一種重組羰基還原酶ReCR、編碼基因、載體、工程菌及應用
【專利說明】-種重組嚴基還原酶ReCR、編碼基因、載體、工程菌及應用 (-)技術領域
[0001] 本發明設及一種(S)-N-Boc-3-贓晚醇的制備方法，特別設及一種在兩相體系中生 物酶法不對稱還原N-Boc-3-贓晚酬制備手性純(S)-N-Boc-3-贓晚醇的方法。 (二)【背景技術】
[0002] 許多藥物分子均含有氮雜環結構單元。美國FDA批準的藥物數據分析表明，59%的 小分子藥物含有氮雜環，其中最常見的是六元環;在前25種最常用的氮雜環藥物中，排在第 一位的是贓晚結構的藥物。（S)-N-Boc-3-贓晚醇是一種重要的手性含氮飽和雜環醇，具有 活潑的官能團"-OH"和是合成多種生物活性物質的重要手性切塊。高抗追疾活性的 天然藥物常山堿和異常山堿、神經激膚受體的括抗劑心733,060, W及周期素依賴性激酶的 抑制劑夫拉平度都含有(S)-3-贓晚醇結構。此外，（S)-N-Boc-3-贓晚醇還是合成套細胞淋 己癌治療新藥依魯替尼的中間體。目前所知的（S)-N-Boc-3-贓晚醇的制備方法主要有化學 法不對稱合成和選擇性拆分，W及生物法不對稱合成。
[0003] 化學法不對稱合成（S)-N-Boc-3-贓晚醇的起始原料多樣，可^從心蘋果酸α-谷 氨酸或心天冬氨酸等手性酸出發，經縮合、還原等步驟合成，但是步驟繁瑣，催化劑昂貴、反 應條件較為嚴苛。化學法選擇性拆分一般是W外消旋的3-贓晚醇經手性精腦橫酸CSA或D- 酒石酸衍生物（2S，3S)-N-(4-氯苯基)-2,3-二徑基下酷胺酸的拆分得到（S)-3-贓晚醇鹽 類，再解鹽加上Boc保護基團，精制得到（S)-N-Boc-3-贓晚醇。化學拆分的理論收率只有 50%，所用的鈕碳催化劑昂貴，且后續產物分離比較繁瑣。
[0004] 生物酶法是通過對前手性底物N-Boc-3-贓晚酬的不對稱還原得到手性（S)-N- Boc-3-贓晚醇。最早被用來不對稱合成（S)-N-Boc-3-贓晚醇的生物催化劑是野生胡蘿h組 織，但該方法存在催化劑難W大量獲得，且產物收率和光學純度不夠高等問題。最近幾年， 越來越多的研究發現微生物來源的酶能夠將N-Boc-3-贓晚酬不對稱還原成對應的手性醇。 酬還原酶或醇脫氨酶WNAD(P化為輔酶，而輔酶NAD(P化價格昂貴，因此利用酬還原酶或醇 脫氨酶來不對稱合成（S)-N-Boc-3-贓晚醇需要高效的輔酶循環系統。專利文獻（CN 103131734A和CN 103571908A)公開了在不對稱合成（S)-N-Boc-3-贓晚醇中利用異丙醇作 為輔底物進行輔酶再生的方法，然而高濃度異丙醇對酶存在明顯的抑制作用，因而反應的 底物濃度不高，反應時間過長。專利文獻(CN104059952A、CN103789368A、CN104603278A)公 開了在不對稱合成（S)-N-Boc-3-贓晚醇中利用輔助酶(如葡萄糖脫氨酶或醇脫氨酶)和輔 底物(如葡萄糖或醇)進行輔酶再生的方法。輔助酶葡萄糖脫氨酶催化的反應生成副產物葡 萄糖酸，因而需要添加酸或堿W保持pH恒定的問題;輔助酶醇脫氨酶催化的反應往往是可 逆的，因而需要高濃度的輔底物并且需要較大的輔助酶。不對稱合成(S)-N-Boc-3-贓晚醇 的工業化應用，要求適用高濃度的底物，而高濃度的底物和副底物W及生成的高濃度產物 均會抑制酶活力，從而降低催化效率。因此，構建適用于不對稱合成(S)-N-Boc-3-贓晚醇的 高效、高光學純度、高底物濃度的生物酶法具有重要的研究意義和應用價值。 (Ξ)
【發明內容】

[0005]本發明目的是利用高效、立體選擇性專一的幾基還原酶，提高輔酶循環效率，減輕 高濃度底物、輔助底物及產物對酶活力的抑制，實現生物酶法催化高濃度底物不對稱合成
[5] -N-Boc-3-贓晚醇。
[0006] 本發明采用的技術方案是：
[0007] 本發明提供一種重組幾基還原酶ReCR，所述重組幾基還原酶ReCR的氨基酸序列為 沈Q ID NO.2所示。
[000引本發明還提供一種所述重組幾基還原酶ReCR編碼基因，所述編碼基因的核巧酸序 列為沈Q ID NO. 1所示。
[0009] 本發明還設及一種由所述重組幾基還原酶ReCR編碼基因構建的重組載體，W及含 所述重組幾基還原酶ReCR編碼基因的重組基因工程菌。優選所述的重組基因工程菌的構建 包括如下步驟：W來源于紅串紅球菌WZ010的基因組DNA為模板，經過PCR擴增得到SEQ ID NO. 1所示的重組幾基還原酶基因，然后克隆至表達載體祀ASY-E2上，將所述重組載體轉化 至大腸桿菌化2UDE3)中，即可得到所述含重組幾基還原酶基因的重組基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pEASY-E2-recr 〇
