本發(fa)明涉及(ji)一種聯產琥珀酸和異戊二烯的基因(yin)工(gong)程菌(jun)及(ji)其(qi)構建(jian)方法，屬(shu)于基因(yin)工(gong)程技術領域(yu)。

背景技術：

異(yi)(yi)戊(wu)二(er)烯(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)是一種重要(yao)的化(hua)工平臺化(hua)合(he)物，其(qi)95％用(yong)于合(he)成橡(xiang)膠；也是丁基橡(xiang)膠的第二(er)單體(ti)。此外(wai)，還可廣泛應用(yong)于農(nong)藥、醫藥、香料(liao)(liao)及粘(zhan)結劑等領域。目前，異(yi)(yi)戊(wu)二(er)烯(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)的來源(yuan)主要(yao)是通過石油基原(yuan)料(liao)(liao)異(yi)(yi)戊(wu)烷(wan)、異(yi)(yi)戊(wu)烯(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)脫氫法(fa)(fa)(fa)、化(hua)學合(he)成法(fa)(fa)(fa)(包(bao)括異(yi)(yi)丁烯(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)-甲醛法(fa)(fa)(fa)、乙炔-丙酮(tong)法(fa)(fa)(fa)、丙烯(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)二(er)聚法(fa)(fa)(fa))和裂解C5餾(liu)分(fen)萃(cui)取蒸餾(liu)法(fa)(fa)(fa)。然而，隨著(zhu)化(hua)石資源(yuan)的日益枯竭，原(yuan)料(liao)(liao)來源(yuan)是利(li)用(yong)石油基原(yuan)料(liao)(liao)制備異(yi)(yi)戊(wu)二(er)烯(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)的重要(yao)瓶頸問題。以可再生(sheng)的生(sheng)物質(zhi)為原(yuan)料(liao)(liao)，利(li)用(yong)生(sheng)物轉化(hua)技術合(he)成異(yi)(yi)戊(wu)二(er)烯(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)，因(yin)具有(you)可持續(xu)性、環(huan)境友好、品質(zhi)優異(yi)(yi)等優勢，已(yi)成為國際上的研究熱點。

目前，生(sheng)物(wu)基異(yi)(yi)戊(wu)二烯的生(sheng)物(wu)合(he)(he)成(cheng)(cheng)(cheng)路線主要是以葡萄糖(tang)(tang)為原(yuan)料，利用甲羥戊(wu)酸(MVA)或甲基赤(chi)蘚糖(tang)(tang)-5-磷酸(MEP)途徑(jing)合(he)(he)成(cheng)(cheng)(cheng)異(yi)(yi)戊(wu)二烯(Jianming Yang,2012)。然(ran)而，不管是哪條(tiao)合(he)(he)成(cheng)(cheng)(cheng)路線，都會在(zai)合(he)(he)成(cheng)(cheng)(cheng)異(yi)(yi)戊(wu)二烯的同時(shi)，產(chan)生(sheng)二氧化(hua)碳(tan)，這樣會造(zao)成(cheng)(cheng)(cheng)碳(tan)轉(zhuan)化(hua)率的損失(shi)，造(zao)成(cheng)(cheng)(cheng)原(yuan)料葡萄糖(tang)(tang)的浪(lang)費，增加(jia)合(he)(he)成(cheng)(cheng)(cheng)成(cheng)(cheng)(cheng)本，限制了該技術的發展和應用。此外，已有異(yi)(yi)戊(wu)二烯生(sheng)物(wu)合(he)(he)成(cheng)(cheng)(cheng)的報道多(duo)數是有氧發酵，由(you)于(yu)異(yi)(yi)戊(wu)二烯與氧氣(qi)混合(he)(he)，能(neng)形(xing)成(cheng)(cheng)(cheng)爆炸性混合(he)(he)物(wu)，使其生(sheng)物(wu)合(he)(he)成(cheng)(cheng)(cheng)存在(zai)安全(quan)風險。

