結核分枝桿菌Rv1909c基因在制備治療結核分枝桿菌潛伏感染的藥物中的用圖
【專利摘要】本發明屬于生物技術領域，具體涉及結核分枝桿菌Rv1909c基因在制備治療結核分枝桿菌潛伏感染的藥物中的新用途。研究表明Rv1909c在結核分枝桿菌進入到潛伏狀態的過程當中具有重要的生物學功能，與正常生長的結核分枝桿菌相比，Rv1909c基因的高表達抑制了結核分枝桿菌的生長。本發明還公開了以此基因為靶標檢測潛伏期結核病的試劑盒以及以此基因構建的預防及治療潛伏感染結核分枝桿菌的疫苗。
【專利說明】
結核分枝桿菌Rv1909c基因在制備治療結核分枝桿菌潛伏感染的藥物中的用途
技術領域
[0001]本發明屬于生物技術領域，具體涉及結核分枝桿菌RV1909C基因在治療結核分枝桿菌潛伏感染藥物中的新用途。本發明還涉及以此基因構建的預防及治療潛伏感染結核分枝桿菌的疫苗。
【背景技術】
[0002]結核分枝桿菌是引起結核病的病原菌。據世界衛生組織的報道，世界上有1/3的人口感染了結核分枝桿菌，每年有至少300萬人死于該病。結核病至今仍為十分重要的傳染病。結核分枝桿菌成功的一大原因主要是其能在宿主細胞內長期潛伏，它對缺氧條件的有著很好適應。感染了宿主之后，結核分枝桿菌將會很快進入休眠狀態，待宿主的免疫系統發生缺陷時，便會攻擊宿主。大部分的感染者都是處于休眠期的結核分枝桿菌，而這個比例隨著人口的增長還在不停的增長當中。
[0003]結核病的臨床診斷主要有痰結核分枝桿菌檢查、結核菌素實驗。其中，分枝桿菌菌型的鑒定常根據培養特征(菌落形態等)和一系列的生化反應來確定。由于分枝桿菌的生化反應經常發生變化，這為其鑒定帶來了不確定性。潛伏期的結核分枝桿菌往往更難以在臨床上鑒定出來。因此尋找可以鑒定潛伏期結核病的診斷靶，對于結核病的早期診斷和治療有著重要的意義。
[0004]結核分枝桿菌Rvl909c基因是結核分枝桿菌的一個金屬調控蛋白，屬于furA家族。在潛伏狀態下的結核分枝桿菌中Rvl909c的表達量會有明顯提高，并且將Rvl909c高表達之后，會抑制結核分枝桿菌的生長。因此檢測Rvl909c的表達量對于結核病的早期診斷、治療都有著潛在的價值。
[0005]傳統的基因檢測技術主要運用聚合酶鏈反應(PCR)或逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)的方法大量擴增待測基因，然后通過溴化乙錠染色和瓊脂糖凝膠電泳定量待測基因。以上方法有著極高的高靈敏度，但基于PCR反應的特點，反應終點的產物量往往無法正確反映反應初始階段DNA的含量，因此定量不夠精確，同時其檢測的分辨率也不高，DNA的量的差異如果低于五倍，往往檢測不出。近年來不斷完善的實時定量PCR技術，在PCR反應體系中加入了熒光基團，利用熒光信號的積累監控整個PCR的進程，最后通過Ct值和標準曲線對樣品中的DNA精確定量。由于只對指數期反應的產物進行檢測和熒光基團的信號放大作用，它克服了傳統PCR的定量不精確，分辨率低的缺點。

【發明內容】

[0006]本發明的目的在于，針對現有技術存在的問題，提供結核分枝桿菌Rvl909c基因在治療結核分枝桿菌潛伏感染藥物或者制劑中的新用途。本發明還涉及以此基因構建的預防及治療潛伏感染結核分枝桿菌的疫苗。
[0007]本發明中，所述結核分枝桿菌Rvl909c基因作為針對結核分枝桿菌細胞的作用靶標。
[0008]進一步，所述針對潛伏結核分枝桿菌細胞的作用靶標為疫苗作用靶標。
[0009]本發明中，所述的治療或診斷潛伏結核分枝桿菌的藥物或者制劑中，含有結核分枝桿菌Rvl909c基因的疫苗。
[0010]本發明通過結核分枝桿菌RV1909C基因與結核分枝桿菌的潛伏狀態之間的相關性，并結合改良后的實時定量PCR技術，提供一種準確性高，檢測速度快的結核分枝桿菌潛伏狀態熒光實時定量試劑盒
[0011]本發明檢測試劑盒包含:2X逆轉錄反應液，20X逆轉錄酶，DEPC-H20，2XPCR反應液，20X檢測用引物、熒光探針，標準品。
