能特異結合前列腺特異性膜抗原的納米抗體的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及單域重鏈抗體技術(又稱納米抗體技術），以及基因工程抗體技術，特 別是針對前列腺特異性膜抗原的單域重鏈抗體或多肽。 技術背景
[0002] 單域抗體是指由普通抗體可變區（VH或VL)組成的基因工程抗體。單域重鏈抗體 (又稱為納米抗體，VHH 抗體，variable domain of heavy chain of heavy-chain anti body)是指僅由重鏈抗體(heavy-chain antibody)可變區（Variable region)組成的 基因工程抗體，其中，重鏈抗體(heavy-chain antibody)是一種存在于胳盤、藍魚等動物體 內天然缺失輕鏈的抗體。單域重鏈抗體是目前已知的最小的完整抗原結合片段，具有分子 量小、滲透性好等特點，目前已廣泛用于基礎研究、醫學診斷和檢測、抗體藥物開發等領域。
[0003] 前列腺癌是一種嚴重威脅老年男性健康的惡性腫瘤，其早期診斷和治療對于其預 后具有重要的意義。前列腺特異性膜抗原(prostate specific membrane antigen，PSMA) 是一種位于前列腺細胞膜上的II型跨膜糖蛋白，由750個氨基酸組成，分為胞內區（氨基酸 序列為1-18)、跨膜區（19-43)和胞外區（44-750)，相對于傳統用于臨床檢測的前列腺特異 抗原(prostate specific antigen，PSA)，是一種更加敏感和特異的前列腺癌腫瘤標記物， 尤其是在激素難治性前列腺癌及前列腺癌轉移灶中均為高表達，在區分前列腺癌和其他類 型惡性腫瘤的敏感度和特異性分別為65.9%和94.5%。另外，在多種非前列腺來源的實體 瘤，如肺癌、膀胱癌、胃癌、胰腺癌、腎癌和結直腸癌等，PSMA也高度特異地表達于腫瘤血管 內皮細胞上。而且本身具有神經羧基肽酶和葉酸水解酶的活性，加之707個氨基酸組成的胞 外區能夠提供多個抗原表位等特點，使其成為了腫瘤免疫靶向治療和分子影像學中重要的 研究靶點。
[0004] 目前，人們發現了多種針對PSMA亦制備了多種能與其發生特異性結合的物質，包 括單克隆抗體7E11、J591，適體A9和A10，重組技術得到的ScFv抗體D7、Fab抗體及人源化抗 體的報道特別是已經通過美國FDA批準用于前列腺癌的診斷和晚期核素治療的lllln-噴地 肽，就是基于針對PSMA的單克隆抗體與放射性核素相連而成。但與單域重鏈抗體相比，這些 配體存在生產成本相對較高，制備過程復雜等缺點。

【發明內容】

[0005] 本發明的目的是提供針對前列腺特異性膜抗原的單域重鏈抗體，可以被用于制備 檢測前列腺特異性膜抗原的試劑和工具。
[0006] 本發明提供一個針對前列腺特異性膜抗原的單域重鏈抗體（即本發明能特異結合 前列腺特異性膜抗原的納米抗體），具有SEQ ID N0.: 1所示的氨基酸序列，其氨基酸序列可 通過標準化的抗體氨基酸序列編號方法（ImMunoGeneTics，MGT)進行編號和結構域的劃 分。
[0007] 本發明提供一種蛋白質或多肽，其特征是包含框架區中的一個或者兩個以上的氨 基酸序列，且至少與一個氨基酸序列具有90 %同源性。
[0008] 本發明提供一種蛋白質或多肽，其特征是包含互補決定區中的一個或者兩個以上 的氨基酸序列，且至少與一個氨基酸序列具有80 %同源性。
[0009] 本發明提供一個核酸分子，其特征是編碼SEQ ID N0.: 1，通過遺傳密碼子可以隨 時獲得該核酸分子的具體序列。該核酸分子的序列如SEQ ID N0. :2。
[0010] 本發明還提供一個核酸分子，其特征是編碼SEQ ID NO.: 1部分結構域，通過遺傳 密碼子可以隨時獲得該核酸分子的具體序列。
