Imb-ny類化合物在制備抗結核分枝桿菌藥物中的應用
【專利摘要】本發明公開了一種IMB?NY類化合物在制備抗結核分枝桿菌藥物中的應用，所述IMB?NY類化合物包括IMB?NY1和IMB?NY2，本發明還公開了一種含有MTB IspD抑制劑的先導化合物的篩選方法以及一種用于MTB IspD抑制劑表達的ZYM?5052液體培養基；本發明聯合應用高通量表型篩選模型和結核分枝桿菌Rv3582c酶抑制劑篩選模型，從70000多個不同來源的化合物中篩選得到酶抑制劑IMB?NY1和IMB?NY2；通過對IMB?NY1和IMB?NY2的抗結核活性評價，確認該化合物具有明確的抗結核桿分枝菌活性。
【專利說明】
IMB-NY類化合物在制備抗結核分枝桿菌藥物中的應用
技術領域
[0001 ]本發明屬于化學藥物和藥物篩選領域，具體地說，設及一種IMB-NY類化合物在制 備抗結核分枝桿菌藥物中的應用。
【背景技術】
[0002] 結核病（TB，Tuberculosis)是由結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis， MTB)感染引起的慢性傳染性疾病，目前仍然是威脅到人類生命健康的主要傳染病之一。最 新世界衛生組織統計結果表明，目前全球約有Ξ分之一的人口患有結核病，其中每年新增 病例超過880萬，死亡140萬，成為與AIDS、追疾并稱的Ξ大傳染病，而我國是全球22個TB高 負擔國家之一，表現在:第一，結核桿菌感染者超過5.5億人，患者人數位居全球第二;第二， 耐藥問題非常嚴重，多藥耐藥率已經超過了 WHO規定的警戒線;第Ξ，艾滋病患者增長速度 快，可能導致HIV與結核雙流行;第四，中國流動人口大，也勢必擴大了運一傳染性疾病的感 染率。尤其是目前耐藥菌W及結核病同艾滋病共感染現象的增加，使結核病成為臨床治療 的棘手問題。目前，結核桿菌的耐藥譜和耐藥水平不斷增加，然而目前研究的現狀是，近60 年來都沒有全新作用機制和全新骨架結構的抗結核藥物問世，而且卡介苗的保護率在發達 國家也不到50%，在中國成年人中的保護率遠遠達不到發達國家的水平。因此，研制高效、 低毒的新型抗結核藥物來解決結核病的威脅是目前眾多課題組的主要目標。
[0003] 自青霉素出現W來，研究人員就發現細胞壁對于細菌的生長繁殖至關重要。由于 細胞壁的結構比較復雜，并且是細菌是從頭合成的，導致在細胞壁各成分的合成與組裝過 程中有眾多的酶系參與，而且其中多數的酶是人體內所不存在的。因此，細胞壁合成過程中 存在著諸多新型，并且具有較好的選擇毒性潛在抗菌藥物祀點。在MTB中亦為為如此。
[0004] 近幾年的研究結果表明：MTB的2-甲基-赤薛糖醇憐酸（methylerythritol phos地ate, MEP)途徑的功能是合成類異戊二締的前體物質異戊酷焦憐酸或二甲締丙基焦 憐酸。該途徑在哺乳動物和植物胞漿中被完全不同的甲徑戊酸(MVA)途徑替代。加之MEP途 徑合成的類異戊二締及其衍生物在生物代謝和細胞壁合成中至關重要，因此MEP途徑已成 為藥祀研究的熱點。該途徑對于MTB也是至關重要的，MTB的MEP途徑共包含8個酶參與，其中 Rv3582c編碼該途徑中的關鍵酶 ispD(2-C-methyl-D-er}fth;ri to 1-4-phosphate 切tidy lhansf erase，2-C-甲基-D-赤薛糖醇-4-憐酸胞喀晚轉移酶）為運一途徑中的關鍵 基因，基因的表達產物可催化MEP和CTP(Ξ憐酸胞巧)合成CDP-ME(如圖1所示）。目前尚沒有 IspD抑制劑在篩選抗結核藥物的報道，通過篩選MTB的IspD抑制劑有可能發現全新作用機 制的抗結核藥物。

【發明內容】

[0005] 有鑒于此，本發明針對上述問題，提供了一種IMB-NY類化合物在制備抗結核分枝 桿菌藥物中的應用，本發明聯合應用高通量表型篩選模型和結核分枝桿菌RV3582C酶抑制 劑篩選模型，從70000多個不同來源的化合物中篩選得到酶抑制劑IMB-NY巧日IMB-NY2;通過 對IMB-NYl和IMB-NY2的抗結核活性評價，確認該化合物具有明確的抗結核桿分枝菌活性。