[0012]其中2X 逆轉錄反應液含有 RT 緩沖液、DEPC-H20、Oligo (dT)、dNTPs、Rnasin。
[0013]其中2 XPCR 反應含有 PCR 緩沖液，MgCl2, dNTPs, Taq 酶。
[0014]檢測用引物:
[0015]Rvl909c 上游引物序列:5，TCA CAT CGT CTG CCG GTC TTG 3’
[0016]Rvl909c 下游引物序列:5，TTA TGG TCC GAG GCC GTC AG 3’
[0017]熒光探針:
[0018]Rvl909c 熒光探針:5 1 -FAM-GCC AAC AGC ACA GTC GAC AT-TAMRA-3 1
[0019]2 X逆轉錄反應液，2 X PCR反應液，DEPC-H20保存于4°C，20 X逆轉錄酶，20 X檢測用引物、熒光探針保存于_20°C ；
[0020]標準品為結核分枝桿菌H37Rv菌株的cDNA。
[0021]本發明的進一步目的是提供通過檢測結核分枝桿菌Rvl909c基因的表達量來檢測潛伏狀態的結核分枝桿菌的方法。
[0022]本發明使用檢測試劑盒通過下述方法檢測結核分枝桿菌Rvl909c基因的表達量:
[0023]每次檢測設立陽性和陰性對照，標準品可做陽性對照，也可使用制備的結核分枝桿菌DNA樣本，陰性對照用DEPC-H20 ；
[0024]逆轉錄:總體積20 μ 1，其中2 μ I待測RNA，10 μ I 2Χ逆轉錄反應液，I μ I 20X逆轉錄酶，7 μ I DEPC-H20。25°C 10 分鐘，37°C 120 分鐘；
[0025]擴增:在熒光定量PCR以上進行，總體積為10μ1，其中2μ1檢測樣品，5μ 12XPCR反應液，0.5μ I 20Χ檢測用引物、熒光探針，2.5 μ I DEPC-H20 ;
[0026]反應條件:95°C 10分鐘變性，95°C 15秒、60°C I分鐘進行40個循環。
[0027]本發明的試劑盒具有如下特點:
[0028]利用Taqman技術檢測Rvl909c表達的方法，經檢測患者表明該方法切實可行；由于本方法采用了 PCR擴增技術，使得Rvl909c表達的檢測敏感性明顯提高，可以在極少的標本中獲得足夠的信息，而且由于熒光探針的應用使得特異性也明顯提高，降低了常規PCR擴增的假陽性率，其中所設計的引物、探針以及檢測結果可以為熒光定量PCR檢測試劑盒的開發提供可靠的依據。
[0029]本發明的另一個目的是提供一種構建進入治療潛伏狀態的結核分枝桿菌的一種疫苗的載體，構建有結核分枝桿菌Rvl909c基因的pMV361載體。
[0030]本發明的另一個目的是提供治療潛伏狀態的結核分枝桿菌的一種轉入構建有結核分枝桿菌Rvl909c基因的pMV361質粒的重組卡介苗。
[0031]本發明的另一個目的是提供治療潛伏狀態的結核分枝桿菌的一種重組亞單位疫苗，構建有結核分枝桿菌Rvl909c基因的pcDNA3.1+載體。
[0032]本發明優點是，
[0033]采用目前特異性最高的的熒光探針雜交定量PCR檢測技術，在保持高敏感性的前提下盡量減少假陽性干擾；克服了現有技術中PCR模板的無法精確定量，以及將PCR產物電泳結果進行計算機圖像處理后確定最終PCR產物的量的應不穩定因素給結果分析帶來影響的缺陷；做到對PCR模板的精確定量，且不僅保持了常規PCR的高靈敏性，而且檢測基因的特異性明顯提高。
[0034]本發明結合附圖和具體實施例做進一步說明。應理解，實施例僅用于說明目的，而不用于限制本發明范圍。
【附圖說明】
[0035]圖1顯示以結核分枝桿菌H37Rv基因組為模板，PCR擴增Rvl909c基因并將其克隆構建入大腸桿菌一結核分枝桿菌穿梭質粒pMV261中。
[0036]圖2顯示高表達質粒pMV261-Rvl909c在厭氧與正常情況下對H37Rv生長狀況的影響.
