一種基因編碼的過氧化氫熒光探針及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物化學、蛋白質化學及分子生物學領域，具體地涉及能夠提高過氧 化氫探針HyPer熒光強度的突變蛋白及基因編碼核苷酸序列，還涉及該突變體蛋白及其核 苷酸序列的制備方法及其在檢測H 202中的應用。
【背景技術】
[0002] 活性氧（R0S)是由分子氧衍生的一系列活性分子（例如H202)、游離自由基的總稱。 在氧化還原代謝過程中，R0S是不同生理和病理過程的關鍵介質。游離的氧分子對需氧生 物來說是有害的。這些分子主要是線粒體呼吸作用過程中發生電子轉移產生的副產物，以 及氧化還原酶、金屬催化氧化過程中產生的副產物。之前的報道稱只有吞噬細胞才會與R0S 的產生有關，因為這種細胞含有對抗宿主細胞的防御機制。但是最近的研究已經證明，R0S 對細胞信號，包括細胞凋亡、基因表達和細胞信號級聯反應的激活，都起到了重要的作用。 R0S還是細胞內部和細胞之間的信使。
[0003] 作為活性氧（R0S)的主要家族成員之一，H202被廣泛用于化學、生物、藥學、臨床、 環境和食品等領域。H 202與各種中樞神經系統的疾病相關，如阿爾茨海默氏癥，帕金森氏病 和肌萎縮性側索硬化。此外H 202也是酸雨形成的因素之一。因此無論在環境、臨床還是藥 學領域，對h20 2進行精確檢測都是非常重要的。
[0004] 目前已經報道了各種檢測胞內H202的方法，如滴定分析，分光光度分析法，熒光分 析法，電解分析等，其中熒光分析法是一種有前景的檢測方法，能夠快速、高選擇、實時地監 測h 202。目前有以下幾種探針用于檢測H202 :
[0005] 1、H202在辣根過氧化酶（HRP)的催化作用下，能夠與Amplex Red進行1:1的反應， 產生高熒光產物試鹵靈。HRP對H202具有選擇性，而Amplex Red對二者的底物具有高度的 靈敏性和穩定性，產物試齒靈也是很穩定的，它的長波段會避免大多數生物體自發熒光造 成的干擾。鑒于AmplexRed的高靈敏性、特異性和化學穩定性，它被廣泛用于不同生物體中 H202的低水平測量，然而這個反應產物試鹵靈是劇毒產品，且必須避光保存，使檢測方法局 限性較大。
[0006] 2、基于snap-tag的去保護熒光探針和基于細胞器標記的體內成像方法。這些方 法可以選擇性的檢測H 202，但是不適合檢測H202濃度的動態變化。
[0007] 3、利用氧化還原敏感型的綠色熒光蛋白（roGFPs)，roGFPl和roGFP2檢測。它們 是GFP的突變體，在氧化環境中，靠近roGFP生色團的β鏈上的Cysl47和Cys204會形成 二硫鍵，這就會導致蛋白質的構象發生改變，從而使roGFP 400nm的激發峰上升，而490nm 的激發峰下降。通過比較400nm激發產生的熒光與490nm激發產生的熒光，可以表征胞內 氧化的程度。然而各種氧化劑都可以促使Cysl47和Cys204之間的二硫鍵形成，因此roGFP 探針不是H202的特異性探針，但是它能夠表征細胞內的氧化還原狀態。
[0008] 4、為了解決roGFP的不足，一種新型的、特異性檢測胞內H202的探針被開發，命名 為HyPer。這個探針引入了循環排列的黃色熒光蛋白（cpYFP)。YFP是GFP的突變體T203Y。 cpYFP是將蛋白質的氨基末端與羧基末端部分互換，再利用一段小的間隔區域將二者的起 始端相連，cpYFP對蛋白質的構象變化具有高度的靈敏性，并且通過熒光的改變來表征構象 的變化。OxyR是過氧化氫的傳感器及其轉錄的調節器。它能夠在原核生物中感應H 202的 存在，并且誘導抗氧化系統的產生。OxyR含有一個H20 2感應調節域（OxyR-RD，對應氨基酸 80-310位）以及一個DNA結合域（對應氨基酸1-79位）。感應調節域中的殘基Cysl99和 Cys208之間，能夠形成一個胞內分子的二硫鍵，導致蛋白構象發生改變，從而激活OxyR的 轉錄因子。HyPer是將cpYFP蛋白插入到OxyR-RD中，中間以一段氨基酸短鏈相連接。HyPer 的激發峰是420nm和500nm，發射峰在516nm處。在H202存在的條件下，420nm處的激發峰 就會下降，而500nm處的激發峰就會上升，因此HyPer是一類比率型的探針。熒光性質的改 變是〇xy-RD被氧化所導致的。實驗證明，將Cysl99或Cys208突變為絲氨酸以后，這種熒 光改變就不會發生。因此HyPer對H 202具有選擇性。其他的R0S分子，如一氧化氮，過氧亞 硝基，超氧陰離子及氧化的谷胱甘肽都無法使HyPer的熒光發生變化。
