結核分枝桿菌KatG突變基因及其用圖
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種結核分枝桿菌KatG突變基因，以及用于檢測導致結核分枝桿菌 異煙肼耐藥基因 KatG突變c. 906OA的試劑盒，屬于結核病耐藥基因突變檢測技術領域。
【背景技術】
[0002] 結核分枝桿菌引發常見的慢性呼吸道傳播疾病一結核病，主要累及臟器為肺， 此外還會侵犯皮膚、骨骼等全身多個組織和器官，多集中在15-35歲的青壯年發病。核病全 球流行，但發展中國家患病人數相對較多，隨著結核藥物的應用和生活及醫療水平的提高， 結核病的發病率有所降低。近年，抗生素濫用、環境污染和艾滋病等原因導致的結核發病率 和耐藥率均有所增加。根據世界衛生組織（World Health Organization，WHO) 2008年報 道，全球結核病的總耐藥率高達20%，耐多藥率約為5. 3%，而我國調查數據顯示中國肺結核 耐多藥率為8. 3%，可見我國耐藥結核患者的預防和治療工作刻不容緩。
[0003] 自1952年發現異煙肼具有全效能殺結核分枝桿菌復合物以來，無論單獨或聯合 應用該藥對患者進行治療，異煙肼（INH)都是抗結核一線藥物。目前研究表明KatG基因突 變是常見的導致異煙肼耐藥的原因之一。KatG基因編碼結核菌過氧化氫-過氧化物酶，該 酶可激活 INH 為 INH 自由基，INH 自由基與輔酶 I (Nicotinamide adenine dinucleotide， NAD+)形成共價化合物，抑制烯酰基乙酰載體蛋白還原酶(該酶由InhA基因編碼)的功能，進 而阻止細胞壁分枝菌酸的合成，導致病原菌死亡。若KatG基因發生突變，則會阻止INH轉 化為活性物質從而失去作用，導致結核菌產生抗藥性。目前報道的KatG基因的常見突變為 315位(絲氨酸突變為蘇氨酸）和463位(精氨酸突變為亮氨酸）的氨基酸改變，不同國家報 道的數據表明，超過60%的KatG基因突變發生在氨基酸315位點。同時發現KatG基因存 在熱點突變區域，在315位氨基酸附近，還存在多個氨基酸位點的突變。我國對結核桿菌耐 異煙肼的KatG基因的研究也較多，但是多數研究僅針對315和463兩個常見突變位點進行 檢測，這可能導致一些其他突變熱點區的突變位點在檢測時被忽視，從而影響臨床診斷。
[0004] 由于全球獲得性免疫缺陷（AIDS)患者數量的增多，結核作為機會性致病菌，其發 病率也有逐年增多的趨勢。因此對結核患者早期進行診斷，并且對耐藥結核患者的具體耐 藥機制進行確診，提前調整對該類患者的臨床用藥，將大大縮短臨床診斷時間，有助于早期 發現其耐藥機制，特別是對一些耐多藥患者進行突變熱點的基因診斷，從而采取有效的臨 床治療措施，將大大提高該類患者的治愈率。異煙肼是臨床常用抗結核藥物之一，也是一線 常規用藥，因此對結核桿菌耐異煙肼KatG基因的突變熱點區進行基因檢測，將有利于臨床 快速診斷和治療。
[0005] 經文獻檢索，未見與本發明檢測突變位點相同的公開報道。

【發明內容】

[0006] 本發明的目的在于提供一種檢測結核分枝桿菌KatG突變基因的方法，該結核分 枝桿菌KatG突變基因具有c. 906OA突變位點，其核苷酸序列如SEQ ID N0 :3所示。
[0007] 本發明另一目的是提供用于檢測結核分枝桿菌KatG突變基因的試劑盒，該試劑 盒包括用于檢測結核分枝桿菌KatG基因 c. 906OA突變的試劑。
[0008] 所述試劑盒包括核苷酸序列如SEQ ID N0 :1和SEQ ID N0 :2所示的引物。
[0009] 本發明通過檢測來自耐異煙肼結核菌株的樣本中是否存在KatG基因的c. 906OA 突變，從而判斷該患者耐異煙肼藥物的耐藥分子機制；其中c. 906OA突變位點為KatG基因 的突變，該突變導致KatG基因第302位的絲氨酸（Ser)突變為精氨酸（Arg)，這個氨基酸的 改變，影響了藥物異煙肼轉化為活性物質成分，發揮其抗結核分枝桿菌的作用，從而使該菌 株產生耐藥。
