專利名稱：控制植物分枝的基因的制作方法
背景技術：
植物具有各種氣生結構。決定植物整體結構的特征之一是分枝(shoot-branching)模式，分枝通過在葉腋中形成側向分生組織而起始。在某些植物物種中側向分生組織的生長通過初級花柄(primaryfloral shoot)而抑制，這一現象通常稱為頂端優勢。細胞激動素和植物生長素是在控制這種發育過程中起主要作用的傳統植物激素(1)。(參考文獻在說明書后面列出)。植物生長素抑制側芽的長出，而細胞激動素刺激生長。兩種激素水平的不平衡導致生長缺陷。除使側芽免于頂端優勢限制之外，細胞激動素還在植物生長和發育中起其它重要作用。這些包括延遲葉衰老，抑制根生長以及與植物生長素一起促進組織培養物中的細胞分化和枝形成(shoot formation)。這一信息大部分來自細胞激動素的外源應用的間接證據以及用編碼異戊烯轉移酶的細菌細胞激動素生物合成基因IPT轉化的植物(2，3)。因此，在植物中細胞激動素的生物合成、代謝、分布、感覺和信號轉導的知識還不很清楚。為此，在過去幾年中，從擬南芥屬中分離了一些細胞激動素相關突變體(4-9)。已采用一些選擇方案來選擇不同類的突變體，以試圖了解細胞激動素調節植物生長和發育的機制。但是，相應基因的分子性質尚不知道，分離的突變體類型主要受選擇方案的設計的限制。
已表明SPS編碼細胞色素P450，其曾被稱為CYP79F1。sps突變體的表型異常和其激素水平的分析表明SPS編碼一種參與細胞激動素代謝的酶。因此，在一個方面，本發明涉及一種改變含有SPS基因的植物的生長或發育的方法，該方法包括調節SPS基因的表達。
在另一方面，本發明提供了用與植物活性啟動子可操縱連接的SPS基因轉化的植物。本發明還包括顯示由于SPS基因的抑制導致的升高水平的細胞激動素的新植物。SPS的抑制例如通過用編碼與植物活性啟動子可操縱相連的SPS反義或核酶的核酸轉化植物而實現。本發明實施方案中采用的植物活性啟動子可以是植物分子生物學領域技術人員熟知的組成型啟動子，誘導型啟動子或組織特異性啟動子。
CYP79編碼序列在不同屬和種的植物中廣泛保守，因此擬南芥屬SPS基因以及具有衍生自其序列的約8或更多個核苷酸的引物和探針可用于制備不同物種植物的分離的SPS基因的方法中。
在權利要求書范圍內的本發明的這些和其它方面及優點對于本領域技術人員是明顯的。
圖2示出細胞色素P450基因的位置，以及供體T-DNA和sps等位基因1-5中Ds插入位點。
發明詳細描述通過對稱為supershoot(“sps”)的擬南芥屬轉座子插入突變體的研究而發現SPS基因。sps突變體選自在擬南芥生態型Wassilewskija(Ws)中的基因阱Ds插入品系的集合(10)。
在sps突變體中的表型異常和升高的細胞激動素水平表明突變體在細胞激動素水平調控方面有缺陷。推定Ds元件轉座到參與細胞激動素代謝的基因的插入位點，由此激活基因導致細胞激動素累積。
由于該推定的基因由Ds元件標記，通過TAIL-PCR(17)擴增突變植物的位于Ds元件側翼的基因組DNA片段以進行詳細分析。檢索擬南芥基因組數據庫揭示該側翼序列與來自染色體1，GenBankGI 4887257；GenBank登錄號AC006341的基因組序列相同。還發現在轉座子標記實驗中使用的供體T-DNA基因座也位于相同克隆中。供體和再插入位點的位置間的比較研究表明在這一突變體中(稱為sps-1等位基因，因為如下所述另外的等位基因也已發現)，該元件轉座至距供體位點8.5kb的推定的細胞色素P450的編碼區，該編碼區以前稱為CYP79F1(AC006341，63874..66127)。隨后用PCR片段作為探針篩選擬南芥葉和莖cDNA文庫(18)，從這一篩選中分離的最常的SPS cDNA克隆的長度為1.38kb，這一cDNA被確定為一部分克隆，其在5’末端截短。從相應于SPS基因的現有基因組和EST序列(19)預測開放讀框的起始密碼子位于該分離的cDNA起始點之前442bp。這一預測由來自SPS密切相關基因的信息支持，該基因與SPS基因有89％序列相同性(見下述)。重建全長SPS cDNA的序列，其長度為1.8kb并具有SEQ ID NO1所示序列，此SPS基因預計編碼537個氨基酸，計算分子量為61.5kD。
通過基因組Southern印跡分析(20)估測CYP79F亞家族中的密切相關序列數目。在擬南芥基因組中，僅有兩個片段在低嚴格條件下與SPS探針雜交，提示在這一亞家族中僅有兩個相關成員。檢索擬南芥屬數據庫揭示密切相關的序列恰位于SPS基因的下游，被稱為CYP79F2(AC006341，60246..62290)。兩個細胞色素P450以及供體T-DNA的位置在圖2中示出。目前，在植物中已鑒別了CYP79家族的13個成員(7個成員來自擬南芥屬，1個來自Sorghum bicolor，1個來自Sinapis alba，2個來自Manihot esculenta，2個來自Triglochinmartima)。在這13個成員中，有6個成員進行了更詳細的分析。來自Sorghum bicolor的CYP79A1(21)，來自Sinapis alba的CYP79B1(22)，來自Triglochin martima的CYP79E1和CYP79E2(43)示出在植物次生代謝物含氰苷的生物合成中催化酪氨酸轉化成p-羥基苯基乙醛肟。來自擬南芥屬的CYP79B2和CYP79B3示出催化色氨酸轉化成吲哚-3-乙醛肟，其是IAA和吲哚glucosinolate的前體(44)。