[0006]為了解決上述技術問題，本發明公開了一種IMB-NY類化合物在制備抗結核分枝桿 菌藥物中的應用，IMB-NY類化合物包括IMB-NY1和IMB-NY2，所述IMB-NY1的化學式如（I)所 示：
[0010] 本發明還公開了一種含有MTB IspD抑制劑的先導化合物的篩選方法，包括W下步 驟：
[0011] 1)菌種種子液的準備；
[0012] 2)陽性化合物樣品的初篩；
[0013] 3)陽性化合物樣品的復篩；
[0014] 4)驗證陽性化合物對CG的MIC，確定MTB IspD抑制劑。
[0015] 進一步地，步驟1)中的菌種種子液的準備具體為:在已倒好的固體平板BHI培養基 上劃線接種CG，復蘇并培養新鮮的CG，培養條件37°C，倒置培養12h，然后挑取單菌落接種到 20血液體冊I培養基中37 °C，200巧m過夜培養;后測定600皿處可見波長下的光吸收(0D600) 為4.0~5.5;將菌液用液體BHI培養基稀釋至0D600 = 3.0，分裝到1.5mL的無菌離屯、管中，每 支lmL，4°C保存10管。
[0016] 進一步地，步驟2)中的陽性化合物樣品的初篩具體為：W〇.3%的接菌量將CG接入 預先計算好的培養基中對化合物庫中化合物進行篩選，除空白對照外的每孔用8通道移液 器加19祉L菌液，通過觀察該模式菌的生長情況，篩選陽性樣品；將化合物庫的化合物進行 100倍稀釋，至終濃度為20yg/mL，在該濃度下肉眼觀察其結果為渾濁則是不能抑制CG生長 的樣品，判定為初篩陰性樣品；在該濃度下肉眼觀察其結果為澄清則是能夠抑制該菌生長 的樣品，判定為初篩陽性樣品。
[0017] 進一步地，步驟3)中的陽性化合物樣品的復篩具體為：
[0018] (1)準備好要用于初篩得到的陽性化合物、CG菌種（同初篩中菌種種子液的準備）、 無菌的96孔板、8通道移液器、V型槽和無菌的8通道移液器槍頭；
[0019] (2)將96孔板、8通道移液器、V型槽放于超凈臺中紫外照射15min，后通風3~5min;
[0020] (3)取初篩陽性化合物化L加入96孔板中，取兩份編號1、2，分別加入19祉LWO. 3% 的接菌量的CG的BH巧郵HIS-I的稀釋菌液于已準備好的有初篩陽性化合物的96孔板中；
[0021] (4)96孔板具體為:8(A~H)行*12(1~12)列，右面最后一列留四孔為乙胺下醇陽 性藥物對照;每板的左面第一列中設置4孔空白對照和4孔生長對照，其中，空白對照組不加 菌，生長對照組不加藥物，在96孔板種剩余的84孔樣品的化合物終濃度為20yg/mL，反應體 系總體積為20化レ在BHI和BHIS-I兩種方法上做法相同；
[0022] (5)將所有加好樣的96孔板至于37°C恒溫培養箱中培養12~16h，用酶標儀測定可 見光波長600nm處的吸收；
[0023] 按照公式（1)計算BHI或者BHIS-I培養基中樣品對于CG生長的抑制率；
[0024] (1)
[00巧]其中指的是CG菌正常生長對照組所有孔600nm下的吸收值的平均值;玄指的是 無 CG菌生長的培養基空白對照組所有孔600nm下的吸收值的平均值;巧旨的是加入化合物后 影響CG菌生長的試驗測試孔600nm下的吸收值；
[0026] 抑制率差（Δ I)為將BHI培養基中的抑制率減去BHIS-I培養基中的抑制率，再利用 陽性藥的A I來確定陽性標準；
[0027] Δ 1 = 1冊廣Ibhis-i
[0028] Ibhi :樣品或對照化合物對CG在BHI培養基中的抑制率；
[0029] Ibhis-i :樣品或對照化合物對CG在BHIS-I培養基中的抑制率；
[0030] 挑選出在兩種培養基上抑制率都大于70 %的樣品進行拆分篩選，并對BH巧郵HIS- I培養基中抑制率差大于20%的進行拆分篩選;對每一種化合物進行篩選，具體確定到底是 某一種化合物起的作用還是某兩種或兩種W上的協同作用；
