鑒別結核分枝桿菌與非結核分枝桿菌感染的檢測方法
【專利摘要】本發明公開了一種鑒別結核分枝桿菌與非結核分枝桿菌感染的檢測方法，包括以下步驟：利用結核分枝桿菌特異性的抗原和分枝桿菌屬特異性抗原分別與待測的離體T細胞接觸，并檢測該T細胞釋放的細胞因子；將所述結核分枝桿菌特異性的抗原和分枝桿菌屬特異性抗原檢測結果進行比較，根據比較結果判斷所述待測的離體T細胞為結核分枝桿菌感染或非結核分枝桿菌感染。本發明的方法，利用分枝桿菌屬特異性抗原，結合MTB特異性的檢測的ELISPOT檢測法，可以同時鑒定MTB和NTM感染。對醫生的臨床診斷及用藥具有重要的指導意義。
【專利說明】
鑒別結核分枝桿菌與非結核分枝桿菌感染的檢測方法
技術領域
[0001] 本發明屬于生物醫學檢驗領域，涉及細胞免疫學檢驗方法，具體地說，涉及一種鑒 別結核分枝桿菌與非結核分枝桿菌感染的檢測方法。
【背景技術】
[0002] 結核病（tuberculosisJB)是全世界范圍內最普遍的慢性傳染性疾病之一，主要 由結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,ΜΤΒ)感染引起，此外其它分枝桿菌尤其是 非結核分枝桿菌(nontuberculosis mycobacteria,ΝΤΜ)感染所致大約占臨床病例的5%~ 15 %，后者在艾滋病合并結核時比例更高。據統計，全球大約有1/3人口感染了Mtb，其中5% ~10%的感染者為結核病患者，每年約有800萬~900萬新發活動性肺結核病例，200萬~ 300萬因結核病而死亡。
[0003]非結核分枝桿菌(NTM)是分支桿菌屬內除MTB和麻風分支桿菌以外的其他結核分 支桿菌。迄今共發現154中NTM和13個亞種，僅少部分對人體治病。引起NTM病的常見菌種為 鳥一胞內分枝桿菌復合體(Mycobacterium avium complex或Mycobacterium avium-intracellulare complex，MAC)，感染患者多見慢性呼吸系統癥狀，與肺結核相同，其臨床 表現容易與MTB感染引起的肺結核病混淆，不易鑒別。而大多數NTM對常用的抗MTB藥物均耐 藥，為此，在臨床中結核病治療前，對MTB和NTM感染的區分和鑒定十分重要。傳統方法鑒別 NTM時，需要使用分離培養基培養出分枝桿菌菌株后，再利用分子生物學的方法進行鑒定， 這樣的方法耗時長，且對檢測器材要求較高，不利于臨床使用。
[0004]因此，我們缺乏一種可以快速診斷MTB或NTM感染引起的結核病的有效方法。
[0005] 此外，MTB感染率很高，發病率相對較低，但結核潛伏感染（latent tuberculosis infecti〇n，LTBI)者在機體免疫功能降低或其他情況下可轉變為結核病患者，且在很大程 度上與活動性結核病患者一起成為結核病危險的傳染源。LTBI是結核菌感染后的一種亞臨 床狀態，無臨床癥狀、細菌學及放射檢查常陰性、結核菌素皮膚試驗（tuberculin skin test，TST)即純蛋白衍生物(purified protein derivative，PPD)試驗可呈現陽性。但由于 PH)試驗不能鑒別自然感染與卡介苗(BCG)接種，其結果可導致MTB感染率調查結果偏高，因 此迫切需要研究開發更為特異、可靠的檢測方法和試劑。
