結核分枝桿菌Rv3457c重組蛋白、制備方法及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物醫藥體外診斷試劑領域，特別設及一種新型結核病T細胞免疫標 志物Rv3457c的重組蛋白、其制備方法及其在細胞免疫診斷中的應用。
【背景技術】
[0002] 結核病由病原體一-結核分枝桿菌感染機體所致，至今仍為人類重要的傳染病。 快速、準確的診斷結核分枝桿菌（MTB)感染，對于結核病的控制具有重要意義。MTB感染的 診斷方法有很多，目前臨床最為常用的方法仍然依靠傳統的疲涂片細菌學檢查，但檢出率 低；MTB培養可做為結核病確診的"金標準"，但其培養時間太長，一般4-6周，難W滿足臨床 需要；Bactec技術雖縮短了培養時間，但費用較高，短時間內難W推廣普及；X線和CT檢查 僅提供影像學可能性診斷；聚合酶鏈反應（PCR)技術及其它基因診斷方法作為臨床診斷尚 存在操作復雜，對技術和人員專業素質要求較高，且仍不能用于菌陰結核病的快速診斷。抗 結核免疫主要是細胞免疫，包括致敏的T淋己細胞和被激活的巨隧細胞。致敏的T淋己細 胞可直接殺死帶有結核桿菌的祀細胞，同時對釋放多種作用于世隧細胞的淋己因子，使巨 隧細胞聚集在病灶周圍形成W單核細胞為主的增生性炎癥。被激活的巨隧細胞極大地增強 對結核桿菌的吞隧消化，抑制繁殖，阻止擴散，甚至銷毀的能力，充分發揮細胞免疫的作用。 目前廣泛應用的結核病細胞免疫診斷技術仍依賴于皮試檢測試劑---結核分枝桿菌純蛋 白衍生物（PPD)。然而PPD存在與環境分枝桿菌W及BCG疫苗株的交叉反應，所W診斷價值 偏低。因而發現新的結核病T細胞免疫標志物，并建立新的結核病細胞免疫診斷方法是結 核病診斷所亟需的。

【發明內容】

[0003] 為克服現有技術的問題，本發明的目的在于一種結核分枝桿菌Rv3457c重組蛋 白、制備方法及其應用。
[0004] 本發明提供一種結核分枝桿菌Rv3457c重組蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO: 1 所示。 陽0化]本發明的結核分枝桿菌Rv3457c重組蛋白通過使用祀T28a質粒，在Rv3457c該天 然蛋白序列前面加了一段化S?Tag純化標簽獲得。所述化S?Tag純化標簽的氨基酸序列 由SEQIDNO: 1中從氨基末端第1至第17位氨基酸殘基序列組成。SEQIDNO: 1中從氨基 末端第18至第364位氨基酸殘基序列組成天然Rv3457c蛋白氨基酸序列。
[0006] 本發明還提供一種編碼上述結核分枝桿菌Rv3457c重組蛋白的基因，其具有如下 所示的核巧酸序列：
[0007] ①如沈Q ID NO:2所示的核巧酸序列；
[0008] ②不同于SEQIDNO: 2但編碼的氨基酸序列與SEQIDNO: 2所編碼的氨基酸序列 相同的核巧酸序列；
[0009] ③在嚴格雜交條件下與上述①或②中的序列雜交，并且編碼具有所述結核分枝桿 菌Rv3457c重組蛋白活性的核巧酸序列。
[0010] 本發明的一個方面，提供了一種包含所述結核分枝桿菌Rv3457c基因的重組 質粒，即將Rv3457c基因序列插入商用表達質粒序列中。Rv3457c基因NCBI登陸號 為：NC_000962. 3;蛋白號為：NP_217974. 1。
[0011] 本發明的"Rv3457c基因序列"也包括對NC_000962. 3中一個或多個密碼子被 編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產生的序列。由于密碼子的簡并性，所W與 NC_000962. 3核巧酸序列同源性低至約70 %的簡并序列也能編碼相同的氨基酸序列。該術 語還包括在中度嚴密條件下，更佳地在高度嚴密條件下與NC_000962. 3的核巧酸序列雜交 的核巧酸序列。該術語還包括與NC_000962. 3的核巧酸序列同源性至少70%，更佳地至少 90 %的核巧酸序列。
[0012] 本發明的重組質粒，通常將Rv3457c基因插入表達質粒的多克隆位點處得到。
[0013] 本發明的重組質粒在制備過程中，可選用本領域已知的各種載體，然后將編碼本 發明的核巧酸序列可操作性地連接于表達調控序列，從而形成蛋白表達載體。
[0014] 本發明中可采用的載體有祀T28a等。本發明的一個實施例中，所用的質粒為 pET28a〇
[0015] 本發明還提供一種結核分枝桿菌Rv3457c重組蛋白的制備方法，包括W下步驟：
[0016] (1)制備結核分枝桿菌菌株基因組DNA;
[0017] (2)擴增結核分枝桿菌Rv3457c基因；
[0018] (3)結核分枝桿菌Rv3457c基因插入表達質粒；
[0019] (4)將構建的表達質粒轉化入宿主細胞；
[0020] (5)誘導表達結核分枝桿菌Rv3457c蛋白；
[0021] (6)分離純化誘導表達產物，得到結核分枝桿菌Rv3457c重組蛋白； W22] 其中，在制備結核分枝桿菌Rv3457c基因中采用的引物為Rv3457c-F和Rv3457c-R，所述引物Rv3457c-F的核巧酸序列如沈QIDNo:3所示，所述引物Rv3457c-R 的核巧酸序列如SEQIDNo:4所示。