[0011] 本發明所提供的核苷酸序列或者至少部分序列可以通過合適的表達系統進行表 達以得到相應的蛋白質或多肽。這些表達系統包括細菌，酵母菌，絲狀真菌，動物細胞，昆蟲 細胞，植物細胞，或無細胞表達系統。
[0012] 本發明還提供一種載體，包含所述核酸序列。由于遺傳密碼子具有簡并性，該核酸 序列可以根據不同的應用目的而不同。
[0013] 本發明還提供一種宿主細胞，包括所述蛋白質或表達載體。
[0014] 本發明還提供一種檢測細胞上前列腺特異性膜抗原的方法，其特征是含有上述蛋 白質或多肽。基于本發明提供的蛋白質或多肽與前列腺特異性膜抗原特異性結合的能力， 建立前列腺特異性膜抗原的檢測方法。其中，優選的方法包括酶聯免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)，焚光免疫法（Fluoroimmunoassay，FIA)，免疫芯片 法，親和層析法和免疫層析法。
[0015] 本發明針對前列腺特異性膜抗原單域重鏈抗體在非疾病診斷治療目的免疫檢測、 以及菌體或抗原富集純化中的應用。
[0016] 本發明所提供的氨基酸序列可以作為前體，通過隨機或定點突變技術進行改造， 能夠獲得性質(水溶性、穩定性、親和力以及特異性等)更好的突變體，用來發展進一步用于 醫藥、工業、農業的蛋白質或多肽。
[0017] 本發明還涉及一種針對前列腺特異性膜抗原的免疫親和吸附材料，包括載體，搭 載在載體上的配基，該材料以針對前列腺特異性膜抗原的單域重鏈抗體作為配基，所述針 對前列腺特異性膜抗原的單域重鏈抗體具有SEQ ID N0.: 1所示的氨基酸序列。所述載體為 磁珠、瓊脂糖凝膠微球、硅膠微球或多孔材料。
[0018] 本發明所敘述的一些術語具有如下含義：
[0019] 同源性:描述兩個或更多氨基酸序列的相似程度，第一個氨基酸序列和第二個氨 基酸序列之間同源性的百分比可以通過【第一個氨基酸序列中與第二個氨基酸序列中相應 位置處的氨基酸序列相同的氨基酸殘基的數量】除以【第一個氨基酸序列中氨基酸總數】在 乘以【100%】來計算，其中第二個氨基酸序列中的某個氨基酸的缺失、插入、替換或添加(與 第一個氨基酸相比）被認為是有差別。備選地，同源性百分比也可以利用已知的用于序列匹 配的計算機運算程序如NCBI Blast獲得。
[0020] 結構域:蛋白質三級結構的基本結構單位，通常具有一定的功能。
[0021 ] IMGT編號：IMGT數據庫（The International ImMunoGeneTics Datbase)中的一種 已經標準化的抗體氨基酸序列編號方法。具體編號方法可以參考文獻（E h r e n m a η，F ·， Q.Kaas，et al.(2010).''IMGT/3D structure-DB and IMGT/DomainGapAlign:a databaseand a tool for immunoglobulins or antibodies ?T cell receptors，MHC， IgSF and MhcSF."Nucleic Acids Res38(Database issue):D301_307.Lefranc，M.P·， C.Pommie，et al · (2003) ·''IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Igsuperfamily V-like domains"Dev comp Immunol 27(1) :55-77.//www. imgt.org/)中的描述。
[0022] 密碼子(codon):又稱為三連體密碼子(triplet code)，指對應于某種氨基酸的核 苷酸三聯體。在轉譯過程中決定該種氨基酸插入生長中多肽鏈的位置。
