一種新型的結核分枝桿菌胞外核酸酶及其用圖
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種胞外核酸酶及其用途，特別涉及一種新型的結核分枝桿菌胞外核 酸酶及其用途，本發明屬于生物技術領域。
【背景技術】
[0002] 許多種細菌能產生胞外核酸酶，胞外核酸酶對于細菌的毒力、生物被膜的形成、利 用胞外DNA獲取營養和降解胞外誘捕網（NETs)中的DNA中起著重要作用。比如希瓦氏 菌、沙雷氏菌、金黃色葡萄球菌的胞外核酸酶能夠降解胞外的DNA以獲取其基本的營養成 分-磷源，碳源和氮源。Seper的最近研究表明野生型的霍亂弧菌能通過其本身的兩種胞外 核酸酶（Dns和Xds)降解NETs中的DNA成分。金黃色葡萄球菌的胞外核酸酶也能降解NETs， 進而引發半胱天冬酶-3介導的免疫細胞死亡。然而無乳鏈球菌的胞外核酸酶（Gbs0661) 能夠攻擊NETs并且是細菌毒力所必須的。（NETs-中性粒細胞胞外誘捕網是宿主的防御反 應中一個重要組成部分，能夠固定微生物隨后并清楚）。在葡萄糖缺乏的培養基中，枯草芽 孢桿菌168的孢子形成階段釋放的脫氧核糖核酸酶（NucB)能夠降解生物被膜的重要核酸 為自身利用。
[0003] 結核分枝桿菌（M.tuberculosis)是革蘭氏陽性細菌，是引起結核病的病原菌。結 核病一直是世界上死亡率最高的疾病之一。2013年，大約有900萬人感染結核病，約有150 萬人死于這種疾病，其中36萬人是HIV陽性。結核分枝桿菌進入肺之后，被巨噬細胞和樹 突狀細胞所吞噬，然而結核分枝桿菌能夠在這些免疫細胞中擴散，甚至逃脫這些吞噬體迀 移到淋巴結而擴散感染。
[0004] 革蘭氏陽性細菌的胞外核酸酶在細菌的毒力和降解胞外誘捕網（中性粒細胞或 者巨噬細胞釋放）的DNA方面起著非常重要的作用。之前有關胞外核酸酶的研究主要集中 在無乳鏈球菌，化膿性鏈球菌和金黃色葡萄球菌。雖然之前報道描述過結核分枝桿菌胞內 核酸酶，但是至今沒有數據顯示結核分枝桿菌存在胞外核酸酶。在次，本發明首次發現并證 實Rv0888蛋白是結核分枝桿菌的胞外核酸酶。

【發明內容】

[0005] 本發明的目的之一在于提供一種新型的結核分枝桿菌胞外核酸酶及其用途。
[0006] 本發明的目的之二在于提供一種能夠抑制所述結核分枝桿菌胞外核酸酶的抑制 劑。
[0007] 為了達到上述目的，本發明采用了以下技術手段：
[0008] 在本發明中，我們證實了Rv0888蛋白是第一個來自于結核分枝桿菌的胞外核酸 酶，屬于endonuclease/exonuclease/phosphatase家族（PfamfamilyPF03372)，在結核分 枝桿菌的培養濾液中能檢測到鞘磷脂酶的活性。進一步的，本發明還證明了該胞外核酸酶 在降解不同類型的核酸（基因組DNA，雙鏈PCR產物，質粒DNA和面包酵母RNA)方面具有高 度的活性，Rv〇888發揮其核酸酶活性需要二價離子的輔助（Ca2+和Mn2+)。另外四種中藥單 體（6-姜酚，類葉升麻苷，橄欖苦苷，補骨脂乙素）能夠抑制Rv0888的核酸酶活性。
[0009] 在此基礎上，本發明提出了一種新型的結核分枝桿菌胞外核酸酶，命名為Rv0888， 其氨基酸序列如SEQIDN0. 1、SEQIDN0. 3或SEQIDN0. 5所示。
[0010] 進一步的，本發明還提出了編碼所述的結核分枝桿菌胞外核酸酶的核苷酸序列。 優選的，所述的核苷酸序列如SEQIDN0. 2、SEQIDN0. 4或SEQIDN0. 6所示。
[0011] 含有所述的核苷酸序列的表達載體以及含有該表達載體的宿主細胞也自然落在 本發明的保護范圍之內。
[0012] 再進一步的，本發明還提出了所述的結核分枝桿菌胞外核酸酶在降解核酸中的用 途。
[0013] 其中，優選的，所述的核酸包括線性雙鏈DNA，環狀質粒DNA，染色體DNA或者RNA。
[0014] 更進一步的，本發明提出了橄欖苦苷，6-姜酚，補骨脂乙素或類葉升麻苷在抑制所 述的結核分枝桿菌胞外核酸酶中的用途。
[0015]Rv0888核酸酶活性顯示在33°C-51°C的溫度范圍內，最佳的溫度是41°C。這個溫 度與人和動物在感染結核分枝桿菌后體溫升高是一致的，表明Rv〇888也許與結核分枝桿 菌的毒力有關。與其他的脫氧核糖酸酶/核酸酶相似，Rv〇888核酸酶發揮活性也需要二價 離子。最佳的二價離子是Mn2+以及Ca2+，其他的二價離子（Mg2+，Ba2+，Ni2+)也有不同程度的 促進作用（表1)。這些結果表明與之前報道的大腸桿菌核酸酶一樣，Rv〇888的催化活性位 點與二價離子的直徑沒有關系，而是這些離子結合在不同的氨基酸維持其活性。金屬螯合 劑EDTA對Rv0888的活性起著很強的抑制效果，表明金屬離子對于核酸活性是必須的，并且 在酶結構穩定性方面起著非常重要的作用。