[0006]酶聯免疫斑點測定（enzyme linked immunospot assay，ELISP0T)是近年新建立 的一種細胞免疫學檢測方法，其基本原理是在ELISA方法基礎上建立，可在體外檢測抗原 (多肽)特異性免疫細胞釋放細胞因子(如γ -干擾素等），是一種基于抗原特異性細胞免疫 反應的新型免疫檢測技術，已被證明在結核(包括菌陽與菌陰肺結核、肺外結核)診斷、LTBI 檢測、治療效果監測等方面有潛在的應用價值。有研究顯示該技術不受BCG接種影響，與PPD 試驗相比具有更高的特異性、能顯著提高艾滋病合并結核的檢測率。目前，在國外，基于 ELI SPOT原理、商業化的 T-SP0T · TB( Oxford Immunotec，Abingdon，UK)，基于ELISA原理的 QuantiFERONTBlGold(QFT-G)與QuantiFERON-TBIGold In-tube(QFT-IT)(Cellestis， Carnegie,Victoria,Australia)的結核γ干擾素釋放試驗已被多個國家批準使用，在許多 歐美國家已被列入LTBI和結核接觸者檢測指南中；但由于價格較貴而限制了在我國廣泛使 用，且有數據顯示對中國人群的檢測有相對較低的敏感性，有研究提示這可能與人群對不 同多肽片段的反應表現出一定的種族差異有關；同時，我國研究的幾款ELISPOT試劑中的結 核多肽多數不是自主研發的。此外，上述所有試劑都是針對MTB感染檢測，尚無MTB與NTM感 染同時并鑒別檢測的ELISPOT報道。

【發明內容】

[0007] 為了克服現有技術存在的問題，本發明提供一種鑒別結核分枝桿菌與非結核分枝 桿菌感染的檢測方法。
[0008] 本發明所采用的技術方案為：
[0009] 鑒別結核分枝桿菌與非結核分枝桿菌感染的檢測方法，包括以下步驟：
[0010] 利用結核分枝桿菌特異性的抗原和分枝桿菌屬特異性抗原分別與待測的離體T細 胞接觸，并檢測該T細胞釋放的細胞因子；
[0011]將所述結核分枝桿菌特異性的抗原和分枝桿菌屬特異性抗原檢測結果進行比較， 根據比較結果判斷所述待測的離體T細胞為結核分枝桿菌感染或非結核分枝桿菌感染。
[0012] 進一步地，如果所述結核分枝桿菌特異性的抗原和分枝桿菌屬特異性抗原檢測均 呈陽性，則所述待測的離體T細胞為結核分枝桿菌感染;如果如果所述結核分枝桿菌特異性 的抗原檢測結果呈陰性而所述分枝桿菌屬特異性抗原檢測結果呈陽性，則所述待測的離體 T細胞為非結核分枝桿菌感染。
[0013] 進一步地，所述結核分枝桿菌特異性的抗原包括多肽E6、E7、C14中的一種或幾種。 [0014] 進一步地，所述檢測方法利用ELISA、ELISP0T、細胞內細胞因子染色、四聚體染色、 Immunoblotting、T細胞增殖實驗中的一種或幾種方法，檢測所述T細胞釋放的細胞因子。
[0015]進一步地，所述檢測方法利用IFN-MA體為識別工具，檢測所述T細胞釋放的細胞 因子。
[0016]進一步地，所述T細胞來源于血液、肺泡灌洗液、胸水、腦脊液、淋巴結。
[0017]本發明的有益效果為：
[0018]本發明的方法，利用分枝桿菌屬特異性抗原，結合MTB特異性的檢測的ELISPOT檢 測法，可以同時鑒定MTB和NTM感染，對醫生的臨床診斷及用藥具有重要的指導意義。
[0019] 為了更好地理解和實施，下面結合附圖詳細說明本發明。
【附圖說明】
[0020] 圖1為本發明的鑒別結核分枝桿菌與非結核分枝桿菌感染的試劑盒檢測孔及對照 孔設置、結果示意圖，其中，檢測1設置MTB特異性E6+E7+C14混合多肽;檢測2設置分枝桿菌 屬特異性混合多肽;對照1:為陽性(PMA+Inomycin)對照;對照2:陰性對照;T1和T2分別為平 行對照的T-SP0T.TB。
【具體實施方式】
[0021] 【實施例1】本實施例包括一種鑒別結核分枝桿菌與非結核分枝桿菌感染的試劑盒
[0022] 請參照圖1，本試劑盒包括檢測孔、對照孔和平行對照孔，其中的檢測試劑設置為：
[0023] 檢測1 :MTB特異性E6+E7+C14混合多肽
[0024] 檢測2:分枝桿菌屬特異性混合多肽；
[0025] 對照 1:陽性對照:PMA+Inomycin);
[0026] 對照2:陰性對照:不加多肽；
[0027] T1和T2分別為平行對照的T-SP0T.TB檢測。
[0028] 檢測步驟如下：
