GF121I-M2-DPTGG基因，PCR反應體系見表1，反應參數見表2。
[0048]表1 VEGF I-M2-DPTGG PCR反應體系
[0049]
[0050]表2 VEGF I-M2-DPTGG PCR反應參數
[0051]
[0052] 1. 5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產物（參見附圖2)，條帶位置與預期的593bp - 致。
[0053] 通過切膠回收獲得目的片段VEGF121I-M2_DPTGG，將目的片段和pET28a載體質粒分 別經NcoI、Nhe I雙酶切，雙酶切反應體系見表3、表4。
[0054] 表3 VEGF I-M2-DPTGG基因雙酶切反應體系
[0055]
[0056] 表4pET28a雙酶切反應體系
[0057]
[0058] 酶切產物通過PCR產物純化試劑盒純化，瓊脂糖凝膠電泳分別回收目的基因片段 與載體基因片段后用E.coliDNA連接酶4°C連接，用冷CaCV法制備大腸桿菌BL21的感 受態細胞，將酶連產物轉化感受態細胞后涂布到含卡那霉素的LB固體培養基上，37°C過夜 培養后挑取單菌落，將單菌落接種至LB液體培養基中，培養過夜，提取質粒，通過PCR、單酶 切和雙酶切方法初篩陽性克隆，將陽性克隆菌株送至生工測序公司進行測序，測序結果經 軟件比對后完全正確（參見附圖3)。
[0059] 根據本實驗室已構建的關于pET28a-HSP65_GRP6的序列信息，利用引物設計軟件 primer、oligo分別設計兩對引物Gl、G2 :
[0060]G1 :5' -GCGACATGGGTGGCATGGATTTC-3' 23bp
[0061]G2 :5' -GCTTTGTTAGCAGCCGGATCTCAGT-3' 25bp
[0062] 利用引物G1、G2克隆基因GRP6，PCR反應體系見表5，反應參數見表6。
[0063] 表5GRP6PCR反應體系
[0064]
[0065] 表6GRP6PCR反應參數
[0068] 1. 5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產物（參見附圖4)，條帶位置與預期的290bp- 致。
[0069] 通過切膠回收獲得目的片段GRP6，將目的片段和pET28a-VEGFI-M2-DPTGG載體 質粒分別經NheI、HindIII雙酶切，雙酶切反應體系見表7、表8
[0070] 表7pET28a-VEGFI-M2-DPTGG載體質粒雙酶切反應體系
[0071]
[0072] 表4pET28a雙酶切反應體系
[0073]
[0074] 酶切產物GRP6通過PCR產物純化試劑盒來純化，瓊脂糖凝膠電泳分別回收目的基 因片段與載體基因片段后用E.coliDNA連接酶4°C連接，轉化至E.coliBL21感受態細胞 后涂布到含卡那霉素的LB固體培養基上，37°C培養過夜，挑取單菌落，以引物VI和G2進 行PCR驗證（參見附圖5)，將陽性克隆送至生工測序公司進行測序，測序結果經軟件比對后 完全正確（參見附圖6)。至此重組質粒pET28a-VEGFI-M2-GRP6構建完成。
[0075] 實施例2VEGFI-M2-GRP6基因在大腸桿菌中的表達及培養
[0076] 重組菌以1 %接種量在液體LB培養基試管中37°C振蕩培養過夜，再以1 %的接種 量轉接搖瓶大批培養，培養4h后加入終濃度為7mM乳糖誘導表達，誘導6h后收集菌體，留 樣進行SDS-PAGE分析。融合蛋白在誘導后6h達到穩定的最大表達量，通過Bandscan軟件 分析融合蛋白的表達量可達菌體總蛋白量的65% (參見附圖7)。
[0077] 實施例3融合蛋白的初步分離純化
[0078] 挑選高表達量菌株，接種于LB培養基中，37 °C過夜培養；過夜培養液轉接入LB培 養基，37°C擴大培養，選取最優發酵條件獲得發酵菌體。5000r/min離心15min，上清及沉淀 均留樣。將沉淀用配制好的菌體裂解液（10mL/g菌體）溶解，超聲裂解菌體。12000r/min 離心20min，收集上清及沉淀均留樣標記。SDS-PAGE電泳結果顯示目的蛋白主要存在于菌 體沉淀中，故可判斷融合蛋白為胞內包涵體表達（參見附圖8)。
[0079] 實施例4包涵體的洗滌和溶解
[0080]將沉淀先用包涵體洗滌液Α(ρΗ8· 0Tris·HC1 20mM，EDTA5mM，NaC110mM，2% TritonX-100)溶解，室溫磁力攪拌30min，4°C，12000r/min，離心20min，取沉淀；再分 別用包涵體洗滌液B(pH8.OTris·Η(：1 20mM，EDTA5mM，NaC110mM，0. 5M尿素）和雙蒸 水溶解，重復上述洗滌步驟，去除部分雜蛋白和核酸。每g沉淀加入20mL包涵體裂解液 (pH8.OTris·HC1 20mM，EDTA5mM，8M尿素），加入DTT至終濃度為 10mmol/L，4°C攪拌過夜 溶解，4°C，12000r/min，離心20min，收集上清。
[0081] 實施例5包涵體的復性
