腫瘤細胞特異性多克隆t細胞制備方法及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及分子生物學和細胞免疫學技術領域，特別是涉及腫瘤細胞特異性多克 隆T細胞制備方法，通過該方法制備的腫瘤細胞特異性多克隆T細胞在預防或治療癌癥的 藥物中的應用。
【背景技術】
[0002] 目前，過繼性免疫細胞治療在治療黑色素瘤和血液系統的腫瘤中取得了突破性進 展；因此，再次成為腫瘤免疫治療研究領域的熱點。國際上，選擇的效應細胞主要包括腫瘤 浸潤淋己細胞（tumor infiltrating lympho巧te, TIL)、腫瘤抗原或病毒抗原特異性細 胞毒性T細胞（巧totoxic T lympho巧te, CTL)和嵌合抗原受體修飾的T細胞（chimeric antigen receptor modified T lympho巧te, CART);國內，臨床應用的還主要是20世紀80 年代發明的細胞因子誘導的殺傷細胞（巧tokine in化ced killer cell, CIK)及在此基礎 上改進的樹突狀細胞活化的細胞因子誘導的殺傷細胞（DC-CIK)。CIK及DC-CIK細胞制備工 藝相對簡單、很容易在臨床進行規模化推廣，但由于其主要通過非特異性機制殺傷腫瘤細 胞，目前的臨床結果顯示，療效非常有限。TIUCTL和CART在臨床上取得了很好的臨床治療 效果，但是TIL卻存在取材困難，而且需要經過1~2個月較長時間的培養，因此，很難在臨床 規模化推廣應用；CTL細胞的制備，首先分離出腫瘤或者病毒特異性抗原，然后分離單核細 胞誘導DC，在此過程中加入特異性抗原，使成熟的DC最后能夠通過主要組織相容性復合體 (major histocompatibility complex, MHC)編碼的 I、II 類分子的形式遞呈到 DC 表面， 然后與T細胞共培養誘導CTL細胞的產生，整個過程中涉及到抗原制備、DC和T細胞分離 培養，因此工藝較為復雜；CART的制備目前主要方式是通過慢病毒載體進行基因修飾，工 藝流程更為復雜，而且成本高昂，因此，目前還處于臨床試驗階段，很難在臨床規模化應用。 最近研究顯示，慢性淋己細胞白血病（C虹onic lympho巧tic leukemia,化L)患者來源的 外周血單個核細胞（Peripheral blood mononuclear cell, PBMC)，在體外培養中加入一種 雙碑1 向特異性抗體（Bispecific Antibody, BsAb)的藥物 blinatumomab (CD3XCD19),同 時加入IL-2,能夠消除PBMC中的白血病細胞，同時誘導的多克隆T細胞能夠顯示出較強的 殺瘤效應（Golay等，2014)。但該技術使用的雙祀向特異性抗體涉及到在體外進行生產、純 化、包裝、運輸、保存等環節，因此成本高昂、并且費時費力；此外，該技術制備的多克隆T細 胞僅針對B細胞系腫瘤，應用范圍非常有限。因此，如何克服上述系列技術的限制性，開發 出一種能夠針對大部分腫瘤甚至全部腫瘤類型的、工藝簡單、成本低廉的腫瘤特異性T細 胞制備通用技術，則是目前腫瘤免疫治療面臨的關鍵問題和難題。

【發明內容】

[0003] 為解決上述問題，本發明提供了 一種腫瘤細胞特異性多克隆T細胞（tumor specific polyclonal T lymphocyte, TSPT)的制備方法及其在預防或治療癌癥的藥物中 的應用。
[0004] 第一方面，本發明提供了 TSPT細胞的制備方法，所述TSPT細胞是通過獲取PBMC 然后用基因修飾腫瘤細胞與獲取的PBMC共培養制備所得。盡管獲取PBMC和體外制備特異 性T細胞的方法已經很多，但目前還沒有描述通過對腫瘤細胞進行雙重基因修飾，修飾的 腫瘤細胞能同時表達分泌型基因工程抗體（Genetic engineering Antibody, GeAb)和膜 結合型祀抗原（Target Antigen, TAg)，然后用上述基因修飾腫瘤細胞與PBMC共培養獲取 TSPT細胞的組合型方法。