[0010] 此外，本發明還提供一種所述重組幾基還原酶ReCR在生物酶法制備(S)-N-Boc-3- 贓晚醇的中的應用，所述應用為含重組幾基還原酶ReCR編碼基因的工程菌經發酵培養 獲得的濕菌體或濕菌體經超聲破碎、分離純化獲得的酶為催化劑，WN-Boc-3-贓晚酬為底 物，W仲辛醇為輔助底物及有機相，護為輔酶，W抑6~9的緩沖液為反應介質構成兩相 反應體系（所述兩相為水相和有機相，水相指的是反應介質），在25~60°C、150~3(K)rpm條 件下反應，反應完全后將反應液分離純化，獲得(S)-N-Boc-3-贓晚醇;所述催化劑用量W濕 菌體重量計為10~500g/L反應體系(所述酶用量W酶活力單位計為400~19500U/L反應體 系，相當于W超聲破碎前濕菌體計為10~250g/L反應體系，優選2000~12000U/L);所述底 物終濃度為50~400g/L反應體系，輔酶終濃度為0.05~1.6mM，仲辛醇體積終濃度為7~ 90%。
[0011] 進一步，優選所述催化劑用量W濕菌體重量計為50~200g/L，所述底物終濃度為 100~200g/L反應體系，輔酶終濃度為0.1~0.8mM，仲辛醇體積終濃度為20~40%。
[0012] 進一步，優選所述反應條件為35°C、pH 8.0、30化pm。
[0013] 進一步，本發明所述濕菌體按如下方法制備：將含重組幾基還原酶ReCR編碼基因 的工程菌化.coli化2UDE3)/祀ASY-E2-recr)接種至含lOOyg/mL氨節青霉素的LB液體培 養基中，37°C培養12h，獲得種子液，將種子液W體積濃度2%的接種量接種至新鮮的含10化 g/mL氨節青霉素的LB液體培養基中，37°C培養至OD600為0.6~0.8，再加入終濃度為0.3mM的 IPTG，20°C誘導12h，獲得誘導培養液，再將誘導培養液于4 °C和1000化pm下離屯、lOmin，棄去 上清液，收集濕菌體。
[0014] 進一步，本發明所述濕菌體經超聲破碎、分離純化獲得的酶按如下方法制備：（1) 將含重組幾基還原酶ReCR編碼基因的工程菌經發酵培養獲得的濕菌體加入P服.0、Tris- HC1緩沖液中，在500W下超聲破碎20min，工作2s，間歇6s，破碎液于4°C和1000化pm下離屯、 lOmin，重復離屯、Ξ次后得到上清粗酶液;所述Tris-HCl緩沖液體積用量W濕菌體重量計為 15mL/g;(2)采用Ni-NTA金屬馨合親和層析，取上清粗酶液上樣至預平衡Ni2+柱中，再依次用 含lOmM咪挫、40mM咪挫、lOOmM咪挫、250mM咪挫的緩沖液洗脫雜蛋白和目的蛋白，收集含 lOOmM咪挫緩沖液的流出液用50mM、pH 8.0的化is-HCl緩沖液通過超濾濃縮脫鹽，所得的脫 鹽酶液，即為重組幾基還原酶ReCR酶液；所述緩沖液為含300mM氯化鋼的pH 8.0、50mM的 化is-HCl緩沖液，所述酶用量W酶活力單位計為400~19500U/L反應體系。
[0015] 本發明所述立體選擇性專一的重組幾基還原酶ReCRWNADH為輔酶，不可逆地催化 底物N-Boc-3-贓晚酬的不對稱還原生成（S)-N-Boc-3-贓晚醇，同時重組幾基還原酶ReCR通 過氧化輔底物仲辛醇將氧化型輔酶NA護還原成NADH，從而實現輔酶循環（圖1)。反應中所添 加的輔酶為NAD+。仲辛醇不僅作為輔底物，也是作為有機相構建兩相催化體系;兩相催化體 系結合整細胞催化法有效地減輕了高濃度底物、輔底物及產物對酶活力的抑制。
[0016] 所述的重組幾基還原酶ReCR編碼基因由如下方法得到：設計引物1(5'- ATGAAGGCAATCCAGTACAC-3'）和引物2(5'-CTACAGACCAGGGACCACA-3'）。利用PCR技術，W來源 于紅串紅球菌WZ010的基因組DNA為模板克隆出幾基還原酶基因片段。將該片段連接到 PEASY-E2載體上獲得克隆載體pEASY-E2-recr并將其轉化于大腸桿菌Transl-Tl中。對重組 質粒測序，并利用軟件對測序結果進行分析，該序列含有一個長為l〇47bp的開放閱讀框 (SEQ ID NO. 1)，利用軟件對該基因序列進行分析，推知所述幾基還原酶基因編碼的氨基酸 序列如沈Q ID NO.2所示。
[0017] 所述幾基還原酶ReCR編碼基因源自紅串紅球菌WZ010(Rhodococcus eirthropo 1 iS WZ010)。紅串紅球菌WZ010保藏于中國典型培養物保藏中屯、，地址：中國武 漢，武漢大學，430072,保藏編號:CCTCC No:M 2011336,保藏日期：