為證實CYP79F1是否相應于sps突變，分離了由獨立Ds插入導致的幾個其它的sps等位基因。由于供體T-DNA和SPS基因距離相近，所以這些突變等位基因易于獲得。從獨立插入品系中分離了稱為sps-2至sps-5的4個其它sps等位基因。每一等位基因顯示與sps-1類似的整體表型。基因組Southrn印跡分析證實每一品系在基因組中僅含1個單個Ds元件。分離來自每一等位基因的Ds側翼DNA片段并進行分析。所有這些等位基因在CYP79F1基因的編碼區內均含Ds插入。在5個突變等位基因中破壞基因功能的Ds元件的位置示于圖2。這些結果總地示出SPS基因由Ds元件標記。
在細胞色素P450成員中有若干序列基序保守，據報道它們對于蛋白質功能是重要的。這些包括對于催化是關鍵的血紅素結合域，對于膜結合重要的N-末端疏水區，以及負責蛋白質正確組裝的富含脯氨酸/甘氨酸區域(23，24)。CYP79家族的血紅素結合域與其它P450不同，但在相同家族成員間保守。CYP79家族特異性血紅素結合共有序列確定為SFSTG(K/R)RGC(A/I)A(22)。這一獨特序列在SPS基因中也保守。也存在N-末端疏水區和富含脯氨酸/甘氨酸區域。
植物生長和發育的控制或調節可通過調節SPS基因表達而實現。細胞激動素水平可通過抑制基因的表達而增加。這種增加水平的細胞激動素增進側枝形成(27，28)。相反，在強啟動子控制下的有義構建體進行SPS基因的過表達抑制側枝形成。
另外，植物的氣生結構可通過控制SPS基因表達的位置和/或時機在確定區域內改變。例如，導致僅側枝增加的修飾可通過用特異表達的或組織特異性啟動子降低在出芽部位的SPS表達水平而實現。這種啟動子是已知的且可通過各種技術如基因捕獲(25)而分離。
SPS表達的抑制可以本領域已知的各種方式實現。可方便地使用反義技術，為實現反義表達，克隆來自SPS基因的核酸區段并將其與啟動子可操縱連接，從而RNA的反義鏈將被轉錄。然后將表達盒轉化進植物并產生RNA反義鏈。在植物細胞中，已提示反義RNA通過防止編碼感興趣基因的mRNA的積累而抑制基因表達(29，30)。
待導入的核酸區段通常與SPS基因的至少一部分基本相同，但是該序列不需完全相同來抑制表達。對于反義抑制，相對于初級轉錄產物或完全加工的mRNA，導入的序列不需是全長的。通常，可使用較高的同源性以補償使用較短的序列。另外，導入的序列不需具有相同的內含子或外顯子模式，非編碼區段的同源性可同樣有效。通常，可使用約30或40個核苷酸與約全長之間的序列，優選使用至少約100個核苷酸的序列，更優選至少約200個核苷酸的序列，特別優選至少約400個核苷酸的序列。
也可使用催化RNA分子或核酶來抑制SPS基因的表達。可以設計特異地與幾乎任何靶RNA配對且在特異位置裂解磷酸二酯骨架的核酶，從而功能性失活靶RNA。在進行這一裂解時，核酶本身沒有變化，因此可以再循環并裂解其它分子，使得其是一種真酶。在反義RNA內包含核酶序列使得其具備RNA裂解活性，由此增加構建體的活性。
已描述了一些類別的核酶(31)。一類核酶來自能在植物中自裂解和復制的一些小環狀RNA，所述RNA單獨復制(類病毒RNA)，或與輔助病毒一起復制(衛星RNA)。例如來自鱷梨白斑類病毒的RNA和來自煙草環斑病毒，紫花苜蓿易過性條紋病毒，絨毛煙斑駁病毒，茄屬植物(Salanum nodiflorum)斑駁病毒和地三葉草斑駁病毒。
通過用與植物活性啟動子可操縱相連的SPS基因轉化植物可實現SPS表達的增加。將DNA摻入植物細胞以在細胞中表達的技術是熟知的，這些技術適用于摻入SPS基因以及摻入反義或核酶構建體。
通常，這類技術涉及將核酸插入DNA表達載體，這種載體有利地含有插入的蛋白編碼序列的轉錄和翻譯必需的元件，以及一或多個標記序列以促進轉化的細胞或植物的選擇。
本領域已知一些植物活性啟動子，其可以用于實現所需核酸序列的表達，例如合適的啟動子包括nos啟動子，小亞基葉綠素A/B結合多肽，花椰菜花葉病毒35S啟動子，以及從SPS基因分離的啟動子。啟動子可以從待轉化的植物類型中分離出。35S或肌動蛋白啟動子也可用于分離的cDNA克隆。這些還可用于測試基因的過表達。改變SPS基因在確定植物區域的表達可通過用特異表達的啟動子實現，這種啟動子可通過各種技術如基因捕獲(25)容易地分離。另外，已描述了幾種誘導型啟動子，如GVG，GVGEc，ER-C1系統，這些誘導型啟動子可用于啟動或關閉轉基因的表達。
將核酸克隆進表達載體后，其可易于轉化進植物細胞。術語植物細胞包括來自植物的任何細胞，這包括未分化的組織如愈傷組織和懸浮培養物，以及植物種子，花粉或植物胚胎。適于轉化的植物組織包括葉組織、根組織、分生組織、原生質體、下胚軸子葉、盾片、莖尖，根，未熟胚、花粉和花藥。
根據本發明，用SPS基因轉化植物的一種技術是將這種植物的組織與細菌接種物接觸，該細菌已用包含本發明的核酸的載體轉化。通常這一程序涉及用細菌懸液接種植物組織，并在不含抗生素的再生培養基上于25-28℃培養組織48-72小時。
來自農桿菌屬的細菌可用于轉化植物細胞，這種細菌的核酸菌種包括根瘤農桿菌和毛根農桿菌。根瘤農桿菌(例如菌株LBA4404或EHA105)由于其公知的轉化植物的能力而特別實用。
用本發明的核酸轉化植物細胞的另一途徑涉及將惰性或生物學活性顆粒推進植物細胞，這一技術在Sanford等的美國專利4,945,050，5,036,006和5,100,792中公開，這些文獻引入本文作參考。一般地，這一程序涉及在有效穿透細胞的外表面和摻入其內部的條件下將惰性或生物學活性顆粒推進細胞。當使用惰性顆粒時，可通過用含有感興趣的核酸的載體包被顆粒而將載體導入細胞。生物學活性顆粒(例如，干酵母細胞，干細菌或噬菌體，其均含有希望導入的DNA)也可被推進植物細胞組織。
