi)苗和(he)藥物(wu)研(yan)究的(de)(de)(de)(de)新靶點。

在ms中(zhong)，msmeg_2630編碼與rv2837c相(xiang)似的dhh結構域(yu)蛋(dan)白，兩者同源性為82％。msmeg_2630基因(yin)1023bp，編碼蛋(dan)白分子量約為35.5kda。國(guo)內華中(zhong)農業大(da)學tangq等(functionalanalysisofac-di-amp-specificphosphodiesterasemspdefrommycobacteriumsmegmatis.intjbiolsci.2015,11(7):813-24)采用sacb-lacz營養缺陷(xian)型(xing)篩選系(xi)統，構建了msmsmeg_2630基因(yin)突變(bian)(bian)株。表(biao)型(xing)研究表(biao)明，msmeg_2630具有(you)(you)與rv2837c相(xiang)似的磷酸二酯酶活性，可水(shui)(shui)解(jie)c-di-amp。敲(qiao)除(chu)(chu)msmeg_2630基因(yin)，ms菌株菌落(luo)形態、脂(zhi)代(dai)謝(xie)及離子代(dai)謝(xie)改變(bian)(bian)，并且菌株的c-di-amp水(shui)(shui)平(ping)顯(xian)著上升。因(yin)此，msmeg_2630是ms的c-di-amp降解(jie)酶，敲(qiao)除(chu)(chu)該基因(yin)，細菌產生c-di-amp水(shui)(shui)平(ping)顯(xian)著增加，該菌株免(mian)疫(yi)后，其分泌的c-di-amp將促進固有(you)(you)免(mian)疫(yi)應答，有(you)(you)利于宿主免(mian)疫(yi)清(qing)除(chu)(chu)胞內菌。

技術實現要素：

本發明的目的是獲得(de)一種敲除c-di-amp分解酶(mei)的重組(zu)恥垢分枝桿菌株。所述菌株可用于(yu)結核病預防和治療(liao)性疫苗的研制。

本(ben)發明是這樣實現的：

以ms的基因(yin)(yin)(yin)(yin)組(zu)為模板(ban)，pcr擴(kuo)增c-di-amp降解(jie)酶(mei)基因(yin)(yin)(yin)(yin)msmeg_2630的上下游同源臂，將其(qi)分(fen)別連入(ru)pmsg360載體，陽(yang)性克(ke)隆(long)質粒命(ming)(ming)名(ming)為pw75。制(zhi)備ms感受(shou)態(tai)細胞(bao)，轉(zhuan)化(hua)含有重組(zu)酶(mei)gp60和(he)gp61基因(yin)(yin)(yin)(yin)的pjv53質粒，陽(yang)性克(ke)隆(long)命(ming)(ming)名(ming)為ms-pjv53。制(zhi)備ms-pjv53菌(jun)株(zhu)感受(shou)態(tai)細胞(bao)，電(dian)轉(zhuan)化(hua)重組(zu)質粒pw75，博來霉素抗性平板(ban)篩選(xuan)陽(yang)性克(ke)隆(long)，pcr和(he)westren-blot鑒定目的基因(yin)(yin)(yin)(yin)敲除情(qing)況，陽(yang)性克(ke)隆(long)命(ming)(ming)名(ming)為敲除c-di-amp分(fen)解(jie)酶(mei)的重組(zu)恥垢(gou)分(fen)枝桿菌(jun)株(zhu)(rms-δcnpb)，已(yi)送中國典型培養(yang)物保藏(zang)中心保藏(zang)，其(qi)保藏(zang)編號為：cctccm2016336。