[0009] HyPer是一個可逆的H202熒光探針，能夠快速、特異性的檢測胞內H20 2。其突變體 HyPer-3SEQ ID N0 4所示（在HyPer上對應的是H34Y)對H202具有更高的動態響應倍數。 二者都是GFP的衍生物，但是它們的熒光比化學探針小得多，熒光強度只有EGFP的5%~ 7%，且在斑馬魚胚胎內只觀測到微弱的熒光，這極大的限制了活體動物或亞細胞器中H 202 動態變化的檢測。所以提高HyPer探針的熒光強度，提高H202的檢測精度是非常重要的。 [0010] 綜上所述，我們認為對進行HyPer理性突變體能夠有效的提高探針的熒光強度， 滿足在生理水平和亞細胞水平上檢測H202的需要。
[0011] 不應認為對本文所述參考文獻的引用或討論意味著承認這些參考文獻是本發明 的現有技術。

【發明內容】

[0012] 為了解決上述問題，本發明的第一個目的是提供一種基因編碼的過氧化氫熒光探 針。
[0013] 本發明的第二個目的是提供編碼所述過氧化氫熒光探針核苷酸序列。
[0014] 本發明的第三個目的是提供所述基因編碼的過氧化氫熒光探針的制備方法。
[0015] 本發明的第四個目的是提供包含編碼過氧化氫熒光探針核苷酸序列的表達載體。
[0016] 本發明的第五個目的是提供所述基因編碼的過氧化氫熒光探針在大腸桿菌表達 后，對H20 2的檢測。
[0017] 本發明的第六個目的是提供所述基因編碼的過氧化氫熒光探針在哺乳動物細胞 中表達后，對H 202的檢測。
[0018] 本發明的技術方案如下：
[0019] 一種基因編碼的過氧化氫熒光探針，包括SEQ ID N0:34所示對H202敏感的多肽 OxyR和SEQ ID N0 :6所示對H202進行表現的熒光蛋白cpYFP，將熒光蛋白cpYFP插入到對 H202敏感的多肽OxyR中，形成熒光探針，其特征在于：所述過氧化氫熒光探針為對熒光探針 中的熒光蛋白cpYFP序列進行突變而得到的突變體。
[0020] 根據本發明提供的基因編碼的過氧化氫熒光探針，優選的是，所述過氧化氫熒光 探針為對SEQ ID N0:2所示的HyPer熒光探針的262、271、131和337位點中的1個或1個 以上位點進行突變的突變體。
[0021] 根據本發明提供的基因編碼的過氧化氫熒光探針，優選的是，所述過氧化氫熒光 探針為對SEQ ID N0:4所示的HyPer3熒光探針的262、271、131和337位點中的1個或1 個以上位點進行突變的突變體；所述HyPer3熒光探針為HyPer熒光探針在34位的突變體。
[0022] 根據本發明提供的基因編碼的過氧化氫熒光探針，進一步優選的是，所述過氧化 氫熒光探針為對SEQ ID N0 :2所示的HyPer熒光探針的S262R、Y271N、Y131F和N337T位 點中的1個或1個以上位點進行突變的突變體。
[0023] 根據本發明提供的基因編碼的過氧化氫熒光探針，進一步優選的是，所述過氧化 氫熒光探針為對SEQ ID N0 :4所示的HyPer3熒光探針的S262R、Y271N、Y131F和N337T位 點中的1個或1個以上位點進行突變的突變體；所述HyPer3熒光探針為HyPer熒光探針的 H34Y位的突變體。
[0024] 根據本發明所述的基因編碼的過氧化氫熒光探針，優選的，所述過氧化氫熒光探 針為對 SEQ ID N0 :8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32 所示的氨基酸序列。
[0025] 根據本發明所述的基因編碼的過氧化氫熒光探針，進一步優選的，所述過氧化氫 熒光探針為對SEQ ID勵：8、10、12、14、16、18所示的氨基酸序列。
[0026] 根據本發明所述的基因編碼的過氧化氫熒光探針，最優選的，所述過氧化氫熒光 探針為對SEQ ID N0:10和12所示的氨基酸序列。
[0027] 本發明還提供一種編碼權利要求1所述基因編碼的過氧化氫熒光探針的核苷酸 序列，所述核苷酸序列為 SEQ ID N0 :7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、31 所示。。
[0028] 本發明還提供一種制備所述基因編碼的過氧化氫熒光探針的方法，包括以下步 驟：
[0029] 1)將含有所述核苷酸序列的表達載體轉移到宿主細胞中，
[0030] 2)在所述宿主細胞表達的條件下培養所述宿主細胞，和
[0031] 3)由所述宿主細胞分離所述熒光探針。
[0032] 本發明還提供一種表達載體，所述的表達載體由載體質粒與所述的核苷酸序列操 作性連接得到的。所述表達載體選自原核表達載體、真核表達載體。
[0033] 本發明所述原核表達載體，優選的是，由載體質粒pRSETb與所述的核酸序列操作 性連接得到的。
[0034] 本發明還提供一種包含所述的表達載體