轉化植物細胞的另一方法是電穿孔方法，這一方法涉及將原生質體和希望的核酸混合，通過電脈沖在細胞膜中形成孔以將DNA導入細胞，由此轉化細胞。這一方法目前有高重復性，通過這一方法已將各種基因導入單子葉植物，特別是水稻植物(32-34)。
與電穿孔方法類似的是這樣的方法，在該方法中將需要的基因和原生質體混合，并用PEG處理混合物，由此將基因導入原生質體。這一方法不同于電穿孔方法之處在于用聚乙二醇(PEG)代替電脈沖(35-37)。
其它方法包括1)用核酸培養種子或胚胎(38)；2)處理花粉管(39)；3)脂質體方法(40，41)；和4)微注射方法(42)。
從轉化的植物細胞再生植物的已知方法可用于制備本發明的轉基因植物。一般地，可將外植體、愈傷組織或懸浮培養物暴露于合適的化學環境(例如，細胞激動素和植物生長素)，由此新生長的細胞可分化并產生胚胎，隨后再生成根和莖。
包括CYP79F1在內的蛋白質的細胞色素P450家族的序列在許多植物屬和物種中保守(21，22，43，44)。因此，本文描述的擬南芥屬SPS基因可方便地直接用于影響植物的生長和發育，或可用于制備其它物種的SPS基因和基因構建體(包括反義構建體)。用于鑒別這種SPS基因的引物和探針，任選地用一或多個可檢測核苷酸標記，其由具有這樣的序列的核酸組成，所述序列相同于或互補于SEQ IDNO1的任何8或更多個、優選地13個或更多個連續核苷酸的序列。如本文所用，“相同于”是指序列，RNA序列含有與DNA的脫氧核糖核苷酸的核糖核苷酸。這種引物和探針可用于本領域熟知的通過例如擴增和/或探測法分離SPS基因的方法中。
本發明進一步通過下述非限制性實施例進一步描述。實施例1 SPS突變體的鑒定形態學sps突變體表型在幼苗中檢測不到，但是在植物產生成葉后可觀察到多效發育缺陷。見

圖1。相對于野生型植物，sps突變植物中葉形狀更呈鋸齒狀，且葉維管結構發育不良。在擬南芥屬中，子葉維管結構模式很簡單，僅有一個中央葉脈和二或三個互聯側枝。這一模式在蓮座葉(rossette leaf)中變得較復雜，在晚期成葉中可見最高復雜性。在sps突變體中，蓮座葉中維管結構模式比野生型葉中復雜程度低得多。另外，與野生型相比，成葉葉脈變得令人驚異地顯著，呈深綠色。當測定成熟葉中葉綠素含量時，突變植物也含有較高水平的葉綠素(11)。這些營養表型的嚴重性根據生長條件而變化，通過在合成培養基上培養植物可顯著延遲該表型。
從植物開花時起sps突變體的表型缺陷變得更加突出。在營養階段sps突變體相同的發葉率，且從營養期至繁殖期的轉變時機與野生型并無不同。sps花柄(floral shoot)的節間延伸降低且顯示出喪失頂端優勢(圖1A)。在野生型擬南芥屬植物中，從蓮座葉發育的側向花柄數目根據生態型而變化，通常少于5個。但是，也呈現衰老延遲的突變植物從蓮座軸和莖生葉持續產生側花柄，從而在4-5個月后每個植物有幾百個枝(圖1B)。sps突變體顯示出花器官數降低，并且花發育缺陷，花瓣通常減少或無，在一些花中萼片和雄蕊數也減少，花藥通常不釋放花粉粒，柱頭發育不良。結果是突變體結籽率非常低。細胞激動素水平sps突變體氣生部分生理學變化與由外源應用激素導致的細胞激動素效應非常類似，其是顯示細胞激動素過量產生的轉基因植物的特征(3)。這些生理學變化包括側芽無頂端優勢，發芽增加，葉衰老延遲和葉綠素含量增加。基于這些觀察，測定擬南芥屬中的主要活性細胞激動素游離玉米素(5，6)的水平。sps突變體的活性玉米素比野生型平均高3倍(12)。sps表型提示增加的細胞激動素水平可能是導致這些變化的主要缺陷。大多數報道指出表達細菌IPT基因導致形態學變化的轉基因植物具有非常高的細胞激動素水平，即50倍或更高(13-15)。細胞激動素的這一急劇增加現被認為是非生理學的。已表明相對較小的細胞激動素水平變化即2-7倍對于導致相同發育改變就足夠了(15，16)。sps突變體研究結果表明，確實細胞激動素水平的小波動即可誘導植物的發育變化。也已示出擬南芥屬突變體改變的分生組織程序(amp1)具有升高水平的內源性細胞激動素(5，6)。雖然sps和amp1喪失了頂端優勢，降低了可育性和延遲了衰老，但它們與其它發育程序顯著不同。其它amp1表型如多子葉，更快的出葉速率以及異常葉序在sps中或在賦予細胞激動素過量產生特性的轉基因植物中未觀察到。另一方面，在sps突變體中發現的成花器官數降低以及葉脈呈深綠色的特征在amp1突變體中未觀察到。目前，沒有關于AMP1基因的結構和功能的分子信息。由基因阱Ds元件監控的SPS表達模式關于基因作用的信息來自sps-2等位基因中的基因的時空表達研究。在這一等位基因中，在Ds元件的末端之間摻入GUS報道基因。GUS報道基因的表達由這些構建體中的天然SPS啟動子控制(25)。由GUS報道基因顯示的SPS的表達模式與在氣生部分中觀察到的形態學異常相關性很好。在萌發4-5天的幼苗中首先在莖頂端分生組織基部的微管組織的分枝區域檢測到表達，幾天后，在下胚軸和子葉的維管組織中發現更強的表達水平。在葉維管結構中的表達模式似乎是發育調控的，其首先僅在幼葉中央葉脈中觀察到，隨后當葉更成熟時在更細的葉脈中觀察到。SPS基因的表達僅限于植物的氣生部分，其從營養期持續至繁殖期。在花柄中，其在莖和莖生葉的維管組織中表達，在莖生葉基部以及花托和長角果(silique)有最強的表達強度，在幼苗階段或成熟植物的根系統中均未觀察到SPS表達。這些結果提示，SPS定位細胞激動素水平的調控，隨之在植物的確定區域控制發育。在突變植物中觀察到的SPS表達水平比顯示野生型表型的雜合植物中觀察到的表達水平高許多，這些數據提示SPS表達由反饋調控機制控制，其可在破壞基因時增強表達水平。這種調控可反映植物精密調節激素水平應答內部或外部刺激物的波動的能力。