[0082] 上清裝入透析袋中，用層析緩沖液I(pH8.OTris·HC1 20mM，EDTA5mM，4M尿素） 于4°C充分透析，去除DTT。透析后的上清進行梯度復性，首先將溶液放入含氧化型谷胱甘 肽0.ImM和還原型谷胱甘肽ImM的層析緩沖液II(pH8.OTris·HC1 20mM，EDTA5mM，2M尿 素）中4°C攪拌透析6h，再放入層析緩沖液III(pH8.OTris·HC1 20mM，EDTA5mM，1M尿 素）中4°C攪拌透析6h，最后用層析緩沖液IV(pH8.OTris·HC1 20mM，EDTA5mM)透析過 夜（參見附圖9)。
[0083] 實施例6DEAE-52陰離子交換層析
[0084] 本實驗采用的DEAE52是弱酸型陰離子交換劑，將DEAE-52用Na0H、HCl和NaOH分 別處理后用蒸餾水將其洗至中性，再將DEAE-52裝入層析柱中，層析柱上端進液口連接恒 流栗，下出口連接核酸蛋白檢測儀，利用離子交換緩沖液（pH8.0,20mMTris·HC1)進行層 析柱的平衡，平衡完畢后以lmL/min的速度進行蛋白溶液的上樣操作，上樣后重復平衡操 作，再用NaCl(O-lM)進行梯度洗脫，收集洗脫峰留樣，進行SDS-PAGE電泳分析。
[0085] 實施例7脫鹽凍干
[0086] 收集蛋白純度較高的洗脫液，4°C對其用蒸餾水透析過夜，將透析后的洗脫液在凍 干機中凍干，刮取蛋白干粉冷凍保存。
[0087] 除上述事實外，本發明還可以有其他實施方式，凡采用等同替換或等效變換性的 技術方案，均落于本發明要求的保護范圍。
【主權項】
1. 一種生產重組蛋白VEGFI-M2-GRp6的大腸桿菌菌株，其特征在于大腸桿菌菌株 Escherichia coli.BL21(DE3)/VG6,保藏編號：CCTCC NO :M2015497。2. 根據權利要求書1所述的該大腸桿菌菌株BL21 (DE3)/VG6，其特征在于：大腸桿菌細 胞中含有重組質粒pET-28a-VEGFI-M2-GRP6。3. 根據權利要求書2所述的該大腸桿菌菌株BL21 (DE3)/VG6中重組質粒pET-28a-VEGF I-M2-GRP6，其特征在于：含有重組的VEGFI-M2-GRP6基因，可表達融合蛋白，其具有SEQID NO: 2所示的氨基酸序列。4. 一種制備權利要求書1所述的該大腸桿菌菌株的方法，它包括以下步驟： (I)用質粒提取試劑盒提取質粒pET28a-HSP65-GRP6、pET28a-VEGFI-M2，通過PCR方法 擴增出目的片段VEGFI-M2-DPTGG和GRP6; (Π)用限制性內切酶NcoI、NheI切割VEGFI-M2-DPTGG和pET28a質粒，用E.coli DNA連接酶4°C連接過夜，將其轉化大腸桿菌菌株，獲得含質粒pET28a-VEGFI-M2-DPTGG的 菌株； (ΠΙ)用質粒提取試劑盒提取質粒pET28a-VEGFI-M2-DPTGG，用限制性內切酶NheI、HindIII切割GRP6 和質粒pET28a-VEGFI-M2-DPTGG，用E.coliDNA連接酶 4°C連接過夜， 將其轉化大腸桿菌菌株，獲得BL21 (DE3) /VG6菌株； (IV)鑒定重組質粒：使用PCR法、和單酶切、雙酶切方法進行驗證，將重組菌株進行測 序驗證。5. 根據權利要求3所述的一種新型融合蛋白VEGFI-M2-GRP6，其特征在于：該基因表達 的融合蛋白實際分子量約為27kDa，其N端為VEGFI和M2(Hsp70(407-426)的兩段串聯重 復序列），C端為六段串聯重復的GRP序列，N端和C端之間利用DPTGG柔性肽連接。6. 根據權利要求5所述的VEGFI-M2-GRP6肽的重組方法，其特征在于：包含抗腫瘤疫 苗的抗原表位VEGF、GRP，及分子內佐劑M2，具有更強的抗腫瘤功能。7. -種VEGFI-M2-GRP6肽的制備方法，其特征在于，該方法包含步驟： (I) 根據權利要求4所述步驟構建宿主菌； (II) 通過乳糖誘導，超聲破碎，包涵體洗滌和溶解，梯度復性來初步獲得重組蛋白； (III) 通過DEAE-52離子交換層析分離出VEGFI-M2-GRP6，該融合蛋白純度可達 SDS-PAGE電泳純。
【專利摘要】本發明屬于基因工程領域，本發明公開提供了一種重組VEGF的大腸桿菌菌株及制備方法。本發明提供的大腸桿菌菌株BL21(DE3)/VG6，CCTCC？NO：M2015497。該工程菌含有重組質粒pET28a-VEGF？I-M2-GRP6，質粒上有重組突變VEGF基因，該基因具有SEQ？ID？NO.1所示的基因序列。BL21(DE3)/VG6菌株經乳糖誘導，可高效表達重組蛋白VEGF？I-M2-GRP6。該重組蛋白預期可以提高機體對腫瘤細胞的免疫應答，打破免疫耐受，達到識別和殺滅腫瘤細胞的目的，對于抗腫瘤治療具有很好的臨床應用前景。CCTCC NO：M2021
【IPC分類】C12R1/19, C12N15/70, C12N1/21, C07K1/18, C07K19/00
【公開號】CN105420174
【申請號】CN201510648408
【發明人】曹榮月, 俞敏霞, 李曼曼, 馬云菲, 張昕黎, 袁玉婷, 苗梓韜
【申請人】中國藥科大學
【公開日】2016年3月23日
【申請日】2015年9月29日