[0023] 上述制備方法中，各種實驗參數均按常規操作選擇，可視具體實驗條件而定。
[0024] 本發明的Rv3457c基因序列可W用PCR擴增法獲得。可根據本發明所公開的相關 核巧酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，并用本領域技術人員已知的常規方法所 制備的基因組DNA為模板，擴增而得到相關序列。
[00巧]本發明中，重組蛋白所用的表達質粒可W是祀T28a等。 陽0%] 本發明中，表達Rv3457c蛋白所用的宿主細胞為大腸桿菌的化2UDE3)菌株或 化21plysS值E3)菌株。
[0027] 本發明中，誘導表達Rv3457c蛋白可采用多種方法，如使用異丙基-P-D-硫代化 喃半乳糖巧（IPTG)。
[0028] 本發明中，分離純化重組Rv3457c蛋白也可采用多種方法，如親和層析、離子交換 層析等。
[0029] 本發明還提供一種上述結核分枝桿菌Rv3457c重組蛋白在制備檢測或診斷結核 病的試劑中的應用。本發明還提供一種上述結核分枝桿菌RV3457C重組蛋白、其特異性抗 體或其基因引物在制備結核病檢測試劑盒中的應用。本發明進一步提供一種結核病檢測試 劑盒，其組分中的檢測抗原是所述結核分枝桿菌Rv3457c重組蛋白。
[0030] 本發明的有益效果在于：
[0031] (1)與天然結核分枝桿菌Rv3457c蛋白相比，該重組蛋白更易采用親和層析的方 法進行純化，純度可達90%W上，不僅大大降低了其生產成本，而且也具有更高的穩定性， 該重組蛋白在不凍干的情況下4°C可保存1周，-20°C可保存3個月，-80°C至少保存1年；
[0032] (2)本發明基于免疫組學的研究成果，首次報道了RV3457C特異性抗原可W應用 于結核病診斷，且是一個活性較強的T細胞祀抗原，用于結核病細胞免疫學診斷，具有較高 的敏感性高，而且相比皮試試驗，更為快速和安全可靠。
【附圖說明】
[0033] 圖1是重組蛋白Rv3457c經進一步純化及濃縮后的SDS-PAGE圖。1是蛋白分子量 標準，2誘導前菌體巧yg)，3是誘導后菌體巧yg)，4是純化后的目的蛋白巧yg)。
[0034]圖 2 是抗原ESAT-6,CFP-IO和Rv3457c評估試驗。
【具體實施方式】
[0035] 下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，運些實施例僅用于說明本發明 而不用于限制本發明的范圍。本發明的其它方面由于本文的公開內容，對本領域的技術人 員而言是顯而易見的，下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按 照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。
[0036] 除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意 義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發明中。文中所 述的較佳實施方法與材料僅作示范之用，但不能限制本方面的內容。
[0037] 實施例1重組質粒祀T28a-Rv3457c的構建 陽〇3引（1)祀基因引物設計
[0039]Rv：M57c-F(SEQIDNo:3):GGAATTCCATATGCTGATCTCACAGCGCCCCACCCTGTC;
[0040] Rv：M57c-R (沈Q ID No:4) :CCGCTCGAGAGGACTACGCCGAAACCGAACAGCTT
[0041] 酶切位點分別為Nde lahol。 陽0創似祀基因的PCR擴增、克隆及序列測定 陽0創 W結核分枝桿菌&柳基因組DNA為模板，Rv3457c-F和Rv3457c-R為引物，應用 Taq酶（寶生物工程（大連）有限公司），通過PCR直接擴增Rv3457c蛋白基因。PCR反應 條件：94°C預變性5min ; (94°C，30s ;58°C，30s ;72°C，40s) 35個循環；72°C延伸5min ;4°C保 存。反應結束后用1%瓊脂糖凝膠電泳分離目的片段，后用DM回收試劑盒（Invitrogen) 回收。用Nde I和化Ol酶切，克隆構建入祀T28a質粒Nde I和化Ol酶切位點中。測序表 明所插入的序列和GeneBank中冊7Rv結核全基因組相應基因序列（Rv3457c基因NCBI登 陸號為：NC_000962. 3 ;蛋白號為：NP_217974. 1)完全一致。
[0044] 實施例2重組蛋白Rv3457c的誘導表達及純化
[0045] 將裝有IOOy1BL2UDE3)地ysS感受態細胞燈IANGEN)的e卵do計管 從-80°C冰箱立即放入冰上。3-5分鐘后等管內液體融化后，將0. 5y1測序正確的重組 pET32a-Rv3457c質粒放入感受態細胞中，冰上放置45min，42°C水浴鍋中，熱擊90s，冰上靜 置3min，加入500iiI的不含抗生素的預熱的LB培養基，37°C搖床，220rmp，培養45-60min。 取一定量在含卡那霉素的固體LB培養基平皿上涂布，室溫干燥后倒置于37°C溫箱中培養