植物如何時空調控細胞激動素的問題可通過分析SPS基因表達模式而解答，過去這一問題很難回答是因為在大多數植物組織中植物激素僅以微量存在。已毫無疑問地示出細胞激動素是促進芽生長的關鍵因子，而植物生長素具有抑制作用，因此，結果似乎取決于兩種激素的比率。盡管激素相互作用這一概念已廣為接受，但是頂端優勢機制仍不清楚。從sps獲得的結果強烈提示通過弱化分生組織區域活性細胞激動素的水平至可抑制芽生長以及從頭發芽的水平，植物可部分保持頂端優勢。實施例2 SPS克隆的實驗描述為了分離Ds近鄰側翼的DNA，將來自突變植物葉組織的約10ng基因組DNA用于如前所述的TAIL-PCR擴增(17)。攜帶側翼基因組序列的擴增片段經凝膠分離并用標準方法測序(20)。然后用32P-dCTP標記PCR擴增的片段，并用作探針如述(20)篩選從擬南芥屬葉和莖干制備的cDNA文庫(Clontech)。純化與PCR片段雜交的噬菌體并鑒定(20，廠商Clontech的指導)，隨后根據廠商指導將插入序列亞克隆進BLUESCRIPT質粒(Stratagene)進行詳細分析。用自動測序儀(Perkin Elmer AMI 377)測序攜帶插入序列的質粒并用DNA STAR程序組裝全長序列。
參考文獻及注釋1.I.A.Tamas，《植物激素》，P.J.Davies編輯(Kluwer學術出版社，1995)，pp 572-597。
2.D.W.S.Mok和M.C.Mok，《細胞激動素化學、活性及功能》(CRC出版社，Boca Raton，FL 1994)。
3.L.Hobbie，C.Timpte，M.Estelle，植物分子生物學261499(1994)。
4.W.Su，S.Howell，植物生理學，99，1569(1992)。
5.A.M.Chaudhury，S.Letham，S.Craig，E.S.Dennis，植物雜志4907(1993)。
6.A.N.Chin-Atkins，S.Craig，C.H.Hocart，E.S.Dennis，A.M.Chaudhury，植物198549(1996)。
7.J.Deikman和M.Ulrich，植物195，440(1995)。
8.T.I.Baskin，A.Cork，R.E.Williamson，J.R.Gorst，植物生理學107233(1995)。
9.T.Kakimoto，科學274982(1996)。
10.所用轉座子標記系統是基于以前報道的誘導系統L.Balcells，E.Sundberg，G.Coupland，植物雜志5(5)755(1994))和基因阱系統(V.Sundaresan，P.Springer，T.Volpe，S.Haward，JDG Jones，C.Dean，H.Ma，R.Martienssen，基因發育91797(1995))，的一修飾系統，用作靶轉座子標記系統。
11.R.Moran，D.Porath，植物生理學65478。
12.使用一簡便方法定量樹液中潛在活性形式的細胞激動素(CKs)(J.Wang，D.S.Letham，E.Taverner，J.Badenoch-Jones，C.H.Hocart，植物生理學9591(1995)，進行一些修改(J.W.H.Yong，S.C.Wong，D.S.Letham，C.H.Hocart，G.D.Farguhar(澳大利亞國立大學，提交的手稿)1998)。這一方法基于核糖苷和核苷酸轉化為堿基。
13.AC.Smigocki，植物分子生物學16105(1991)。
14.M.Faiss，J.Zalubilova，M.Strnad，T.Schmulling，植物雜志12(2)401(1997)。
15.J.Medford，R.Horgan，Z.El-Sawi，H.Klee，植物細胞1403(1989)。
16.A.Hewelt，E.Prinsen，J.Schell，H.Van Onckelen，T.Schmulling，植物雜志，6(6)879(1994)。
17.S.Parinov，M.Sevugan，D.Ye，WC.Yang，M.Kumaran，V.Sundaresan，植物細胞112263(1999)。
18.SPS cDNA克隆從擬南芥5’-STRETCH cDNA文庫(Clontech)中分離，該文庫從在光下生長的4.5周齡columbia葉和干制備。SPS cDNA的篩選根據廠商說明書進行。
19.ATTS5112 Gif-SeedA擬南芥cDNA克隆YAY778 5’，mRNA序列，登錄號F14190。
20.J.Sambrook，E.F.Fritsch，T.Maniatis，分子克隆實驗手冊，(冷泉港實驗室出版社，1989)。
21.B.M.Koch，O.Sibbesen，B.A.Halkier，I.Svendsen，B.L.Moller，生物化學生物物理檔案，323177(1995)。
22.S.Bak，H.L.Nielsen，B.A.Halkier，植物分子生物學38725(1998)。
23.C.C.S.Chapple，植物生理學108875(1995)。
24.C.D.Chen，B.Doray，B.Kemper，生物化學生物物理檔案，350233(1998)。