[0031] 挑出抑制率仍大于或等于70% W上的復篩陽性化合物樣品，根據樣品的編號，查 找樣品所對應的每一個化合物的編號，并取出每個單一的化合物樣品；對每個化合物進行 同復篩一樣的驗證;仍然具有大于或等于70% W上抑制作用的化合物，進行對CG的紙片法 驗證;每個紙片加50化濃度為10化g/mL的待測樣品，記錄抑菌圈直徑;將復篩驗證的化合物 命名為活性化合物，即為先導化合物，含有IMB-NY類化合物。
[0032] 進一步地，步驟4)中驗證陽性化合物對CG的MIC，確定MTB IspD抑制劑具體為：
[0033] (1)將96孔板、V型槽、移液器等在紫外燈下照射30min;
[0034] (2)將種子液W〇. 3 %的接種量接種于新鮮的BHI/BHIS-I液體培養基中；
[0035] (3)用排式微量移液器將新鮮菌液加入到96孔板中，第一橫排19祉L，2~8橫排每 孔
[0036] (4)于第1排每孔加入濃度為lOyg/mL的抗菌藥物化L混勻，使混合液中藥物終濃度 為 0.05yg/ni;
[0037] (5)從第1排吸取10化L液體加入到第2排中混勻，使混合液中藥物終濃度為0.02扣 邑/ιΛ;
[0038] (6)2~12排按步驟(5)方法抗菌藥物濃度依次2倍稀釋，第12排濃度為0.化g/mL
[0039] (7)將96孔板放置在37 °C恒溫培養箱中培養16h;
[0040] (8)觀察結果：W細菌生長完全受抑制的濃度記為最低抑菌濃度;從化合物庫中獲 得對模式替代菌CG的細胞壁有影響的先導化合物共147個。
[0041 ]本發明還公開了一種用于MTB IspD抑制劑表達的ZYM-5052液體培養基，每升的 ZYM-5052的培養基中含有試劑為：1 %的膜蛋白腺、0.5%的酵母提取物、25mM的化2冊〇4、 25mM的KH2PO4、50mM的畑此1、5mM的化2S〇4、0.5%的甘油、0.05%的葡萄糖、0.2%的α-乳糖、 2mM的MgS〇4。
[0042] 與現有技術相比，本發明可W獲得包括W下技術效果：
[0043] l)IspD蛋白的誘導表達采用了自誘導培養基(ZYM-5052液體培養基），提高了可溶 蛋白IspD的量。
[0044] 2)結合了細菌表型篩選模型和祀標特異性篩選，提高了陽性率。
[0045] 3)新發現的化合物IMB-NY1和IMB-NY2與現有的抗結核藥物的結構都不相同。
[0046] 當然，實施本發明的任一產品并不一定需要同時達到W上所述的所有技術效果。
【附圖說明】
[0047] 此處所說明的附圖用來提供對本發明的進一步理解，構成本發明的一部分，本發 明的示意性實施例及其說明用于解釋本發明，并不構成對本發明的不當限定。在附圖中： [004引圖1是本發明【背景技術】中RV3582C的催化反應圖
[0049] 圖2是本發明實施例1中表型篩選的樣品設置圖；
[0050] 圖3是本發明實施例2中測定MIC的方法流程圖；
[0051] 圖4是本發明實施例3中吸收值與PPi濃度的標準曲線擬合圖。
【具體實施方式】
[0052] W下將配合附圖及實施例來詳細說明本發明的實施方式，藉此對本發明如何應用 技術手段來解決技術問題并達成技術功效的實現過程能充分理解并據W實施。
[0053] 實施例1:潛在的體外抗結核分枝桿菌細胞壁的先導化合物的篩選
[0054] 通過應用高通量的祀向于結核分枝桿菌細胞壁的替代菌谷氨酸棒狀桿菌(CG)表 型篩選模型，篩選潛在的體外抗結核分枝桿菌細胞壁的先導化合物，包括W下步驟：
[0055] 1、菌種種子液的準備:在已倒好的固體平板BHI培養基（3.7%的抓公司的腦屯、浸 液培養基中添加1.5%的瓊脂，貨號:211065)上劃線接種CG，復蘇并培養新鮮的CG，培養條 件37°C，倒置培養12h，然后挑取單菌落接種到20mL液體BHI培養基(3.7 %的抓公司的腦屯、 浸液培養基，貨號：211065)中37°C，200rpm過夜培養。后測定60化m處可見波長下的光吸收 (ο化00)約為4. ο~5.5。將菌液用液體BHI培養基稀釋至0D600 = 3. ο，分裝到1.5mL的無菌離 屯、管中，每支lmL，4°C保存10管。經后期試驗證明可使用1周。
[0056] 2、初篩模型的應用
