T細胞表位肽p4及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于免疫學技術領域，特別涉及結核分枝桿菌特異性CD4+T細胞表位肽及其應用。
【背景技術】
[0002]結核病是由結核分枝桿菌感染后誘發、全球感染率最高的傳染病，病死率僅次于艾滋病。僅2012年，全球新發結核病患者達860萬，死亡130萬。結核病疫情的新特點在于:耐藥結核病例出現并呈蔓延之勢;結核與艾滋病共感染情況愈演愈烈。針對這兩類患者，目前并無有效的防治措施。中國是世界上結核病負擔最重的國家之一，研發適合中國人群的結核病疫苗和治療藥物已時不我待。
[0003]結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)是胞內寄生菌，對其有效控制主要依賴于細胞免疫，尤其是T細胞免疫。人體內T細胞主要分為CD4+T(Th)細胞和CD8+T(CTL)細胞兩大亞群，大量研究已經證明，這兩種T細胞亞群對于控制結核菌感染都具有重要作用。CD4+T細胞被認為是人類抗結核感染的最重要的媒介。人類主要組織相容性抗原MHCII能夠遞呈將結核分枝桿菌肽表位，進而激活⑶4+T細胞，并且主要為Thl型⑶4+T細胞，后者繼而分泌IFN-γ、TNF-a和IL-2等細胞因子，加強抗原遞呈細胞和CD8+T細胞的活性，促進其對結核分枝桿菌的清除。
[0004]T細胞無法識別完整的結核菌和蛋白抗原，而是識別經過抗原遞呈細胞攝取和加工后釋放出的結核表位肽。表位肽是抗原中引起免疫應答的核心部份，也稱為抗原決定簇，它與抗原遞呈細胞表面的HLA分子結合形成肽-HLA復合物并被遞送和表達在抗原遞呈細胞表面，進而活化T細胞，誘發T細胞免疫反應。CD4+T細胞識別HLA 11類分子遞呈的表位肽，而CD8+T細胞識別HLA I類分子遞呈的表位肽。T細胞對表位肽的識別及其活化要求表位肽與抗原遞呈細胞表面HLA分子穩定結合，而肽與HLA分子的親和力是形成肽-HLA復合物的關鍵，因此制備誘發T細胞免疫的治療藥物和疫苗，首要步驟是篩選出高親和力的肽，進而鑒定出具有免疫活性的表位肽。
[0005]表位肽可以完全通過人工合成獲得，研發周期短；由于剔除了表位肽以外病原體其他有害成分，安全性良好;還可以將多個表位肽串聯使用，加強免疫效果和減少免疫逃逸。目前已知的結核菌表位肽主要是在歐美人群中鑒定，多為HLA-A*0201限制性，而對于結核病流行最嚴重的非洲和東南亞人群，并沒有合適的表位肽可使用。在中國，HLA-DRB1*09:01是人群中基因頻率最高的HLA分子，鑒定HLA-DRBI *09:01限制性Th I表位對于研發適合中國人群的表位肽疫苗具有非常重要的意義。
【發明內容】
[0006]本發明的目的在于提供一種結核分枝桿菌特異性CD4+T細胞表位肽。
[0007]本發明的另一目的在于提供該結核分枝桿菌特異性CD4+T細胞表位肽在制備結核病疫苗、診斷試劑和治療藥物中的應用。
[0008]本發明所采取的技術方案是:
一種結核分枝桿菌特異性CD4+T細胞表位肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0009]上述表位肽在制備結核病疫苗中的應用。
[0010]上述表位肽在制備結核病診斷試劑盒中的應用。
[0011 ]上述表位肽在制備治療結核病藥物中的應用。
[0012]本發明的有益效果是:
本發明提供了與HLA-DRB1*09:01分子親和力高，能活化CD4+T細胞、誘導其增殖和分泌IFN- γ的結核分枝桿菌特異性CD4+T細胞表位肽Ρ4。