25.GUS表達分析的染色如先前所述(V.sundaresan，P.Springer，T.Volpe，S.Haward，JDG.Jones，C.Dean，H.Ma，R.Martienssen，基因發育91797(1995)。
26.J.Chory，R.K.Cook，R.Dixon，T.Elich，H.M.Li，E.Lopez，N.Mochizuki，P.Nagpal，A.Pepper，D.Poole，J.Reed，Phil.Trans.Roy.Soc.Lond.Ser.B..35059(1995)。
27.J.Gray，S.Picton，J.Shabbeer，W.Schuch，D.Grierson，植物分子生物學19(1)69(1992)。
28.共抑制是指內源性或導入的基因(轉基因)的過量表達導致內源性基因和轉基因的協同沉默，因而降低或消除該性狀的表達。例如，參見Jorgenson等，美國專利5,034,323和5,283,184。
29.Sheehy等，美國科學院院報858805-8809(1988)。
30.Hiatt等，美國專利4,801,340。
31.Haseloff等，自然334585-591(1988)。
32.Toriyama等，生物/技術61413-1426(1997)。
33.Shinamoto等，自然338274-277(1989)。
34.Rhodes等，科學240204-207(1988)。
35.Zhang W.等，理論和應用遺傳學76835-840(1988)。
36.Datta等，生物/技術8736-740(1990)。
37.Christou等，生物/技術9957-962(1991)。
38.Topfer，R.等，植物細胞1133-139(1989)。
39.Luo等，植物分子生物學報道6(3)165-174(1988)。
40.Caboche等，植物生理學79173-176(1990)。
41.Gad等，植物生理學79177-183(1990)。
42.Neuhaus等，理論和應用遺傳學7530-36(1987)。
43.J.S.Nielsen和B.L.Moller，植物生理學1221311(2000)。
44.A.K.Hull，R.Vij，J.L.Celenza，美國科學院院報972379(2000)。
45.J.Zuo和N-H Chua，生物技術當今觀點11146(2000)。
序列表<110>文凱特桑·孫戴爾桑蒂蒂馬·坦蒂甘乍那<120>控制植物分枝的基因<130>2577-135<140>未給出<141>2000-05-01<160>2<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1614<212>DNA<213>擬南芥<220><221>CDS<222>(1)..(1611)<400>1atg agc ttt acc aca tca tta cca tac cct ttt cac atc cta cta gtc 48Met Ser Phe Thr Thr Ser Leu Pro Tyr Pro Phe His Ile Leu Leu Val1 5 10 15ttt atc ctc tcc atg gca tca atc act cta ctg ggt cga ata ctc tca 96Phe Ile Leu Ser Met Ala Ser Ile Thr Leu Leu Gly Arg Ile Leu Ser20 25 30agg ccc acc aaa acc aaa gac cga tct tgc cag ctt cct cct ggc cca 144Arg Pro Thr Lys Thr Lys Asp Arg Ser Cys Gln Leu Pro Pro Gly Pro35 40 45cca gga tgg ccc atc ctc ggc aat cta ccc gaa cta ttc atg act cgt 192Pro Gly Trp Pro Ile Leu Gly Asn Leu Pro Glu Leu Phe Met Thr Arg50 55 60cct agg tcc aaa tat ttc cgc ctt gcc atg aaa gag cta aaa aca gat 240Pro Arg Ser Lys Tyr Phe Arg Leu Ala Met Lys Glu Leu Lys Thr Asp6570 75 80ata gca tgt ttc aac ttt gcc ggc atc cgt gcc atc acc ata aac tcc 288Ile Ala Cys Phe Asn Phe Ala Gly Ile Arg Ala Ile Thr Ile Asn Ser85 9095gac gag agc gct aga gaa gcg ttt aga gag cga gac gca gat ttg gca 336Asp Glu Ser Ala Arg Glu Ala Phe Arg Glu Arg Asp Ala Asp Leu Ala100 105 110gac cgg cct caa ctt ttc atc atg gag aca atc gga gac aat tac aaa 384Asp Arg Pro Gln Leu Phe Ile Met Glu Thr Ile Gly Asp Asn Tyr Lys115 120 