[0057] 基于96孔板法的初步篩選：W0.3%的接菌量將CG接入預先計算好的培養基中對 化合物庫(來源于中國醫學科學院醫藥生物技術研究所篩選實驗室構建保存的截止2014年 年底的化合物樣品庫）中化合物進行篩選，除空白對照外的每孔用8通道移液器加19如L菌 液，通過觀察該模式菌的生長情況，篩選陽性樣品。將化合物庫的化合物進行100倍稀釋，至 終濃度為20yg/mL，在該濃度下肉眼觀察其結果為渾濁則是不能抑制CG生長的樣品，判定為 初篩陰性樣品；在該濃度下肉眼觀察其結果為澄清則是能夠抑制該菌生長的樣品，判定為 初篩陽性樣品；具體步驟如下所示：
[0058] (1)準備好要用于篩選的化合物、已滅好菌的8通道移液器槍頭。
[0059] (2)將96孔板、8通道移液器、V型槽放于超凈臺中紫外照射15min，后通風3~5min。
[0060] (3)取化合物化L于96孔板中，板號一一對應W免混淆，將上述配好的W0.3%接菌 量的CG菌液取19祉L于有化合物的96孔板中。
[0061] (4)左面第一列留為對照，前四孔只加19祉L CG的菌液和化L無菌水作為陽性對 照、后四孔只加19祉L BHI純培養基和化L水作為陰性對照。
[0062] (5)將所有加好樣的96孔板至于37°C恒溫培養箱中培養12~16h，用酶標儀測定可 見光波長600nm處的吸收值；
[0063] 按照如下公式計算在BHI培養基中樣品對于CG生長的抑制率。
[0064] (1)
[00化]其中歹指的是CG菌正常生長對照組所有孔eOOnm下的吸收值的平均值;基指的是 無 CG菌生長的培養基空白對照組所有孔600nm下的吸收值的平均值;巧旨的是加入化合物后 影響CG菌生長的試驗測試孔600nm下的吸收值。
[0066] 抑制率大于70%的孔作為初篩陽性化合物樣品。
[0067] 3、復篩驗證基于96孔板法初篩的陽性化合物
[0068] 對前面得到的陽性化合物進行復篩，應用BHK3.7%的BD公司的腦屯、浸液培養基， 貨號：211065)和BHIS-I(在冊I培養基中添加了 10.92%的山梨醇，1 %的氯化鋼和0.05%的 硫酸儀)兩種培養基進行復篩;具體步驟如下：
[0069] (1)準備好要用于初篩得到的陽性化合物、CG菌種（同初篩中菌種種子液的準備）、 無菌的96孔板、8通道移液器、V型槽和無菌的8通道移液器槍頭。
[0070] (2)將96孔板、8通道移液器、V型槽放于超凈臺中紫外照射15min，后通風3~5min。
[0071] (3)取初篩陽性化合物化L加入96孔板中，取兩份編號1、2，分別加入19祉LW0.3% 的接菌量的CG的BH巧郵HIS-I的稀釋菌液于已準備好的有初篩陽性化合物的96孔板中。
[0072] (4)如圖2所示，96孔板具體為:8(A~H)行*12(1~12)列，右面最后一列留四孔為 乙胺下醇化MB)陽性藥物對照。每板的左面第一列中設置4孔空白對照和4孔生長對照，其 中，空白對照組不加菌，生長對照組不加藥物，在96孔板中剩余的84孔樣品的化合物終濃度 為20yg/mL，反應體系總體積為20化L。在BHI和BHIS-I兩種方法上做法相同。
[0073] (5)將所有加好樣的96孔板至于37°C恒溫培養箱中培養12~16h，用酶標儀測定可 見光波長600nm處的吸收；
[0074] 按照公式（1)計算BHI或者BHIS-I培養基中樣品對于CG生長的抑制率。
[0075] 抑制率差（Δ I)為將BHI培養基中的抑制率減去BHIS-I培養基中的抑制率，再利用 陽性藥的A I來確定陽性標準。
[0076] Δ I = Ibhi-Ibhis-i
[0077] Ibhi :樣品或對照化合物對CG在BHI培養基中的抑制率；
[0078] Ibhis-i:樣品或對照化合物對CG在BHIS-I培養基中的抑制率。
[0079] 挑選出在兩種培養基上抑制率都大于70 %的樣品進行拆分篩選，并對BH巧郵HIS- I培養基中抑制率差大于20%的進行拆分篩選。因上述用于篩選的化合物都是五合一的，所 W進行對每一種化合物進行篩選，具體確定到底是某一種化合物起的作用還是某兩種或兩 種W上的協同作用。