[0010] 發明人用候選基因篩查的方法，在中國33株耐異煙肼結核菌株中進行檢測，在一 株耐藥結核菌種發現與耐異煙肼相關的KatG基因新突變c. 906OA ;該突變的頻率為3%，這 說明在耐異煙肼的結核菌株中，KatG基因突變c. 906OA具有一定的發生頻率，因此Kat基 因突變c. 906OA可以作為臨床異煙肼耐藥菌株耐藥分子機制的診斷依據，并且目前，在國 際和國內均未見該突變的報道。
[0011] 本發明用于檢測KatG基因突變c. 906OA的試劑盒，包括用于檢測KatG基因的突 變c. 906OA所需的常規試劑和能選用的用于擴增KatG基因的試劑和PCR引物。
[0012] 用于檢測KatG基因突變c. 906OA的試劑盒，包括以下一種或幾種試劑的組合： (1) 從待檢樣品中提取DNA的試劑； (2) 用于擴增結核菌樣本DNA的KatG基因 c. 906OA突變的PCR引物和相關的PCR反 應試劑； (3) PCR產物純化試劑； (4) 對PCR產物進行直接測序的試劑。
[0013] 用于檢測KatG基因突變c. 906OA的試劑盒，所用的PCR引物為： KatG-F :5' -CCGCCTTTGCTGCTTTCTC-3' KatG-R:5' -GGGGCTGATCTACGTGAAC-3' ； 用于檢測KatG基因突變c. 906OA的試劑盒，所述檢測PCR擴增產物的試劑選自測序 檢測試劑、限制性內切酶長度多態性檢測試劑、序列特異性引物檢測試劑、探針雜交檢測試 劑及SNP分型檢測試劑。
[0014] 采用PCR擴增-直接測序的方法來檢測樣本的突變情況，具體操作步驟如下： (1) 采集待測個體的樣本，為培養的結核菌樣本，提取全基因組DNA ; (2) 以提取的DNA為模板，以本發明設計的針對KatG基因 c. 906OA突變的引物進行突 變區段DNA序列的擴增，得到相應的PCR擴增產物； (3) 將得到的PCR產物純化后，進行直接測序分析，將所測得的序列與KatG基因的正常 序列進行比對，確定c. 906OA突變是否存在； (4) 根據以上實驗結果分析患者是否為KatG基因突變c. 906OA導致的耐異煙肼結核 分枝桿菌菌株； (5) 按照正常編碼序列閱讀框對突變序列進行翻譯，進一步確定p. S302R突變的存在。
[0015] 發明人在收集耐藥結核分枝桿菌進行實驗的過程中，收集到33株耐異煙肼的結 核菌株，在取得患者同意的前提下，對患者感染的結核分枝桿菌進行基因檢測。同時，我們 還收集了患者的基本信息和臨床信息，詳細詢問了其感染和發病過程，建立了結核分枝桿 菌耐藥株的樣本庫。將滅活的結核分枝桿菌凍存于-80°C冰箱。用柱吸附的方法提取結核 菌的基因組DNA，保存于-40°C冰箱，每份DNA樣本具有對應的患者資料和耐藥信息。用引 物設計軟件Primer5和01igo6設計PCR擴增引物，包括了結核菌KatG基因549位到1531 位堿基的DNA片段，用于PCR擴增。PCR擴增產物直接用PCR引物進行正反向測序(測序 所用儀器為ABI公司3730型DNA測序儀)。將得到的序列與GenBank中的序列（序列號： KC692358. 1)進行比對，確定KatG基因突變c. 906OA的存在，按照開放閱讀框進行翻譯，確 定氨基酸突變P. S302R的存在。
[0016] KatG基因 c. 906OA突變的核苷酸和氨基酸序列如下：
[0017] KatG基因 c. 906OA突變的核苷酸和氨基酸序列中，用方框標出的是突變的堿基 和氨基酸，突變前第302位氨基酸是絲氨酸，突變后為精氨酸。該突變位于KatG基因編碼 序列的第906位堿基，由野生型的胞嘧啶（C)變為腺嘌呤（A)，該突變使野生型的KatG蛋白 的第302位絲氨酸突變成精氨酸，導致KatG蛋白的功能發生改變，進而引起異煙肼的耐藥。 KatG基因突變c. 906OA的檢測能夠用遺傳領域的任意一種點突變檢測方法進行，如PCR (聚合酶鏈反應）-RFLP法(限制性內切酶片段多態性)、PCR-測序法、DNA