用于診斷結核分枝桿菌感染的分子標志物、引物組及應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術領域，特別設及用于診斷結核分枝桿菌感染的分子標志物及 在結核分枝桿菌感染診斷中的應用。
【背景技術】
[0002] 結核病（Tuberculosis ,ΤΒ)是因結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis , Mtb)感染引起的一種"高感染率"、"高致病率"與"高致死率"烈性傳染病。2015年世界衛生 組織(WHO)發布的世界結核年報顯示，結核病的年致死人數達到150萬，已經超過因艾滋病 或HIV感染所致死人數。中國是全球結核分枝桿菌攜帶人數最多、活動性結核病人最多W及 結核耐藥疫情最為嚴重的國家之一。所W，迅速控制結核疫情蔓延迫在眉睫。
[0003] 早期、快速、便捷診斷結核是控制結核病的一個關鍵環節。只有早期、快速、便捷、 準確診斷出是否被結核分枝桿菌感染，才能為臨床治療用藥提供依據，才能為結核病控制 部口采取及時、快速的公共衛生防控措施提供決策依據。
[0004] 目前的結核分枝桿菌感染診斷技術主要包括有細菌學診斷與免疫學診斷。其中細 菌學診斷包括結核分枝桿菌疲涂片抗酸染色、結核分枝桿菌培養、及疲標本的結核分枝桿 菌特異核酸PCR檢測等。但是，基于疲標本抗酸染色、培養、PCR的結核分枝桿菌細菌學診斷 技術嚴重依賴于結核病人排出的疲液里面必須有結核分枝桿菌。然而，有>50%的結核感 染病人因不排疲或者排的疲里面不含結核分枝桿菌所W無法在疲液里面檢測到結核分枝 桿菌，而且結核分枝桿菌不僅培養周期非常漫長，往往需要3~6周，而且培養要求高。所W， 結核分枝桿菌感染的細菌學診斷技術具有很大的局限性，存在診斷效率低、周期長、靈敏度 低、技術復雜等缺陷，而且無法適用于臨床約>50%的疲標本結核分枝桿菌陰性結核病人 的診斷。
[0005] 結核的免疫學診斷技術主要包括結核菌素皮試(TST)與IFN-丫釋放的化ISA或者 ELISP0T檢測。結核菌素皮試(TST)的主要優點是價格相對低廉、適宜大規模結核感染人群 的結核篩查。但是，結核菌素皮試(TST)的診斷缺乏結核分枝桿菌特異性，而且結核菌素皮 試(TST)的結果非常容易受到機體免疫力與生理狀態的非特異性干擾。所W結核菌素皮試 (TST)存在診斷特異性差、靈敏度低的致命缺點。基于結核分枝桿菌特異的IFN-丫釋放的 ELISA或者化ISP0T檢測的結核免疫學診斷技術相比結核菌素皮試(TST)診斷技術有更高的 特異性。但是，基于結核特異的IFN-丫釋放化ISA或者化ISP0T檢測的結核免疫學診斷技術 需要專業的細胞培養實驗室對受試者的細胞進行培養，細胞培養實驗周期長，ELISP0T的數 據讀出需要專業、昂貴的化ISP0T斑點讀出儀器，總體診斷價格昂貴，不適用于基層的結核 早期、快速診斷，也不適合嬰幼兒的結核診斷。而且，大量的結核病人處于免疫抑制或素亂 狀態，IFN- 丫的表達受到抑制或者處于素亂的狀態，所W，基于結核特異的IFN- 丫釋放的結 核診斷技術存在技術上天然的缺陷。
[0006] 因此，發現新的結核特異的診斷生物標記物，開發靈敏、方便、快捷、特異性高并且 廉價的結核診斷新技術就成為了控制結核疫情蔓延的重要工作。

【發明內容】

[0007]為彌補現有技術的不足，本發明第一方面提供用于診斷結核分枝桿菌感染的新型 分子標志物，所述分子標志物選自序列如SEQ ID NO. 1~28所示的RNA中的一種或兩種W上 的組合。
[000引或者，所述分子標志物選自與SEQ ID NO.1~28所示的任何其中一種RNA的片段具 有相同序列或者>50%相同序列的RNA;或者所述分子標志物是與SEQ ID NO. 1~28所示的 任何其中一種RNA全長或片段具有>50%的RNA序列相似性的人工合成、拼接、重組或克隆 的 RNA。
[0009] 本發明第二方面提供上文所述的分子標志物在制備用于診斷結核分枝桿菌感染 的制劑中的應用。作為一種具體方式，該制劑通過檢測被試者末梢血、外周血、外周血血清 或外周血單個核細胞(PBMC)中所述分子標志物的含量，并與正常水平相比較來診斷被試者 是否被結核分枝桿菌感染。進一步具體的，可通過實時定量PCR或基因忍片來檢測判別被試 者是否被結核分枝桿菌感染。