[0080] 挑出抑制率仍大于或等于70% W上的復篩陽性化合物樣品，根據樣品的編號，查 找樣品所對應的每一個化合物的編號，并取出每個單一的化合物樣品。對每個化合物進行 同復篩一樣的驗證。仍然具有大于或等于70% W上抑制作用的化合物，進行對CG的紙片法 驗證。每個紙片加50化濃度為l(K)yg/mL的待測樣品，記錄抑菌圈直徑。將復篩驗證的化合物 命名為活性化合物，即為先導化合物，含有本發明的IMB-NY類化合物。
[0081] 4、測定活性化合物對CG的MIC
[0082] 進一步測定活性化合物對CG的MIC,將保存的CG種子液W〇. 3 %的接種量分別接種 在BH巧郵HIS-I培養基。96孔板上，每孔終體積為20化L。于37°C培養1化后，使用酶標儀讀取 可見光波長600nm處的吸收值，結果中細胞密度數值小于0.020D視為最小抑菌濃度;96孔板 法測定MIC值具體步驟如下(如圖3所示）：
[0083] (1)將96孔板、V型槽、移液器等在紫外燈下照射30min;
[0084] (2)將種子液W〇. 3 %的接種量接種于新鮮的BHI/BHIS-I液體培養基中；
[0085] (3)用排式微量移液器將新鮮菌液加入到96孔板中，第一橫排19祉L，2~8橫排每 孔
[0086] (4)于第1排每孔加入濃度為lOyg/mL的抗菌藥物化L混勻，使混合液中藥物終濃度 為 0.05yg/ni;
[0087] (5)從第1排吸取10化L液體加入到第2排中混勻，使混合液中藥物終濃度為0.02扣 邑/ιΛ;
[0088] (6)2~12排按步驟(5)方法抗菌藥物濃度依次2倍稀釋，第12排濃度為0.化g/mL
[0089] (7)將96孔板放置在37 °C恒溫培養箱中培養16h;
[0090] (8)觀察結果：W細菌生長完全受抑制（同空白對照一致）的濃度記為最低抑菌濃 度。
[0091] 通過上述的篩選研究從化合物庫中獲得對模式替代菌CG的細胞壁有影響的先導 化合物共147個。
[0092] 實施例2:MTB IspD的表達、純化和應用研究
[0093] 通過應用高通量的MTB IspD抑制劑篩選模型，篩選WMTB IspD為祀點的新型抗結 核藥物。
[0094] IspD蛋白的克隆載體的構建方法參見專利（專利名稱：IspD抑制劑篩選模型W及 IspD抑制劑杜米芬的新用途，專利公開號CN 102277411A，發明日：2010-06-10);
[00巧]應用構建成功的的祀T28a( + )-Rv3582c質粒(pET28a( + )-Rv3582c質粒采用常規的 技術手段進行構建)熱擊轉化大腸埃希菌化21(DE3)plysS感受態后，涂布于含有卡那霉素 化an)的LB平板，37°C，過夜培養獲得高效表達MTB IspD蛋白pET28a( + )-Rv3582c: :BL21 (DE3)plysS菌株開展蛋白的表達、純化和應用研究。具體方法是：
[0096] 1)將可高效表達結核桿菌139〇蛋白的大腸桿菌祀了28曰(+ )-1?￥3582(3::81^21(063) plysS劃線接種于含有50μg/ml Kan的LB平板，37°C，過夜培養。
[0097] 2)挑取單菌落接種于含有50μg/ml Kan的LB液體培養基，200r.p.m.，37°C，過夜培 養；
[0098] 將過夜培養物按1:1000接種于含有20化g/ml Kan的新鮮ZYM-5052液體培養基中 (每升的ZYM-5052的培養基中含有試劑為：1 %的膜蛋白腺、0.5 %的酵母提取物、25mM的 Na 抽 P〇4、25mM 的 KH2PO4、50mM 的畑此1、5mM 的化 2S〇4、0.5 % 的甘油、0.05 % 的葡萄糖、0.2 % 的 日-乳糖、2mM的MgS〇4)，2lOr. P.m.，37°C，培養化至菌體0〇6日日>0.3。
[0099] 3)將溫度調整到16°C，210r.p.m.，培養1她，誘導IspD蛋白的表達。