所述的(de)(de)重(zhong)組rms-δcnpb用(yong)于預防和治療結核病疫苗(miao)及制劑(ji)中的(de)(de)應用(yong)。

所述的菌株rms-δcnpb擴大培養后，取10⁷皮(pi)下免(mian)(mian)(mian)疫(yi)(yi)小(xiao)鼠，免(mian)(mian)(mian)間隔(ge)2周(zhou)，免(mian)(mian)(mian)疫(yi)(yi)2次，免(mian)(mian)(mian)疫(yi)(yi)完(wan)成后(hou)(hou)6周(zhou)，檢測體液免(mian)(mian)(mian)疫(yi)(yi)應(ying)(ying)答(da)(da)水(shui)(shui)(shui)(shui)(shui)(shui)平(ping)(ping)和(he)(he)(he)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)免(mian)(mian)(mian)疫(yi)(yi)應(ying)(ying)答(da)(da)水(shui)(shui)(shui)(shui)(shui)(shui)平(ping)(ping)(脾(pi)淋(lin)巴(ba)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)增殖、細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)因(yin)(yin)子(zi)(zi)轉錄和(he)(he)(he)分泌水(shui)(shui)(shui)(shui)(shui)(shui)平(ping)(ping))；免(mian)(mian)(mian)疫(yi)(yi)完(wan)成后(hou)(hou)6周(zhou)，以mtbh37ra株(zhu)攻擊感染(ran)免(mian)(mian)(mian)疫(yi)(yi)小(xiao)鼠，6周(zhou)后(hou)(hou)，檢測體液免(mian)(mian)(mian)疫(yi)(yi)應(ying)(ying)答(da)(da)水(shui)(shui)(shui)(shui)(shui)(shui)平(ping)(ping)和(he)(he)(he)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)免(mian)(mian)(mian)疫(yi)(yi)應(ying)(ying)答(da)(da)水(shui)(shui)(shui)(shui)(shui)(shui)平(ping)(ping)(脾(pi)淋(lin)巴(ba)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)增殖、細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)因(yin)(yin)子(zi)(zi)轉錄和(he)(he)(he)分泌水(shui)(shui)(shui)(shui)(shui)(shui)平(ping)(ping))，并計數(shu)主要臟器荷菌(jun)數(shu)。結(jie)果顯(xian)(xian)示，獲得(de)的(de)(de)(de)rms-δcnpb菌(jun)株(zhu)免(mian)(mian)(mian)疫(yi)(yi)小(xiao)鼠，可(ke)(ke)誘(you)導小(xiao)鼠體液免(mian)(mian)(mian)疫(yi)(yi)應(ying)(ying)答(da)(da)反應(ying)(ying)，但整(zheng)體水(shui)(shui)(shui)(shui)(shui)(shui)平(ping)(ping)不高；細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)免(mian)(mian)(mian)疫(yi)(yi)中(zhong)，可(ke)(ke)誘(you)導顯(xian)(xian)著(zhu)的(de)(de)(de)脾(pi)淋(lin)巴(ba)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)增殖，ifn-γ水(shui)(shui)(shui)(shui)(shui)(shui)平(ping)(ping)升高，但水(shui)(shui)(shui)(shui)(shui)(shui)平(ping)(ping)低于ms，而th2型(xing)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)因(yin)(yin)子(zi)(zi)il-10水(shui)(shui)(shui)(shui)(shui)(shui)平(ping)(ping)沒有(you)(you)(you)顯(xian)(xian)著(zhu)升高；以h37ra攻擊感染(ran)后(hou)(hou)，th1型(xing)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)因(yin)(yin)子(zi)(zi)ifn-γ和(he)(he)(he)il-2水(shui)(shui)(shui)(shui)(shui)(shui)平(ping)(ping)顯(xian)(xian)著(zhu)升高，而il-10水(shui)(shui)(shui)(shui)(shui)(shui)平(ping)(ping)仍保持在比較低的(de)(de)(de)水(shui)(shui)(shui)(shui)(shui)(shui)平(ping)(ping)，表明(ming)rms-δcnpb免(mian)(mian)(mian)疫(yi)(yi)后(hou)(hou)，可(ke)(ke)誘(you)導適度的(de)(de)(de)體液和(he)(he)(he)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)免(mian)(mian)(mian)疫(yi)(yi)應(ying)(ying)答(da)(da)，而感染(ran)后(hou)(hou)，細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)免(mian)(mian)(mian)疫(yi)(yi)應(ying)(ying)答(da)(da)水(shui)(shui)(shui)(shui)(shui)(shui)平(ping)(ping)迅速上(shang)升，尤其(qi)(qi)是th1型(xing)反應(ying)(ying)，有(you)(you)(you)助于宿主抗(kang)感染(ran)免(mian)(mian)(mian)疫(yi)(yi)。ms和(he)(he)(he)rms-δcnpb免(mian)(mian)(mian)疫(yi)(yi)，均可(ke)(ke)抵(di)抗(kang)一(yi)定(ding)量的(de)(de)(de)h37ra攻擊感染(ran)。rms-δcnpb菌(jun)株(zhu)和(he)(he)(he)ms菌(jun)株(zhu)均有(you)(you)(you)有(you)(you)(you)誘(you)導宿主免(mian)(mian)(mian)疫(yi)(yi)應(ying)(ying)答(da)(da)的(de)(de)(de)作用(yong)，rms-δcnpb菌(jun)株(zhu)單純免(mian)(mian)(mian)疫(yi)(yi)，誘(you)導ifn-γ水(shui)(shui)(shui)(shui)(shui)(shui)平(ping)(ping)不高，而感染(ran)后(hou)(hou)，其(qi)(qi)誘(you)導th1型(xing)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)因(yin)(yin)子(zi)(zi)顯(xian)(xian)著(zhu)升高，而il-10水(shui)(shui)(shui)(shui)(shui)(shui)平(ping)(ping)仍保持在比較低的(de)(de)(de)水(shui)(shui)(shui)(shui)(shui)(shui)平(ping)(ping)，表明(ming)對th1/th2反應(ying)(ying)的(de)(de)(de)調節(jie)顯(xian)(xian)著(zhu)優于ms，因(yin)(yin)而具(ju)有(you)(you)(you)比較好(hao)的(de)(de)(de)應(ying)(ying)用(yong)前景。