上述組合中，制備TSPT細胞的原理是：基因修飾腫瘤細胞能夠分 泌GeAb同時又能表達膜結合型TAg，在與PBMC混合培養的過程中，GeAb通過識別TAg和T 細胞，將二者較鏈在一起，從而有利于基因修飾腫瘤細胞對T細胞的抗原遞呈，然后進一步 刺激、活化和擴增T細胞形成TSPT細胞，培養過程中基因修飾腫瘤細胞被殺死；對腫瘤抗原 明確的腫瘤細胞來說，進行基因修飾表達TAg,起到了強化抗原抗體特異性識別的作用，而 對腫瘤抗原不明確的腫瘤細胞來說，通過選擇一個已知的TAg進行修飾，則起到了架起抗 原抗體特異性識別的作用。因此該技術方案，解決了目前大部分腫瘤抗原不明確或者表達 量低的腫瘤細胞無法與T細胞識別進而誘導特異性T細胞產生的技術難題。該方法包括如 下步驟；首先采集外周靜脈血，然后用聚藏糖-泛影葡糖胺密度梯度離也法分離獲取PBMC， 將上述PBMC與基因修飾腫瘤細胞進行混合，然后在含有重組人白介素-2 (Recombinant Human Interleukin-2, rh]X-2)的培養基中共培養。隨后每2~3天，對細胞進行計數，然 后用含有rhIL-2的新鮮培養基調整細胞到適宜密度后繼續培養，培養9~20天后，所收集的 細胞即為TSPT細胞。
[0005] 優選地，初始培養PBMC和基因修飾腫瘤細胞的密度分別均為（0. 5 ~2) X l〇6/ml， 兩者混合的體積比為0. 1~10。
[0006] 進一步優選地，初始培養PBMC和基因修飾腫瘤細胞的密度分別均為1 X l〇6/ml，兩 者混合的體積比為1。
[0007] 優選地，使用rh比-2的終濃度為50 ~ 1000 lU/ml。
[0008] 進一步優選地，使用rh比-2的終濃度為300 lU/ml。
[0009] 優選地，隨后每2~3天，細胞培養的適宜密度為（0.5 ~ 3) Xl〇6/ml。
[0010] 進一步優選地，隨后每2~3天，細胞培養的適宜密度為IX l〇6/ml。
[0011] 第二方面，本發明提供了一種基因修飾腫瘤細胞的制備方法，所述基因修飾腫瘤 細胞可W通過同時具有編碼GeAb和TAg (GeAb. TAg)基因的載體轉染腫瘤細胞獲得。
[001引優選地，所述GeAb基因具有編碼GeAb的堿基序列，所述GeAb為BsAb，所述BsAb 具有祀向T細胞抗原表位的結合位點和腫瘤細胞表面抗原表位結合位點的分泌型BsAb。
[0013] 優選地，所述TAg基因是具有編碼TAg的堿基序列，所述TAg選之組織特異性分化 抗原、致癌病毒表達的腫瘤抗原、突變基因或癌基因的表達產物、異常表達的細胞蛋白和胚 胎抗原中的一種。
[0014] 優選地，所述載體選之慢病毒表達載體、逆轉錄病毒載體、腺相關病毒載體、腺病 毒載體、非復制型病毒載體、復制型病毒載體和睡美人轉座子等中的一種。
[0015] 優選地，所述腫瘤細胞選之肝癌、肺癌、胃癌、食管癌、腸癌、宮頸癌、乳腺癌和鼻咽 癌等腫瘤細胞中的一種。
[0016] 第H方面，本發明提供了一種編碼GeAb. TAg基因載體的構建方法，所述具有編碼 GeAb. TAg基因的載體是在載體的多克隆位點（MCS)中插入GeAb. TAg基因序列組合而成，所 述GeAb.TAg基因序列包括依次連接的編碼免疫球蛋白K鏈信號膚的堿基序列、編碼Flag 標簽的堿基序列、GeAb的堿基序列、編碼組氨酸化s6標簽的堿基序列、P2A的堿基序列、TAg 基因和終止密碼子。
[0017] 優選地，所述載體選之慢病毒表達載體、逆轉錄病毒載體、腺相關病毒載體、腺病 毒載體、非復制型病毒載體、復制型病毒載體和睡美人轉座子等中的一種。
[0018] 進一步優選地，所述載體為慢病毒表達載體。
[0019] 優選地，所述免疫球蛋白K鏈信號膚的堿基序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0020] 優選地，所述Flag標簽的堿基序列如SEQ ID NO: 2所示。
[0021] 優選地，所述GeAb基因為BsAb基因。
[0022] 進一步優選地，所述BsAb的基因由編碼抗CD20抗體的單鏈抗體（single-chain antibody fragment, scFv)基因和編碼抗CD3的scFv基因通過短鏈（GGGGS)鏈接而成 (CD20XCD3)。
[0023] 進一步優選地，所述BsAb的堿基