125tca atg gga att tca ccg tac ggt gaa caa ttc atg aag atg aaa aga 432Ser Met Gly Ile Ser Pro Tyr Gly Glu Gln Phe Met Lys Met Lys Arg130l35 140gtg atc aca acg gaa att atg tcc gtt aag acg ttg aaa atg ttg gag 480Val Ile Thr Thr Glu Ile Met Ser Val Lys Thr Leu Lys Met Leu Glu145 150 155 160gct gca aga acc atc gaa gcg gat aat ctc ta gct tac gtt cac tcc 528Ala Ala Arg Thr Ile Glu Ala Asp Asn Leu Ile Ala Tyr Val His Ser165 170 175atg tat caa cgg tcc gag acg gtc gat gtt aga gag ctc tcg agg gtt 576Met Tyr Gln Arg Ser Glu Thr Val Asp Val Arg Glu Leu Ser Arg Val180 185 190tat ggt tac gca gtg acc atg cga atg ttg ttt gga agg aga cat gtt 624Tyr Gly Tyr Ala Val Thr Met Arg Met Leu Phe Gly Arg Arg His Val195 200 205acg aaa gaa aac gtg ttt tct gat gat gga aga cta gga aac gcc gaa 672Thr Lys Glu Asn Val Phe Ser Asp Asp Gly Arg Leu Gly Asn Ala Glu210 215 220aaa cat cat ctt gag gtg att ttc aac act ctt aac tgt tta ccg agt 720Lys His His Leu Glu Val Ile Phe Asn Thr Leu Asn Cys Leu Pro Ser225 230 235 240ttt agt cca gcg gat tac gtg gaa cga tgg ttg aga ggt tgg aat gtt 768Phe Ser Pro Ala Asp Tyr Val Glu Arg Trp Leu Arg Gly Trp Asn Val245 250 255gat ggt caa gag aag agg gtg aca gag aac tgt aac att gtt cgt agt 816Asp Gly Gln Glu Lys Arg Val Thr Glu Asn Cys Asn Ile Val Arg Ser260 265 270tac aac aat ccc ata atc gac gag agg gtc cag ttg tgg agg gaa gaa 864Tyr Asn Asn Pro Ile Ile Asp Glu Arg Val Gln Leu Trp Arg Glu Glu275 280 285ggt ggt aag gct gct gtt gaa gat tgg ctt gat acg ttc att acc cta 912Gly Gly Lys Ala Ala Val Glu Asp Trp Leu Asp Thr Phe Ile Thr Leu290 295 300aaa gat caa aac gga aag tac ttg gtc aca cca gac gaa atc aaa gct 960Lys Asp Gln Asn Gly Lys Tyr Leu Val Thr Pro Asp Glu Ile Lys Ala305 310 315 320caa tgc gta gaa ttt tgt ata gca gcg att gat aat ccg gca aat aac 1008Gln Cys Val Glu Phe Cys Ile Ala Ala Ile Asp Asn Pro Ala Asn Asn325 330 335atg gag tgg aca ctt ggg gaa atg tta aag aac ccg gag att ctt aga 1056Met Glu Trp Thr Leu Gly Glu Met Leu Lys Asn Pro Glu Ile Leu Arg340 345 350aaa gct ctg aag gag ttg gat gaa gta gtt gga aga gac agg ctt gtg 1104Lys Ala Leu Lys Glu Leu Asp Glu Val Val Gly Arg Asp Arg Leu Val355 360 365caa gaa tca gac ata cca aat cta aac tac tta aaa gct tgt tgt aga 1152Gln Glu Ser Asp Ile Pro Asn Leu Asn Tyr Leu Lys Ala Cys Cys Arg370 375 380gaa aca ttc aga att cac cca agt gct cat tat gtc cct tcc cat ctt 1200Glu Thr Phe