附圖說明

圖(tu)1：msmeg_2630上下游同(tong)源臂克隆(long)入pmsg360載體酶切鑒(jian)定結(jie)果圖(tu)。

圖2：rms-δcnpb重(zhong)組菌基因型鑒定pcr結(jie)果圖。

圖3：rms-δcnpb重組(zu)菌表型(xing)鑒(jian)定western-blot結果圖。

圖4：rms-δcnpb免疫小鼠(shu)血清抗體檢測結果圖。

圖5：rms-δcnpb免(mian)疫小鼠(shu)脾淋巴細胞增(zeng)殖結果圖。

圖(tu)6：rms-δcnpb免疫小鼠脾淋巴細胞因子轉錄水(shui)平rt-pcr檢測結果圖(tu)。

圖7：rms-δcnpb免疫小鼠脾(pi)淋(lin)巴細胞因子分泌水平elisa檢測結果圖。

圖8：rms-δcnpb免疫(yi)小(xiao)鼠h37ra感染后脾淋巴細胞因子(zi)分泌水(shui)平rt-pcr檢測結(jie)果圖。

圖9：rms-δcnpb免疫小(xiao)鼠h37ra感染(ran)后(hou)脾淋巴細(xi)胞(bao)因(yin)子分泌水平elisa檢測結果圖。

圖(tu)10：rms-δcnpb免疫小(xiao)鼠(shu)h37ra感染后臟器(qi)荷菌(jun)數結果圖(tu)。保(bao)藏證(zheng)明

分類命名

恥垢分枝(zhi)桿(gan)菌rms-δcnpb

拉丁文學名

mycobacteriumsmegmatisrms-δcnpb

保藏單位名稱

中國典型培養物保藏(zang)中心(xin)

地址：湖北省武漢市武昌區八一(yi)路珞珈山

保藏日期

2016年6月20日(ri)

保藏號

cctccm2016336

具體實施方式

msmeg_2630基(ji)因同源重(zhong)組敲除質粒的構建(jian)

根據msmc²155株的基(ji)因組(zu)msmeg_2630基(ji)因上下游序(xu)列設計引物(wu)：

由上海生工生物科技有限公司合成引物。以msmc²155株的基因組為模板，pcr擴增目的基因，反應參數：95℃預變性5min，95℃變性30s，57℃復性30s，72℃延伸30s，30個循環，末次循環后72℃延伸5min。1％瓊脂糖凝膠電泳分析表明，分別擴增出456bp和468bp目的條帶。凝膠回收試劑盒回收目的片段，分別酶切，先后與同樣酶切并回收的pmsg360質粒連接，并轉化e.colidh5α感受態細胞，用博萊霉素抗性平板篩選。挑取陽性克隆接種于lb液體培養基37℃振蕩培養過夜，試劑盒提取質粒dna，酶切鑒定陽性質粒進行序列測定(圖1)。序列測定結果顯示，與msmc²155株基因組(zu)msmeg_2630基因上、下游公布序(xu)列(lie)完全一致，表明成功(gong)構(gou)建msmeg_2630基因同(tong)源重組(zu)敲(qiao)除質粒，命名為pw75，該載體(ti)中插(cha)入的msmeg_2630基因上、下游序(xu)列(lie)分別(bie)如seqidno:1和no:2所示(shi)。

msmeg_2630基因敲除株(rms-δcnpb)的構(gou)建(jian)

ms感受態細胞制備

ms接(jie)種于(yu)3ml7h9培(pei)養基(ji)，37℃100rpm振蕩培(pei)養48h，按1:100的(de)比例轉接(jie)于(yu)50ml培(pei)養基(ji)，繼續培(pei)養至od600＝0.8～1.0，冰浴1h。預冷的(de)10％甘油溶液洗滌三(san)次，分(fen)裝(100μl/管)，-80℃保存。