[0016] 氨基酸置換研究表明D438位氨基酸在Rv0888核酸酶活性方面起著關鍵的作用， H353和D387在Rv0888活性方面也起著比較積極的作用。與其他的含有保守基序的DRGH 的肺炎鏈球菌胞外核酸酶EndA22和DKGH的無乳鏈球菌的胞外核酸酶Gbs06616相比，這些 重要的氨基酸殘基與他們是不同的。Rv〇888蛋白與其他已知的核酸酶沒有任何同源性（圖 9)，因此我們的數據表明Rv0888是一個非特異性核酸酶家族成員之一。
[0017]由于肺結核與HIV共感染和新出現的無法治療的或者廣泛耐藥的結核分枝桿菌， 使得肺結核很難控制。迫切需要研發新的藥物和更有效的疫苗。因此需要在遺傳基礎上理 解結核分枝桿菌的毒力和致病性。有趣的是四種中藥單體（橄欖苦苷，類葉升麻苷，6-姜 酚，補骨脂乙素）能夠抑制Rv〇888活性。之前有關抑制劑的研究主要集中在小分子抑制 劑，主要是蛋白和病原體生物合成相關的因子：例如，結構同源物ML141阻止金黃色葡萄球 菌進入內皮細胞；半胱氨酸蛋白酶抑制劑K11777阻塞冠狀病毒和線狀病毒進入宿主細胞； 在金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的ItaS表達過程中，化合物1771能阻塞磷脂酰甘油-LtaS 的結合和抑制LTA的合成；使用BAS00127538抑制鮑曼不動桿菌LipidII( -個細胞壁生 物合成的前體）通過。隨后的藥物研究轉移到細胞壁蛋白和蛋白酶上：分選酶抑制劑能夠 用于治療醫院內感染的金黃色葡萄球菌的感染而沒有標準抗生素的副作用；結核分枝桿菌 磷脂酶/硫酯酶（Rv3802c)抑制劑奧利司他；通過有機催化獲得的肺結核的一個毒力因子 mPTPB的抑制劑；六種小分子被證實能夠抑制肺炎鏈球菌表面核酸酶EndA31 ;重要的是，我 們首次報道了中藥單體能有效的抑制細菌的核酸酶。現在對于廣泛耐藥的病原體，新藥研 究逐漸轉向中藥。因此驗證新的毒力因子并且篩選中藥抑制劑，也許有利于我們發現新的 治療結核病的藥物。
[0018] 體內感染試驗表明重組恥垢分支桿菌Rv0888NS/MS和Rv0888S/MS在小鼠感染17d 時繼續在肺中持留，組織病理學分析顯示感染7d時小鼠的肺有明顯的病理變化，這就意味 著Rv0888也許是結核分枝桿菌的一個毒力因子，可能與結核分枝桿菌在宿主肺中的持留 有關。之前研究已經報道了不同細菌核酸酶在細菌中定位：化膿性鏈球菌分泌到培養上清， 肺炎鏈球菌的核酸酶定位在膜上和化膿性鏈球菌，豬鏈球菌定位在肽聚糖上。結核分枝桿 菌Rv0888含有信號肽并且能分泌到培養液中。這種分泌的形式比定位在膜上的核酸酶-像 肺炎鏈球菌EndA-對于結核分枝桿菌的致病性更有效，因為它們更容易接近它們的底物。 在這項研究中Rv〇888核酸酶的特性使我們更容易理解結核分枝桿菌的致病性并且也許對 于我們獲得新的治療結核病的藥物具有幫助作用。
【附圖說明】
[0019] 圖1為重組Rv0888蛋白純化和質譜驗證；
[0020] (A)Rv0888 蛋白親和純化的SDS-PAGE分析 20mMTris-HCl-150mMNaCl-10 % glycerol含有濃度梯度的咪唑洗脫Rv0888蛋白。l:500mM咪唑；2:200mM咪唑；3:100mM咪 唑；4:80mM咪唑；5:70mM咪唑；6:60mM咪唑；7:40mM咪唑；8:20mM咪唑；M:蛋白分子質量 Marker。（B)離子交換層析純化Rv0888蛋白。（C)凝膠過濾層析純化Rv0888蛋白。（D) Rv0888蛋白通過基質輔助的激光解析離子分行時間質譜肽質量指紋圖譜。與Rv0888蛋白 匹配一致的序列框內顯示。
[0021 ] 圖2為純化的Rv0888蛋白消化不同的核酸；
[0022] 反應條件為：20mMTris-HClpH7. 5and5mMMgC1237°C孵育 1 小時。（A)純化的 Rv0888 蛋白消化不同DNAJzDLSOOODNAMarker;l:染色體DNA與 20mMTris-HCl(pH7.5); 2:染色體DNA和純化的Rv0888 ;3:環狀質粒DNA與20mMTris-HCl(pH7. 5) ;4:環狀質粒 DNA與純化的Rv0888 ;5:線性雙