[0023] 本發明的有益效果:本發明針對前列腺特異性膜抗原的單域重鏈抗體或多肽具有 與前列腺特異性膜抗原特異性結合、可以通過生物學方法大規模生產、成本低、高效、分子 量小、滲透性好等性質，顯示出良好的應用前景。
【附圖說明】
[0024] 圖1菌落PCR產物電泳、重組蛋白電泳和Western Blot鑒定圖。左邊Marker泳道為 DNA分子量標準，泳道1中的菌落PCR片段出現在預期位置。中間為純化后的蛋白進行SDS-PAGE檢測，在預期位置出現明亮條帶。右邊為以抗PSMA單克隆抗體和抗His標簽抗體的 Western Blot鑒定圖。
【具體實施方式】
[0025] 下面通過單域重鏈抗體(多肽)的制備、分析及應用，對本發明做進一步說明，這些 具體實施例不應以任何方式被解釋為限制本發明的應用范圍。
[0026] 實施例1
[0027] 前列腺特異性膜抗原膜外區的真核表達
[0028] 采用RNAiso Plus試劑提取高表達PSMA的LNCaP細胞中總RNA，利用RT-PCR方法得 到編碼PSMA胞外區片段的DNA片段，使用Not I與BamH I兩種限制性內切酶將其插入真核表 達載體pRAG2a，通過T4DNA連接酶連接為重組質粒。重組質粒熱擊轉化到TOP 10感受態細胞 培養過夜，將鑒定正確的克隆送測序驗證。提取陽性克隆的質粒，使用脂質體 Lipofectamine 2000將DNA質粒轉染至HEK-293細胞中培養，于不同時相點收集上清，進行 SDS-PAGE電泳檢測。培養一定時間后，按照HisTrap FF Crude試劑盒操作純化該蛋白。將純 化后的蛋白進行SDS-PAGE后，電轉至PVDF膜上，5 %脫脂奶粉封閉后，分別加入PSMA抗體和 His抗體，4°C過夜;漂洗后，加二抗室溫下孵育lh，再次漂洗，加入顯色液進行顯影(圖1)。 [0029] 實施例2
[0030]抗前列腺特異性膜抗原單域重鏈抗體（即針對抗前列腺特異性膜抗原單域重鏈抗 體)的淘選與鑒定
[0031]采用固相淘選的方法從駝源天然抗體噬菌體展示文庫(為參考文獻:〃涂追，許楊， 劉夏，等.駝源天然單域重鏈抗體庫的構建與鑒定[J].中國生物工程雜志，2011，31 (4): 31 -36."中構建的展示文庫）中淘選針對前列腺特異性膜抗原的單域重鏈抗體。前列腺特異性 膜抗原膜外區的表達按照上述的實施例1進行，第一輪淘選時，采用磷酸鹽緩沖溶液(PBS， pH7.4)稀釋上述合成的PSMA胞外區蛋白至150yg/mL (第2-4輪包被濃度分別為100、50、50μ g/mL)，在酶標板上每孔加入100yL，4°C包被過夜。PBST (含0.5 % Tween 20)洗板5次，3 % BSA-PBS在37°C封閉2h，洗板3次，加入與0.5%BSA-PBS孵育過的噬菌體抗體庫100yL(約含2 X10nCFU)，37°C孵育lh，用PBST洗板5次(逐輪增加3次），再用PBS洗板10次(逐輪增加5次）。 再以10(^1冼脫液(甘氨酸-鹽酸，？!12.2)洗脫吸附的噬菌體(37°(3,51^11)，用5(^1^1^8-HCl(lmol/L，pH 9.0)中和洗脫物，取10yL用于滴度測定，其余洗脫物擴增后用于下一輪淘 選。
[0032]經過四輪淘選后采用濃度為5yg/mL的PSMA胞外區蛋白包被酶標板，洗板、封閉同 上。加入擴增純化的噬菌體克隆37°C孵育15min，100yL/孔，37°C孵育lh。洗板后加入稀釋度 為1: 5000的HRP-anti-M13抗體，lOOyL/孔，37°C孵育 lh JBST洗板5次，加 TMB工作液lOOyL/ 孔，室溫20min，每孔加入50yL硫酸(濃度為2mol/L)終止反應，測定450nm吸光值。以前一輪 擴增的噬菌體抗體庫直接包被酶標板作為陽性對照，以PBS替代噬菌體克隆為空白對照，用 間接phage-EL ISA法測定菌體顆粒的結合活性。