構建(jian)含(han)有重組酶gp60和gp61的ms感(gan)受態(tai)細胞

在大(da)腸(chang)桿(gan)菌(jun)中(zhong)擴增pjv53，試(shi)劑盒純化質(zhi)粒(li)，冰上融化ms感受態細胞45μl，加入pjv53質(zhi)粒(li)5μl，混(hun)勻后冰上放(fang)置10min，將50μl混(hun)合(he)液移至0.1cm的電轉(zhuan)杯(bei)(biorad)中(zhong)，電轉(zhuan)化參數：1.25kv，25μf，1000ω，冰上放(fang)置10min，加入1ml7h9培養(yang)2h，涂布抗(kang)生素平板，37℃培養(yang)3-4d至菌(jun)落生成。pcr鑒定陽性克隆。命名為ms-pjv53。

構建msmeg_2630敲除株(rms-δcnpb)

按照上述(shu)方法(fa)(fa)制(zhi)備感(gan)受態(tai)細(xi)胞(bao)和電轉(zhuan)(zhuan)化方法(fa)(fa)，取ms-pjv53菌(jun)(jun)株制(zhi)備感(gan)受態(tai)細(xi)胞(bao)，電轉(zhuan)(zhuan)化pw75，博來霉素抗性(xing)平板篩選克(ke)(ke)隆(long)，挑(tiao)取克(ke)(ke)隆(long)pcr鑒定(ding)，以msmeg_2630引物(wu)擴增(zeng)，不能擴增(zeng)出目的(de)基因(yin)的(de)菌(jun)(jun)株為(wei)(wei)敲除(chu)(chu)株(圖(tu)2)，挑(tiao)取陽性(xing)克(ke)(ke)隆(long)于(yu)7h9培(pei)(pei)(pei)養基，37℃震(zhen)蕩培(pei)(pei)(pei)養3-4d，制(zhi)備菌(jun)(jun)體(ti)總蛋白(bai)樣品，12％sds-page電泳后，轉(zhuan)(zhuan)印到pvdf膜，以msmeg_2630蛋白(bai)免疫(yi)后的(de)多(duo)克(ke)(ke)隆(long)小(xiao)鼠血清為(wei)(wei)一抗，westren-blot鑒定(ding)結果顯示，rms株菌(jun)(jun)體(ti)蛋白(bai)36kda處(chu)目的(de)蛋白(bai)缺失(shi)，表明(ming)目的(de)基因(yin)成(cheng)功敲除(chu)(chu)(圖(tu)3)，陽性(xing)克(ke)(ke)隆(long)命(ming)名(ming)為(wei)(wei)敲除(chu)(chu)c-di-amp分解(jie)酶的(de)重組恥(chi)垢分枝桿菌(jun)(jun)株(rms-δcnpb)，已送中國典型培(pei)(pei)(pei)養物(wu)保(bao)藏中心(xin)保(bao)藏，其保(bao)藏編號為(wei)(wei)：cctccm2016336。

rms-δcnpb免疫小鼠應(ying)答水平檢(jian)測

實驗動物分組及免疫：取6周齡雌性balb/c小鼠隨機分為4組(n＝6)，正常對照組(naive)、未免疫組(un)、ms免疫組和rms-δcnpb免疫組。ms和rms組以10⁷cfu/只經腹股溝皮下免(mian)疫接種，間隔2周，免(mian)疫2次；免(mian)疫完成(cheng)后6w，處死小(xiao)鼠，檢測體液和(he)細胞免(mian)疫水平。

1、免(mian)疫(yi)小鼠體液免(mian)疫(yi)水平檢測

以(yi)ms菌體蛋白為抗原包被(bei)elisa板(ban)，間接法檢測(ce)(ce)各(ge)組(zu)免(mian)疫(yi)小鼠血清中(zhong)特異(yi)性抗體，結果表(biao)明，ms免(mian)疫(yi)組(zu)和(he)rms-δcnpb免(mian)疫(yi)組(zu)可(ke)檢測(ce)(ce)到較低(di)濃度的抗體(圖4)。