[0037]圖3顯示以結核分枝桿菌H37Rv株基因組DNA為模板，PCR擴增Rvl909c基因并將其克隆構建入大腸桿菌一結核分枝桿菌穿梭質粒PMV361中。
[0038]圖4顯示以結核分枝桿菌Rvl909c基因構建的重組亞單位疫苗.
[0039]圖5顯示以結核分枝桿菌H37Rv株基因組DNA為模板，PCR擴增基因并將其克隆構建圖。
【具體實施方式】
[0040]實施例1:在厭氧以及正常情況下高表達結核分枝桿菌Rvl909c基因能夠抑制結核分枝桿菌的生長
[0041]一、構建結核分枝桿菌Rvl909c基因高表達質粒
[0042]以結核分枝桿菌H37Rv基因組為模板，PCR擴增Rvl909c基因并將其克隆構建入大腸桿菌一結核分枝桿菌穿梭質粒PMV261中(如圖1所示)，轉化至大腸桿菌DH5a感受態細胞中，轉化液涂布在含有0.05mg/ml的卡那霉素的固體LB培養基平板上，37°C倒置培養，篩選陽性克隆，挑取單克隆菌落，接種至3ml含卡那霉素的液體LB培養基，37°C震蕩過夜，菌液抽提質粒進彳丁測序，測序正確的質粒即為構建好的Rvl909c基因聞表達質粒pMV261-Rvl909c ；
[0043]二、高表達質粒pMV261-Rvl909c在厭氧與正常情況下對H37Rv生長狀況的影響
[0044]將抽提出的質粒電轉進入H37Rv中，分別在低氧與正常的情況下培養，低氧模型采取的是wayne模型，漸次低氧，能夠真實的模擬肉芽腫微環境。同時每天檢測菌濃度OD值的變化，并繪制成生長曲線(如圖2所示)，結果顯示，無論是有氧培養還是厭氧模型下培養的H37Rv，高表達的Rvl909c基因的質粒對菌株的生長都有非常明顯的抑制作用。
[0045]實施例2:以結核分枝桿菌Rvl909c基因構建的重組卡介苗
[0046]一、重組卡介苗的構建
[0047]以結核分枝桿菌H37Rv株基因組DNA為模板，PCR擴增Rvl909c基因并將其克隆構建入大腸桿菌一結核分枝桿菌穿梭質粒PMV361中(如圖3所示)，卡介苗復蘇后，接種至400ml 7H9(添加10% ADC和甘油)培養基中培養10-14天，在對數生長期，加入20%甘氨酸10ml至終濃度4%，繼續培養24h，玻璃珠打碎菌膜，用10%甘油洗滌制備卡介苗感受態細胞，感受態細胞轉入電穿孔杯中，在2.5kv/cm,25yF, 1000歐姆下進行電轉化，轉化液加入15ml 7H9(添加10%々0(:、甘油和了￥661180)培養基，37°C培養過夜，離心后取菌液125 μ I分別涂布于含卡那霉素的7Η10平板上，37°C靜置培養，篩選陽性克隆，繼續培養該陽性克隆，提取細菌裂解產物，用Rvl909c抗血清Western blot分析Rvl909c表達；
[0048]二、重組卡介苗免疫性分析
[0049]將上述菌苗注射C57BL/C小鼠，同時設置卡介苗(BCG)和PBS組做為對照。免疫6周后取血ELISA法檢測血清抗體表達水平，無菌分離脾臟，應用ELISP0T技術檢測脾細胞受到Rvl909c蛋白刺激后細胞因子的表達，它們分別反映了疫苗免疫后體液免疫和細胞免疫的水平；
[0050]三、重組卡介苗動物免疫保護性分析
[0051]將上述菌苗免疫BalB/c小鼠，同時設置卡介苗(BCG)和PBS組做為對照，接種8周后，用M.tb H37Rv株攻毒，計數不同時間點小鼠體內活菌載量，比較小鼠存活曲線；
[0052]四、重組卡介苗安全性評價分析
[0053]將上述菌苗免疫SCID小鼠，同時設置卡介苗(BCG)和PBS組做為對照，計數不同時間點小鼠體內活菌載量，比較小鼠存活曲線。