Arg Ile His Pro Ser Ala His Tyr Val Pro Ser His Leu385 390395 400gcg cgt caa gat acc acc ctt ggg ggt tat ttc att ccc aaa ggt agc 1248Ala Arg Gln Asp Thr Thr Leu Gly Gly Tyr Phe Ile Pro Lys Gly Ser405410 415cac att cat gta tgc cgc cct gga cta ggt cgt aac cct aaa ata tgg 1296His Ile His Val Cys Arg Pro Gly Leu Gly Arg Asn Pro Lys Ile Trp420 425 430aaa gat cca ttg gta tac aaa ccg gag cgt cac ctc caa gga gac gga 1344Lys Asp Pro Leu Val Tyr Lys Pro Glu Arg His Leu Gln Gly Asp Gly
435440 445atc aca aaa gag gtt act ctg gtg gaa aca gag atg cgt ttt gtc tcg 1392Ile Thr Lys Glu Val Thr Leu Val Glu Thr Glu Met Arg Phe Val Ser450 455 460ttt agc acc ggt cga cgt ggc tgc atc ggt gtt aaa gtc ggg acg atc 1440Phe Ser Thr Gly Arg Arg Gly Cys Ile Gly Val Lys Val Gly Thr Ile465 470 475 480atg atg gtt atg ttg ttg gct agg ttt ctt caa ggg ttt aac tgg aaa 1488Met Met Val Met Leu Leu Ala Arg Phe Leu Gln Gly Phe Asn Trp Lys485 490 495ctc cat caa gat ttt gga ccg tta agc ctc gag gaa gat gat gca tca 1536Leu His Gln Asp Phe Gly Pro Leu Ser Leu Glu Glu Asp Asp Ala Ser500 505 510ttg ctt atg gct aaa cct ctt cac ttg tcc gtt gag cca cgc ttg gca 1584Leu Leu Met Ala Lys Pro Leu His Leu Ser Val Glu Pro Arg Leu Ala515 520 525cca aac ctt tat cca aag ttc cgt cct taa 1614Pro Asn Leu Tyr Pro Lys Phe Arg Pro530 535<210>2<211>537<212>PRT<213>擬南芥<400>2Met Ser Phe Thr Thr Ser Leu Pro Tyr Pro Phe His Ile Leu Leu Val1 5 10 15Phe Ile Leu Ser Met Ala Ser Ile Thr Leu Leu Gly Arg Ile Leu Ser20 25 30Arg Pro Thr Lys Thr Lys Asp Arg Ser Cys Gln Leu Pro Pro Gly Pro35 40 45Pro Gly Trp Pro Ile Leu Gly Asn Leu Pro Glu Leu Phe Met Thr Arg5055 60Pro Arg Ser Lys Tyr Phe Arg Leu Ala Met Lys Glu Leu Lys Thr Asp65 70 75 80Ile Ala Cys Phe Asn Phe Ala Gly Ile Arg Ala Ile Thr Ile Asn Ser85 90 95Asp Glu Ser Ala Arg Glu Ala Phe Arg Glu Arg Asp Ala Asp Leu Ala100 105 110Asp Arg Pro Gln Leu Phe Ile Met Glu Thr Ile Gly Asp Asn Tyr Lys115 120 125Ser Met Gly I1e Ser Pro Tyr Gly Glu Gln Phe Met Lys Met Lys Arg130 135140Val Ile Thr Thr Glu Ile Met Ser Val Lys Thr Leu Lys Met Leu Glu145 150155160Ala Ala Arg Thr Ile Glu Ala Asp Asn Leu Ile Ala Tyr Val His Ser165 170 175Met Tyr Gln Arg Ser Glu Thr Val Asp Val Arg Glu Leu Ser Arg Val180 185 190Tyr Gly Tyr Ala Val Thr Met Arg Met Leu Phe Gly Arg Arg His Val195 200 205Thr Lys Glu Asn Val Phe Ser Asp Asp Gly Arg Leu Gly Asn Ala Glu210 215 220Lys