2、免疫小鼠細胞免疫水平檢測

(1)脾淋巴細胞增(zeng)殖

在小鼠免疫完成后6w，無菌分離各組小鼠脾淋巴細胞，96孔板每孔接種1×10⁵個細胞(bao)，加(jia)(jia)入(ru)終濃度為25mg/l的ms菌體蛋(dan)白刺激培(pei)養(yang)72h后，加(jia)(jia)入(ru)20μl/孔的mts(5mg/ml)，繼續培(pei)養(yang)4h，最后加(jia)(jia)入(ru)10％sds25μl/孔，測定a490值。結(jie)果(guo)(guo)用增殖指(zhi)數si表示：si＝a490(實驗組－空(kong)(kong)白對(dui)照(zhao))/a490(陰性對(dui)照(zhao)－空(kong)(kong)白對(dui)照(zhao))。結(jie)果(guo)(guo)顯示，以ms菌體蛋(dan)白為刺激蛋(dan)白，ms免疫(yi)組和rms-δcnpb免疫(yi)組si呈升高趨(qu)勢(p<0.05)，但兩組之間無(wu)顯著差異(p>0.05)(圖5)。

(2)脾淋(lin)巴細(xi)胞因子轉錄水平

免疫完成后6w，無菌取小(xiao)鼠脾組織(zhi)，試劑盒提取組織(zhi)總rna，qrt-pcr相對(dui)定量法檢(jian)測細胞(bao)因子轉錄(lu)水(shui)平(ping)，結果顯示(shi)：ms免疫組和rms-δcnpb免疫組ifn-γ、il-2和il-10轉錄(lu)水(shui)平(ping)均顯著(zhu)上升(p<0.001)，而兩組間無顯著(zhu)差異(p>0.05)(圖6)。

(3)脾淋巴細(xi)胞因子分泌水平

收集上(shang)述(shu)脾淋(lin)巴(ba)細胞(bao)刺(ci)激培(pei)養上(shang)清(qing)，elisa檢測(ce)上(shang)清(qing)中細胞(bao)因(yin)子ifn-γ、il-2和il-10的水(shui)平。結(jie)果顯示：ms免疫(yi)(yi)(yi)(yi)組和rms-δcnpb免疫(yi)(yi)(yi)(yi)組ifn-γ、il-2和il-10轉錄(lu)水(shui)平均顯著上(shang)升(p<0.001)，而(er)rms-δcnpb免疫(yi)(yi)(yi)(yi)組ifn-γ分泌水(shui)平顯著低(di)于(yu)ms組(p<0.05)，表明rms-δcnpb免疫(yi)(yi)(yi)(yi)可(ke)能調(diao)節宿主(zhu)細胞(bao)免疫(yi)(yi)(yi)(yi)，使(shi)其(qi)對(dui)ms免疫(yi)(yi)(yi)(yi)后ifn-γ反應水(shui)平下降(圖7)。

rms-δcnpb免疫小(xiao)鼠對h37ra感染的(de)保護作用

上述各組小鼠免疫完成后6w，以mtbh37ra10⁴cfu/只經尾靜(jing)脈攻擊感染免(mian)疫的小(xiao)鼠，感染后(hou)6w，處死(si)小(xiao)鼠，進行如下檢(jian)測。

1、免疫小鼠h37ra感染后脾淋巴細(xi)胞(bao)因子轉(zhuan)錄水平

無菌取(qu)小鼠肺、脾組(zu)(zu)織，試劑盒(he)提取(qu)組(zu)(zu)織總rna，qrt-pcr絕對(dui)定量(liang)法檢測脾淋巴細胞(bao)因子(zi)轉錄(lu)(lu)水平，結果顯示，ms免疫組(zu)(zu)和(he)rms-δcnpb免疫組(zu)(zu)ifn-γ、il-2和(he)il-10轉錄(lu)(lu)水平均顯著(zhu)上(shang)升，rms-δcnpb免疫組(zu)(zu)th1型細胞(bao)因子(zi)ifn-γ、il-2轉錄(lu)(lu)水平顯著(zhu)高于ms組(zu)(zu)(p<0.05，p<0.01)，而th2型細胞(bao)因子(zi)il-10轉錄(lu)(lu)水平與ms組(zu)(zu)相(xiang)當(p>0.05)(圖(tu)8)。