[0100] 4)10000Xg離屯、lOmin收集菌體;裂解緩沖液懸浮菌體細胞，冰浴、使用壓力破碎 系統將菌體細胞破碎，4°C下14000 X g離屯、化收集上清液；使用AKTAPrime系統，在pH 8.0的條件下，上清液上化s-trap親和柱(GE公司，17-5247-01 )，用緩沖液進行梯度洗脫，收 集洗脫液；收集到的樣品加入15mL超濾離屯、管（lOkDa，Mi 11 iPore公司），4°C下5000g離屯、 15min，至樣品量小于2.5ιΛ;使用PD-10脫鹽柱和脫鹽緩沖液將超濾后的樣品脫鹽。對蛋白 定量后-8〇°C保存。
[0101] 實施例3:酶活性分析
[0102] 反應體系：10μ1離子試劑（含終濃度lOmM的MgCl2、20mM化F及ImM DTT);lyg的實 施例2獲得的純化的IspD;CTP和MEP(其終濃度分別為500μΜ和250μΜ)。酶反應緩沖液為50mM TriS-HC1 (pH 8.0)，反應體系總體積為10化1。設加入熱失活的IspD作為對照。同時設加入8 個不同濃度（ΟμΜ，2扣Μ，50μΜ，7扣Μ，100μΜ，150μΜ，200μΜ，250μΜ)的 100μΙ PPi，在活性測定 中繪制吸收值與PPi濃度的標準曲線，通過Excel擬合出相關直線公式(參見圖4);從而根據 公式計算酶的反應進程。
[0103] y = 3.589x+16.418
[0104] r2 = 〇.9997
[01化]活性測定:將上述體系在37°C解育40min，加入10μ1顏色試劑A(1M β-琉基乙醇)和 40μ1顏色試劑Β (2.5 %鋼酸錠溶解至2.5Μ的此S〇4)后，37 °C繼續解育lOmin，酶標儀在590皿 波長下檢測反應體系的吸收值。
[0106] 結果:將樣品的吸收值參照標準曲線，計算出反應生成的PPi的濃度。將生成的PPi 的濃度除W完全反應可能生成的PPi的濃度，作為反應進程。
[0107] 代入公式:反應進程=生成的PPi的濃度/完全反應生成的PPi的濃度*100%;
[0108] 當反應進程大于40%，酶的活性即被認為是正常。
[0109] 實施例4: IspD抑制劑的篩選
[0110] 篩選所用方法(祀標特異性篩選）的原理、反應體系和活性測定方法同實施例3具 體篩選分組見表1。
[0111]
[0112] 其中辦指完全正常的酶促反應體系作為陰性對照組的吸收值平均值；聲指W失活 的IspD作為陽性對照組的吸收值平均值;巧旨的是加入化合物后試驗測試孔的吸收值。
[0113] 在本篩選系統中，由于尚無 MTB的IspD抑制劑問世，W失活的IspD作為陽性對照 組，其給出的吸收值最小，酶抑制率為最大；W完全正常的酶促反應體系為陰性對照，該組 給出的吸收值最大，抑制率最小。通過計算得出待篩樣品的酶抑制率，當抑制率大于20%即 被認為是陽性結果。
[0114] 篩選結果:從實施例1中得到的147個化合物中篩選得到2個陽性化合物，陽性率為 1.4%，其中，IMB-NY1的化學式如（I)所示：
[0115]
[0116] 其中2〇4邑/1111的加8-爪1對13口0的抑制率為51%。
[0117] IMB-NY2的化合物如（II)所示：
[011 引
[0119] 實施例5:評價MTB IspD抑制劑（IMB-NY1和IMB-NY2)的抗MTB活性
[0120] MTB IspD抑制劑在體外對敏感和耐藥結核桿菌抑制活性測定方法如下：
[0121] 1)抗結核活性測定在無菌的96孔培養板中進行，每個孔的終體積為l(K)yL。
[0122] 2)測試孔中分別加入含5X105c化的結核分枝桿菌H37Rv(ATCC 25618)、臨床分離 的對異煙阱和利福平敏感的菌株(960)、對異煙阱和利福平耐藥的MDR菌株(330)和廣泛耐 藥的XDR菌株(926)(后Ξ株菌是南京市胸科醫院檢驗科臨床標本經過改羅法和分枝桿菌微 量直觀快速藥敏試驗多次驗證的菌株，括號內的數字為菌株編號）的培養液，同時加入不同 濃度的陽性對照藥異煙阱（INH，Sigma公司）和利福平(RFP，Sigma公司）（藥物濃度的選擇 是：異煙阱和利福平在用MTB化37RV)菌株中進行試驗時從終濃度為32μg/ml開始進行二倍 稀釋到62.5ng/ml，當使用臨床分離菌株進行試驗時藥物的終濃度從12祉g/ml開始二倍稀 釋到0.12扣g/ml)或DMSO配制的不同濃度的待測化合物，待測樣品在試驗測定體系中通過 二倍稀釋法獲得終濃度從初始的128.0μg/ml到0.0625μg/ml;