[0054]實施例3:以結核分枝桿菌Rvl909c基因構建的重組亞單位疫苗
[0055]一、重組質粒的構建
[0056]以結核分枝桿菌H37Rv株基因組DNA為模板，PCR擴增Rvl909c基因并將其克隆構建入真核表達質粒載體pcDNA3.1+中(如圖4所示)，測序鑒定。制備E.coliDH5a感受態細胞，鑒定正確的pcDNA-Rvl909c基因重組質粒轉化入感受態細胞，在LB培養基，37°C培養過夜。重組質粒的大量抽提采用Qiagan公司去內毒素的質粒大量抽提試劑盒；
[0057]二、重組亞單位疫苗免疫保護性分析
[0058]將上述亞單位疫苗免疫BalB/c小鼠，每兩周免疫一次，共免疫3次，同時設置PBS組做為對照。最后一次免疫4周后，M.tb H37Rv株攻毒。計數不同時間點小鼠體內活菌載量，比較小鼠存活曲線。
【主權項】
1.結核分枝桿菌Rvl909c基因在制備治療或診斷潛伏結核分枝桿菌的藥物或制劑中的用途。2.如權利要求1中所述用途，其特征在于，所述結核分枝桿菌Rvl909c基因作為針對結核分枝桿菌細胞的作用靶標。3.如權利要求2中所述用途，其特征在于，所述針對潛伏結核分枝桿菌細胞的作用靶標為疫苗作用靶標。4.如權利要求1-3中任一所述的用途，其特征在于，所述的治療或診斷潛伏結核分枝桿菌的藥物或者制劑中，含有結核分枝桿菌Rvl909c基因的疫苗。5.實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應檢測潛伏狀態結核分枝桿菌中Rvl909c基因的試劑盒，含有2 X逆轉錄反應液，20 X逆轉錄酶，焦碳酸乙二酯處理的水，2 X聚合酶鏈反應液，20X檢測用引物、熒光探針，標準品，其特征是:所述的2X逆轉錄反應液含有逆轉錄緩沖液、焦碳酸乙二酯處理的水、寡聚(dT)、dNTPs、RNA酶抑制劑，所述的2X聚合酶鏈反應液含有聚合酶鏈緩沖液、耐熱DNA聚合酶，MgCl2, dNTPs。6.根據權利要求5所述的試劑盒，其特征是:所述的20X檢測用引物、熒光探針，含有Rvl909c上游引物、下游引物、熒光探針，其中: Rvl909c 上游引物序列:5，TCA CAT CGT CTG CCG GTC TTG 3’ Rvl909c 下游引物序列:5' TTA TGG TCC GAG GCC GTC AG 3’ Rvl909c 熒光探針:5 1 -FAM-GCC AAC AGC ACA GTC GAC AT-TAMRA-3 1。7.根據權利要求5所述的試劑盒，其特征是:所述的標準品是為潛伏狀態結核分枝桿菌 H37Rv 的 cDNA。8.一種結核分枝桿菌Rvl909c基因構建的重組卡介苗，其特征在于，其帶有結核分枝桿菌Rvl909c基因的pMV361重組質粒。9.如權利要求8中所述結核分枝桿菌Rvl909c基因的重組卡介苗，其特征在于，其中將帶有結核分枝桿菌Rvl909c基因的pMV361重組質粒轉入BCG中構建的重組卡介苗。10.一種結核分枝桿菌Rvl909c基因構建的重組亞單位疫苗，其特征在于，其帶有結核分枝桿菌Rvl909c基因的pcDNA3.1+重組質粒。
【文檔編號】A61K39/04GK105861634SQ201510025299
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2015年1月19日
【發明人】孫嫻, 李瑤, 姜君, 張鷺, 吳海, 劉軍
【申請人】復旦大學