[0013]本發明綜合利用生物信息學、免疫信息學的技術手段，利用結核分枝桿菌自身的抗原篩選出具有抗結核活性的表位肽，其中篩選出的表位肽Ρ4與HLA-DRB409:01分子之間具有高親和力。該表位肽是新的、未被報道過的HLA-DRB1*09:01限制性結核分枝桿菌表位肽，可被結核病人CD4+T細胞廣泛識別。由于HLA-DRB 1*09:01基因型是中國人中廣泛攜帶的基因型之一，目前并未發現結核分枝桿菌特異的HLA-DRB1*09:01限制性Thl表位肽，本發明表位肽P4的確定，為結核病疫苗、診斷試劑和治療藥物的研發提供了理論基礎和新的解決方案，對結核病的防治具有重大意義。
【附圖說明】
[0014]圖1為P4的質譜分析圖；
圖2為表位肽P4誘導結核患者T細胞活化并分泌IFN- γ的示意圖；
圖3為ELISP0T檢測Ρ4誘導結核患者表位肽特異T細胞的頻率；圖中DRB1*0901—表示非HLA-DRB1*0901 結核患者；
圖4為CFSE標記增殖實驗檢測P4誘導結核患者表位肽特異CD4+T細胞增殖，圖中W/0表示對照組。
【具體實施方式】
[0015]下面結合具體實施例對本發明做進一步的說明，但并不局限于此。
[0016]實施例1:HLA-DRB1*09:01限制性表位肽的獲得
本發明從HLA基因頻率數據庫AFND(AlIele Frequency Net Database, AFND)上獲得中國人群HLA-DRBI位點各基因型的頻率分布信息，其中HLA-DRBI基因頻率約為15%，SHLA-DRBl位點上頻率最高的單個基因型。使用生物信息學算法預測抗原蛋白所含的HLA-DRB1*09:01限制性⑶4+T細胞表位。
[0017]本發明綜合利用各種生物信息學、免疫信息學的技術手段，對結核分枝桿菌抗原蛋白序列上所含的HLA-DRB1*09:01限制性CD4+T表位肽進行預測分析，通過大量的篩選，篩選出與HLA分子具有高親和力的表位肽，并通過免疫學實驗鑒定。篩選結果發現CD4+T表位肽P4可誘導⑶4+T細胞產生強烈的細胞免疫應答，分泌高水平IFN-γ，并誘導⑶4+Τ細胞發生顯著增殖。
[0018]表位肽Ρ4的氨基酸序列為LDQVHFQPLPPAVVK(SEQ ID NO:1)，其質譜分析圖如圖1所示。
[0019]表位肽P4與HLA分子的親和力使用IC50值表示，IC50值越低，則表位肽與HLA分子親和力越高，其中通常認為IC50值低于50nM即表示高親和力。而表位肽P4與HLA分子的IC50值為0.28nM，可見表位肽P4與HLA分子間具有極高的親和力。
[0020]實施例2:ELISA實驗檢測表位肽P4誘導T細胞分泌IFN- γ 實驗方法如下:
采用密度梯度法分離HLA-DRB1*09:01基因型結核患者外周血單個核細胞(peripheralblood mononuclear, PBMC)。將收集的20ml外周血用PBS稀釋一倍，緩慢加入淋巴細胞分離液上方，兩者體積比為2:1，然后以800g/min轉速離心30min，離心后液體分為三層，其中PBMC在第一層和第二層之間，成白膜狀，用滴管小心吸取PBMC至新的離心管中，加入5倍以上體積TOS洗滌，800g/min離心lOmin，重復洗滌一次，用凍存液(90%FBS+10%DMS0)凍存細胞，液氮儲存。
[0021 ] ELISA實驗:復蘇HLA-DRB1*09:01基因型患者?8抓，在37°〇，5% CO2孵箱中靜置過夜。用去死細胞磁珠去除PBMC中的死細胞。細胞計數，完全培養基重懸細胞至1.25 XlOfMVmL，將200yL/孔細胞懸液鋪入96