[0029] 1結核病人分離單核細胞(PBMC)分離用Ficoll淋巴細胞分離液分離PBMCJBMC重 懸于R10培養液(RPMI1640培養液中含10 %小牛血清)備用。
[0030] 2ELISP0T分析選擇帶PVDF膜96孔板作為反應板，用抗人γ -干擾素（IFNy )單克隆 抗體(mAb)包被過夜，第二天加入5X105PBMC和相應檢測試劑。第三天，依次加入生物素標 記抗人IFNymAb，鏈霉親合素-堿性磷酸酶作反應，BCIP/NBT顯色。結果在ELISPOT Reader 上讀取。以3?(：(3?(^矸〇^1丨即〇6118)/1〇￥81050作為判斷為陽性。
[0031] 結果判斷：
[0032] 1)檢測 1( + )、檢測 2( + ):MTB 感染；
[0033] 2)檢測 1(_)、檢測 2( + ):NTM 感染；
[0034] 3)檢測1(-)、檢測2(-):無分枝桿菌感染。
[0035]【實施例2】檢測結果
[0036]實驗室進行小量肺結核患者(共273例，包括有菌種鑒定結果92例和僅痰涂陽性85 例合計菌陽患者187例，以及痰涂與痰培養均陰性的菌陰患者86例）外周血試驗檢測，結果 如表1和表2所不。
[0037] 表1 85例MTB與7例NTM感染性菌陽肺結核患者外周血ELISP0T檢測結果
[0038]
[0039]表2 95例痰涂陽性(菌陽）肺結核與86例菌陰肺結核患者外周血ELISP0T檢測結果
[0040]
[0041] 以上結果提示，無論是菌陽還是菌陰肺結核均有一些比例的NTM感染所致。因此， 無論是結核病（菌陽與菌陰肺結核、肺外結核等）患者，還是LTBI者，若用常規的ELISP0T試 劑盒檢測，可能會丟失、降低一部分感染檢測的陽性率;而本發明或許在一定程度上可以彌 補這方面的不足。
[0042]本發明并不局限于上述實施方式，如果對本發明的各種改動或變形不脫離本發明 的精神和范圍，倘若這些改動和變形屬于本發明的權利要求和等同技術范圍之內，則本發 明也意圖包含這些改動和變形。
【主權項】
1. 鑒別結核分枝桿菌與非結核分枝桿菌感染的檢測方法，包括以下步驟： 利用結核分枝桿菌特異性的抗原和分枝桿菌屬特異性抗原分別與待測的離體T細胞接 觸， 并檢測該離體T細胞釋放的細胞因子； 將所述結核分枝桿菌特異性的抗原和分枝桿菌屬特異性抗原檢測結果進行比較，根據 比較結果判斷所述待測的離體T細胞為結核分枝桿菌感染或非結核分枝桿菌感染。2. 根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，如果所述結核分枝桿菌特異性的抗原 和分枝桿菌屬特異性抗原檢測均呈陽性，則所述待測的離體T細胞為結核分枝桿菌感染;如 果如果所述結核分枝桿菌特異性的抗原檢測結果呈陰性而所述分枝桿菌屬特異性抗原檢 測結果呈陽性，則所述待測的離體T細胞為非結核分枝桿菌感染。3. 根據權利要求2所述的檢測方法，其特征在于，所述結核分枝桿菌特異性的抗原包括 多肽E6、E7、C14中的一種或幾種。4. 根據權利要求3所述的檢測方法，其特征在于，利用ELISA、ELISPOT、細胞內細胞因子 染色、四聚體染色、Immunoblotting、T細胞增殖實驗中的一種或幾種方法，檢測所述T細胞 釋放的細胞因子。5. 根據權利要求3所述的檢測方法，其特征在于，利用IFN-γ抗體為識別工具，檢測所 述T細胞釋放的細胞因子。6. 根據權利要求1-5所述的檢測方法，所述T細胞來源于血液、肺泡灌洗液、胸水、腦脊 液、淋巴結。
【文檔編號】G01N33/569GK105866406SQ201610211708
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年4月6日
【發明人】賴小敏, 李有生
【申請人】廣州瑞輝生物科技股份有限公司