[0010] 本發明第Ξ方面提供一種引物組，該引物組包括分別用于特異性擴增序列如SEQ ID NO. 1~28所示的RNA的引物對中的至少一種引物對或兩種W上引物對的組合，其中，用 于特異性擴增序列如SEQ ID N0.1~5、7-17、19-24、26-28所示的1?^4的引物對分別依次為 引物對1~5、7-17、19-24、26-28，用于特異性擴增序列如560 1〇^.6的1?^4的引物對為引 物對6a或6b，用于特異性擴增序列如SEQ ID NO. 18的RNA的引物對為引物對1&1或18b，用于 特異性擴增序列如SEQ ID NO. 25的RNA的引物對為引物對25a或25b。引物對可W是天然的 或是合成的。
[0011] 本發明第四方面提供上述引物組在制備用于診斷結核分枝桿菌感染的制劑中的 應用。
[0012] 本發明第五方面提供一種用于診斷結核分枝桿菌感染的制劑，該制劑包括分別用 于特異性擴增序列如SEQ ID NO. 1~28所示的RNA的引物對中的至少一種引物對、或兩種W 上引物對的組合。進一步，用于特異性擴增序列如沈Q ID N0.1~5、7-17、19-24、26-28所示 的RNA的引物對分別依次為上文所述的引物對1~5、7-17、19-24、26-28，用于特異性擴增序 列如SEQ ID NO.6的RNA的引物對為引物對6a或6b，用于特異性擴增序列如SEQ ID NO. 18的 RNA的引物對為引物對18a或18b，用于特異性擴增序列如SEQ ID NO.25的RNA的引物對為引 物對扣3或2513。該制劑可W是試劑盒或基因忍片等。
[0013] 本發明第六方面提供一種用于診斷結核分枝桿菌感染的制劑，該制劑包括：1)外 周血單個核細胞(PBMC)的總RNA提取試劑;2)逆轉錄試劑;3)實時定量PCR試劑;其中，所述 實時定量PCR試劑包括用于特異性擴增序列如SEQ ID NO. 1~28所示的RNA的引物對中的至 少一種引物對、或兩種W上引物對的組合。進一步優選的，用于特異性擴增序列如SEQ ID ^.1~5、7-17、19-24、26-28所示的3酷的引物對分別依次為上文所述的引物對1~5、7-17、 19-24、26-28,用于特異性擴增序列如SEQ ID ^.6所示的1?^4的引物對為引物對6曰或613，用 于特異性擴增序列如SEQ ID NO. 18所示的RNA的引物對為引物對1&1或18b，用于特異性擴 增序列如SEQ ID NO. 25所示的RNA的引物對為引物對25a或25b。該制劑中的外周血單個核 細胞的總RNA提取試劑和逆轉錄試劑均可采用本領域現有的相應試劑，如逆轉錄試劑采用 化ermo公司的逆轉錄試劑盒，總RNA提取試劑采用化i zo 1法提取RNA所需的常用試劑。該制 劑可W是試劑盒等。
[0014] 經實驗證實，本發明所述的序列如SEQ ID NO. 1~28所示的RNA在被結核分枝桿菌 感染的結核病患者中的表達量明顯低于或高于未被結核分枝桿菌感染的健康人，因而，所 述的序列如SEQ ID NO. 1~28所示的RNA可W作為判別是否被結核分枝桿菌感染的特異分 子標志物或診斷祀點，可應用于制備用于診斷結核分枝桿菌感染的制劑中。采用本發明的 分子標志物開發診斷結核分枝桿菌感染的制劑，用于診斷結核分枝桿菌感染，具有靈敏、方 便、快捷、特異性高、廉價的特點。
【附圖說明】
[0015] 圖1:為序列如SEQ ID N0.1~8、10~17所示的RNA在結核分枝桿菌感染的結核病 患者或未被結核分枝桿菌感染的健康人群的人外周血單個核細胞(PBMC)中差異表達的實 時定量PCR結果圖；
[0016] 圖2:為序列如SEQ ID顯.18~25、27~28所示的3酷在結核分枝桿菌感染的結核 病患者或未被結核分枝桿菌感染的健康人群的人外周血單個核細胞(PBMC)中差異表達的 實時定量PCR結果圖。
[0017] 圖3:為序列如SEQ ID NO.9、26所示的RNA在結核分枝桿菌感染的結核病患者或未 被結核分枝桿菌感染的健康人群的人外周血單個核細胞(PBMC)中差異表達的實時定量PCR 結果圖。
【具體實施方式】
[0018] 下面結合附圖和實施例對本發明的技術方案做進一步說明：
[0019]實施例
[0020]本實施例將人群分為兩個組：結核分枝桿菌感染的結核病患者（27例，簡寫為TB 組）、未被結核分枝桿菌感染的健康人群(26例，簡寫為化althy組）；通過實時定量PCR檢測 每例外周血單個核細胞(PBMC)中28種RNA(其序列如SEQ ID NO. 1-28所示）的表達情況，發 現結核分枝桿菌感染的結核病患者中上述28種RNA的表達水平總體明顯低于或高于未被結 核分枝桿菌感染的健康人群。具體步驟如下：
[0021 ]步驟一:外周血單個核細胞(PBMC)懸液的制備：