2、免疫(yi)小鼠h37ra感染后(hou)脾淋(lin)巴(ba)細胞因(yin)子分泌水(shui)平

同上(shang)方(fang)法分(fen)離小鼠脾淋巴細(xi)胞，抗原刺(ci)激并培養后，elisa法檢(jian)測細(xi)胞培養上(shang)清中的細(xi)胞因子水(shui)(shui)平，結果顯(xian)示(shi)，un組(zu)(zu)(zu)、ms免(mian)疫(yi)組(zu)(zu)(zu)和(he)rms-δcnpb免(mian)疫(yi)組(zu)(zu)(zu)ifn-γ、il-2分(fen)泌水(shui)(shui)平均顯(xian)著上(shang)升，rms-δcnpb免(mian)疫(yi)組(zu)(zu)(zu)ifn-γ、il-2分(fen)泌水(shui)(shui)平顯(xian)著高(gao)于(yu)ms免(mian)疫(yi)組(zu)(zu)(zu)(p<0.01，p<0.05)；各組(zu)(zu)(zu)il-10分(fen)泌水(shui)(shui)平均顯(xian)著上(shang)升，而rms-δcnpb免(mian)疫(yi)組(zu)(zu)(zu)il-10水(shui)(shui)平增高(gao)幅(fu)度顯(xian)著低于(yu)un組(zu)(zu)(zu)和(he)ms組(zu)(zu)(zu)(p<0.01，p<0.01)(圖9)。

3、免疫小鼠h37ra感(gan)染(ran)后(hou)主(zhu)要(yao)臟(zang)器荷菌數

感染(ran)6w后(hou)，無菌(jun)取脾、肺臟，加入5ml1640培(pei)養液(ye)，在200目篩(shai)網上充分研磨后(hou)，取100μl懸液(ye)倍比稀釋(shi)后(hou)，計數臟器(qi)荷(he)菌(jun)數。結果顯示，ms免疫(yi)(yi)組(zu)和rms-δcnpb免疫(yi)(yi)組(zu)小鼠均可(ke)有效抵抗mtbh37ra的感染(ran)(p<0.01，p<0.001)，ms免疫(yi)(yi)組(zu)和rms-δcnpb免疫(yi)(yi)組(zu)間不存在差異(p>0.05)(圖10)。

sequencelisting

<110>中國人(ren)民解放軍(jun)第(di)四(si)軍(jun)醫大學

<120>一種敲除c-di-amp分(fen)解酶的(de)重組恥垢分(fen)枝桿菌(jun)株及其應用

<160>2

<210>1

<211>456

<212>dna

<213>恥垢分枝(zhi)桿菌（mycobacteriumsmegmatis）

<400>1

gatatcggccatcgagtacgagatcaaggatccgcgcctggcgggcgtgacgatcaccga60

cgcgaaggtgtccggggatctgcacgacgccacgctgtactacaccgtgctgggggcttc120

gctcgacgaggacccggattacgagggtgcggcagcggcgctggagaaggccaaaggtgt180

gctgcgcaccaaggtgggcgccgggaccggggtgaggttcaccccgaccctggcgttcgt240

ccgggacaccgtgcccgacgcggcgcaccggatggaggagctgctggcacgggcgcgggc300

cgcggacgaggatctggcgagagttcgggagggcgccaagcacgcaggcgatcccgaccc360

gtaccgtgttggcggggcggaggacacagacggggataccgacggggacgaacgctgagg420

atgccggtgacgacaaccgatcccaagaccaagctt456

<210>2

<211>468

<212>dna

<213>恥垢分枝桿菌（mycobacteriumsmegmatis）

<400>2

tctagagcgggatactccgcgaccggttcggccgacgacgtcgtacaggcgctcgcacgg60

gcccttggctgatgcggcgggcgacctgcccggcggtcccgacgacgacgcccagggcgc120

cgcactgacgcaggcgacgggccggcgcatcgccaaactcgcgtttcccgcgctcggcgt180

ccttgccgcagaacccatctacctgcttttcgacctcgcgatcgtcgggcgcctcggcgc240

ggtgagcctcgccggcctggcgatcggcgggctggtcctcggactcgtcaactcccaggg300

cacgttcctgtcctacggcaccacggcccgctcggcgcggttctacggggcgggggaccg360

gacctcggcggtggccgagggtgtgcaggccacctggctcgcgctcggtctcggactgct420

gatcatcgccgtggtggaagccgttgcggtgccgatgctttcggtacc468