[0123] 3)培養板的四周為等體積的無菌7朋培養基，同時設置3個生長陽性對照孔(等體 積的不含樣品的DMS0溶劑)和3個生長陰性對照孔(等體積的不含任何結核桿菌的7H9培養 基）；
[0124] 4)蓋上96孔板后，四周用封口膜密封，置于37°C溫箱中解育；
[0125] 5)培養至第7天顯微鏡下放大40倍觀察陽性生長對照孔和陰性生長對照孔，當觀 察到兩者有明顯差別時，對各個試驗孔細菌生長的狀態進行觀察，并判定和記錄抑制或耐 藥結果；
[01%] 6)第14天再重復觀察一次確認記錄結果。
[0127]結果表明：化合物IMB-NY1對結核分枝桿菌標準菌株H37RV的最低抑菌濃度(MIC) 為化g/ml;對臨床分離的敏感菌株(960)、MDR菌株(330)和XDR菌株(926)具有相似的抑制活 性，MIC均為2~4μg/ml。化合物IMB-NY2對結核分枝桿菌標準菌株H37RV的最低抑菌濃度 (MIC)為祉g/ml;對臨床分離的敏感菌株(960)、MDR菌株(330)和XDR菌株(926)具有相似的 抑制活性，MIC均為8~16μg/ml(見表1)。
[012引表1化合物對各類MTB的MIC(μg/ml)
[0129]
[0130] 注:括號內為反應終濃度。
[0131] 上述說明示出并描述了發明的若干優選實施例，但如前所述，應當理解發明并非 局限于本文所披露的形式，不應看作是對其他實施例的排除，而可用于各種其他組合、修改 和環境，并能夠在本文所述發明構想范圍內，通過上述教導或相關領域的技術或知識進行 改動。而本領域人員所進行的改動和變化不脫離發明的精神和范圍，則都應在發明所附權 利要求的保護范圍內。
【主權項】
1. MB-NY類化合物在制備抗結核分枝桿菌藥物中的應用，其特征在于，所述IMB-NY類 化合物包括頂B-NYl和頂B-NY2，所述頂B-NYl的化學式如（I)所示：7 所述頂B-NY2的化合物如（I I)所示：2. -種含有MTB IspD抑制劑的先導化合物的篩選方法，其特征在于，包括以下步驟： 1) 菌種種子液的準備； 2) 陽性化合物樣品的初篩； 3) 陽性化合物樣品的復篩； 4) 驗證陽性化合物對CG的MIC，確定MTB I spD抑制劑。3. 根據權利要求2所述的含有MTB IspD抑制劑的先導化合物的篩選方法，其特征在于， 所述步驟1)中的菌種種子液的準備具體為:在已倒好的固體平板BHI培養基上劃線接種CG， 復蘇并培養新鮮的CG，培養條件37°C，倒置培養12h，然后挑取單菌落接種到20mL液體BHI培 養基中37°C，200rpm過夜培養;后測定600nm處可見波長下的光吸收(0D600)為4.0~5.5;將 菌液用液體BHI培養基稀釋至0D600 = 3.0，分裝到1.5mL的無菌離心管中，每支ImL，4°C保存 10管。4. 根據權利要求3所述的含有MTB IspD抑制劑的先導化合物的篩選方法，其特征在于， 所述步驟2)中的陽性化合物樣品的初篩具體為：以0.3 %的接菌量將CG接入預先計算好的 培養基中對化合物庫中化合物進行篩選，除空白對照外的每孔用8通道移液器加198yL菌 液，通過觀察該模式菌的生長情況，篩選陽性樣品；將化合物庫的化合物進行100倍稀釋，至 終濃度為20yg/mL，在該濃度下肉眼觀察其結果為渾濁則是不能抑制CG生長的樣品，判定為 初篩陰性樣品；在該濃度下肉眼觀察其結果為澄清則是能夠抑制該菌生長的樣品，判定為 初篩陽性樣品。5. 