His His Leu Glu Val Ile Phe Asn Thr Leu Asn Cys Leu Pro Ser225 230235 240Phe Ser Pro Ala Asp Tyr Val GLU Arg Trp Leu Arg Gly Trp Asn Val245 250 255Asp Gly Gln Glu Lys Arg Val Thr Glu Asn Cys Asn Ile Val Arg Ser260 265 270Tyr Asn Asn Pro Ile Ile Asp Glu Arg Val Gln Leu Trp Arg Glu Glu275 280 285Gly Gly Lys Ala Ala Val Glu Asp Trp Leu Asp Thr Phe Ile Thr Leu290 295 300Lys Asp Gln Asn Gly Lys Tyr Leu Val Thr Pro Asp Glu Ile Lys Ala305 310315 320Gln Cys Val Glu Phe Cys Ile Ala Ala Ile Asp Asn Pro Ala Asn Asn325330 335Met Glu Trp Thr Leu Gly Glu Met Leu Lys Asn Pro Glu Ile Leu Arg340 345 350Lys Ala Leu Lys Glu Leu Asp Glu Val Val Gly Arg Asp Arg Leu Val355 360 365Gln Glu Ser Asp Ile Pro Asn Leu Asn Tyr Leu Lys Ala Cys Cys Arg370 375 380Glu Thr Phe Arg Ile His Pro Ser Ala His Tyr Val Pro Ser His Leu385 390 395 400Ala Arg Gln Asp Thr Thr Leu Gly Gly Tyr Phe Ile Pro Lys Gly Ser405 410 415His Ile His Val Cys Arg Pro Gly Leu Gly Arg Asn Pro Lys Ile Trp420 425 430Lys Asp Pro Leu Val Tyr Lys Pro Glu Arg His Leu Gln Gly Asp Gly435 440 445Ile Thr Lys Glu Val Thr Leu Val Glu Thr Glu Met Arg Phe Val Ser450 455 460Phe Ser Thr Gly Arg Arg Gly Cys Ile Gly Val Lys Val Gly Thr Ile465 470 475 480Met Met Val Met Leu Leu Ala Arg Phe Leu Gln Gly Phe Asn Trp Lys485 490 495Leu His Gln Asp Phe Gly Pro Leu Ser Leu Glu Glu Asp Asp Ala Ser500 505 510Leu Leu Met Ala Lys Pro Leu His Leu Ser Val Glu Pro Arg Leu Ala515 520 525Pro Asn Leu Tyr Pro Lys Phe Arg Pro530 53權利要求
1.具有SEQ ID NO1的核苷酸序列的分離的DNA。
2.一種核酸分子，其序列與SEQ ID NO1的DNA的任何8個或更多個連續核苷酸的序列的相同或互補。
3.權利要求2的核酸分子，其中所述序列與SEQ ID NO1的DNA的任何13個或更多個連續核苷酸的序列的相同或互補。
4.用在操縱性植物活性啟動子控制下的權利要求1、2或3的DNA轉化的植物細胞。
5.改變含有SPS基因的植物的生長或發育的方法，包括調節SPS基因的表達。
6.權利要求5的方法，其中通過用與植物活性啟動子可操縱連接的一種核酸轉化植物而降低SPS表達，所述核酸編碼抑制SPS基因表達的反義RNA或核酶。
7.權利要求5的方法，其中通過用與植物活性啟動子可操縱連接的SPS基因轉化植物而增加SPS表達。
8.分離編碼細胞激動素代謝酶的植物基因的方法，包括在所述植物基因組中鑒別與SEQ ID NO1具有至少80％同源性的編碼序列，以及制備具有所述編碼序列的核酸。
9.權利要求8的方法，其中所述編碼序列與SEQ ID NO1具有至少90％同源性。
10.分離編碼細胞激動素代謝酶的植物基因的方法，包括用兩種不同的權利要求3中定義的核酸分子作為引物擴增所述植物基因組中的靶序列，鑒別具有所述編碼序列的基因，以及制備具有所述基因編碼序列的核酸。
全文摘要
本發明涉及編碼稱為SPS的細胞激動素代謝酶的基因,其是從擬南芥屬突變體sps中分離得到。sps突變體顯示異常分枝模式和發育程序。SPS基因具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列。本發明還公開了分離編碼細胞激動素代謝酶的植物基因的方法。另外,本發明還包括用與植物活性啟動子可操縱相連的SPS基因轉化的新植物,以及改變含有SPS基因的植物的生長或發育的方法。
文檔編號C07K14/415GK1364196SQ00810763
公開日2002年8月14日 申請日期2000年5月23日 優先權日2000年5月23日
發明者文凱特桑·孫戴爾桑, 蒂蒂馬·坦蒂甘乍那 申請人:分子農業生物學院