根據權利要求4所述的含有MTB IspD抑制劑的先導化合物的篩選方法，其特征在于， 所述步驟3)中的陽性化合物樣品的復篩具體為： (1) 準備好要用于初篩得到的陽性化合物、CG菌種（同初篩中菌種種子液的準備）、無菌 的96孔板、8通道移液器、V型槽和無菌的8通道移液器槍頭； (2) 將96孔板、8通道移液器、V型槽放于超凈臺中紫外照射15min，后通風3~5min; (3) 取初篩陽性化合物2yL加入96孔板中，取兩份編號1、2，分別加入198yL以0.3%的接 菌量的CG的BHI和BHIS-I的稀釋菌液于已準備好的有初篩陽性化合物的96孔板中； (4) 96孔板具體為:8(A~H)行*12(1~12)列，右面最后一列留四孔為乙胺丁醇陽性藥 物對照;每板的左面第一列中設置4孔空白對照和4孔生長對照，其中，空白對照組不加菌， 生長對照組不加藥物，在96孔板種剩余的84孔樣品的化合物終濃度為20yg/mL，反應體系總 體積為200yL;在BHI和BHIS-I兩種方法上做法相同； (5) 將所有加好樣的96孔板至于37°C恒溫培養箱中培養12~16h，用酶標儀測定可見光 波長600nm處的吸收； 按照公式（1)計算ΜΠ 或者MHS-I培養基中樣品對于CG生長的抑制率；(1) 其中及指的是CG菌正常生長對照組所有孔600nm下的吸收值的平均值;否指的是無 CG菌 生長的培養基空白對照組所有孔600nm下的吸收值的平均值;T指的是加入化合物后影響CG 菌生長的試驗測試孔600nm下的吸收值； 抑制率差（Δ I)為將BHI培養基中的抑制率減去BHIS-I培養基中的抑制率，再利用陽性 藥的A I來確定陽性標準； Δ I = Ibhi-Ibhis-i Ibhi :樣品或對照化合物對CG在BHI培養基中的抑制率； Ibhis-i :樣品或對照化合物對CG在MHS-I培養基中的抑制率； 挑選出在兩種培養基上抑制率都大于70%的樣品進行拆分篩選，并對BHI和BHIS-I培 養基中抑制率差大于20 %的進行拆分篩選;對每一種化合物進行篩選，具體確定到底是某 一種化合物起的作用還是某兩種或兩種以上的協同作用； 挑出抑制率仍大于或等于70%以上的復篩陽性化合物樣品，根據樣品的編號，查找樣 品所對應的每一個化合物的編號，并取出每個單一的化合物樣品；對每個化合物進行同復 篩一樣的驗證;仍然具有大于或等于70%以上抑制作用的化合物，進行對CG的紙片法驗證； 每個紙片加50此濃度為lOOyg/mL的待測樣品，記錄抑菌圈直徑;將復篩驗證的化合物命名 為活性化合物，即為先導化合物，含有IMB-NY類化合物。6. 根據權利要求5所述的含有MTB IspD抑制劑的先導化合物的篩選方法，其特征在于， 所述步驟4)中驗證陽性化合物對CG的MIC，確定MTB IspD抑制劑具體為： (1)將96孔板、V型槽、移液器等在紫外燈下照射30min; (2) 將種子液以0.3 %的接種量接種于新鮮的BHI/BHIS-I液體培養基中； (3) 用排式微量移液器將新鮮菌液加入到96孔板中，第一橫排198yL，2~8橫排每孔100 yL； (4) 于第1排每孔加入濃度為lOyg/mL的抗菌藥物2yL混勻，使混合液中藥物終濃度為 0.05yg/mL； (5) 從第1排吸取I OOyL液體加入到第2排中混勻，使混合液中藥物終濃度為0.025yg/ mL； (6) 2~12排按步驟(5)方法抗菌藥物濃度依次2倍稀釋，第12排濃度為0.1yg/mL; (7) 將96孔板放置在37 °C恒溫培養箱中培養16h; (8) 觀察結果：以細菌生長完全受抑制的濃度記為最低抑菌濃度;從化合物庫中獲得對 模式替代菌CG的細胞壁有影響的先導化合物。7. -種用于MTB IspD抑制劑表達的ZYM-5052液體培養基，其特征在于，每升的ZYM-5052的培養基中含有試劑為：1 %的胰蛋白胨、0.5%的酵母提取物、25mM的Na2HP〇4、25mM的 KH2PO4、50mM的NH4CI、5mM的Na2S〇4、0.5% 的甘油、0.05% 的葡萄糖、0.2% 的α-乳糖、2mM的 MgSO4o
【文檔編號】C12R1/32GK105998013SQ201610343082
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年5月23日
【發明人】楊延輝, 肖春玲, 劉河濤, 劉憶霜, 蒙建州, 魯眾陽, 田靜, 楊志偉, 楊玉榮, 王浩, 王大軍, 擺茹, 梁錦屏
【申請人】寧夏醫科大學