琥珀酸(suan)(suan)(suan)(suan)可用(yong)(yong)于食品添加劑(ji)(ji)，藥物添加劑(ji)(ji)，去污劑(ji)(ji)添加物，發泡(pao)劑(ji)(ji)，離子(zi)螯(ao)合劑(ji)(ji)。目(mu)前，國際市場上工(gong)業用(yong)(yong)琥珀酸(suan)(suan)(suan)(suan)的(de)年(nian)需求量超(chao)過(guo)15,000噸，售價(jia)在$5.90～8.80/kg(因純度而異)，市場潛力(li)較大。目(mu)前，許多的(de)化工(gong)產品都(dou)是(shi)(shi)以(yi)(yi)苯(ben)為原料(liao)(liao)的(de)，但苯(ben)是(shi)(shi)石(shi)油化工(gong)產品，不具有可再生(sheng)(sheng)(sheng)性(xing)。從(cong)長(chang)遠考慮必須找(zhao)到合適的(de)可再生(sheng)(sheng)(sheng)原料(liao)(liao)取代苯(ben)。利(li)用(yong)(yong)生(sheng)(sheng)(sheng)物技術，發酵合成(cheng)琥珀酸(suan)(suan)(suan)(suan)是(shi)(shi)近(jin)年(nian)來得研究熱點(dian)。葡萄糖經(jing)糖酵解途(tu)徑(jing)生(sheng)(sheng)(sheng)產磷酸(suan)(suan)(suan)(suan)烯醇式丙(bing)酮酸(suan)(suan)(suan)(suan)(PEP)和丙(bing)酮酸(suan)(suan)(suan)(suan)。PEP經(jing)羧(suo)化生(sheng)(sheng)(sheng)成(cheng)草酰乙(yi)酸(suan)(suan)(suan)(suan)，繼而還原生(sheng)(sheng)(sheng)成(cheng)琥珀酸(suan)(suan)(suan)(suan)及(ji)延胡索酸(suan)(suan)(suan)(suan)，最后再經(jing)一步還原生(sheng)(sheng)(sheng)成(cheng)琥珀酸(suan)(suan)(suan)(suan)。常規(gui)利(li)用(yong)(yong)代謝工(gong)程方(fang)(fang)法(fa)改造大腸桿菌以(yi)(yi)生(sheng)(sheng)(sheng)產琥珀酸(suan)(suan)(suan)(suan)的(de)方(fang)(fang)法(fa)是(shi)(shi)通過(guo)失活丙(bing)酮酸(suan)(suan)(suan)(suan)-甲酸(suan)(suan)(suan)(suan)裂解酶(mei)和乳酸(suan)(suan)(suan)(suan)脫氫酶(mei)以(yi)(yi)消除(chu)包括甲酸(suan)(suan)(suan)(suan)、乙(yi)酸(suan)(suan)(suan)(suan)、乙(yi)醇和乳酸(suan)(suan)(suan)(suan)等(deng)競爭途(tu)徑(jing)。Millard等(deng)人通過(guo)在大腸桿菌JCL1208中過(guo)量表達(da)PEP羧(suo)化酶(mei)，可以(yi)(yi)使琥珀酸(suan)(suan)(suan)(suan)產量提(ti)高3.5倍，但過(guo)量表達(da)PEP激酶(mei)卻(que)沒有任何效果。

在(zai)(zai)琥珀(po)酸(suan)(suan)合(he)成(cheng)過(guo)(guo)程(cheng)中(zhong)(zhong)，不(bu)管(guan)是(shi)利(li)用(yong)PEP還(huan)是(shi)用(yong)丙(bing)酮酸(suan)(suan)合(he)成(cheng)，都需要(yao)(yao)利(li)用(yong)一(yi)分子(zi)(zi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)二(er)氧(yang)(yang)(yang)化(hua)(hua)(hua)碳(tan)。如果能聯產(chan)(chan)異戊二(er)烯(xi)(xi)和(he)琥珀(po)酸(suan)(suan)，使合(he)成(cheng)異戊二(er)烯(xi)(xi)過(guo)(guo)程(cheng)中(zhong)(zhong)釋放的(de)(de)(de)(de)(de)(de)二(er)氧(yang)(yang)(yang)化(hua)(hua)(hua)碳(tan)用(yong)于(yu)(yu)合(he)成(cheng)琥珀(po)酸(suan)(suan)，就可避(bi)免碳(tan)原(yuan)子(zi)(zi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)浪費。此外(wai)(wai)，在(zai)(zai)厭(yan)氧(yang)(yang)(yang)條件下(xia)，由于(yu)(yu)不(bu)存在(zai)(zai)外(wai)(wai)源(yuan)電子(zi)(zi)受體(ti)，要(yao)(yao)以(yi)中(zhong)(zhong)間(jian)產(chan)(chan)物為 電子(zi)(zi)受體(ti)二(er)自身得(de)以(yi)氧(yang)(yang)(yang)化(hua)(hua)(hua)，要(yao)(yao)保證細(xi)胞內氧(yang)(yang)(yang)化(hua)(hua)(hua)還(huan)原(yuan)平(ping)(ping)衡(heng)。即現有方(fang)法中(zhong)(zhong)碳(tan)原(yuan)子(zi)(zi)利(li)用(yong)最大化(hua)(hua)(hua)與氧(yang)(yang)(yang)化(hua)(hua)(hua)還(huan)原(yuan)平(ping)(ping)衡(heng)之間(jian)存在(zai)(zai)矛盾(dun)，若要(yao)(yao)滿(man)足(zu)氧(yang)(yang)(yang)化(hua)(hua)(hua)還(huan)原(yuan)平(ping)(ping)衡(heng)，底物中(zhong)(zhong)一(yi)半的(de)(de)(de)(de)(de)(de)碳(tan)原(yuan)子(zi)(zi)會以(yi)PEP或(和(he))草酰乙(yi)酸(suan)(suan)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)形式積累(lei)；若要(yao)(yao)滿(man)足(zu)碳(tan)最大化(hua)(hua)(hua)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)流向目(mu)(mu)標產(chan)(chan)物，又(you)需要(yao)(yao)額外(wai)(wai)添加NADH。然而，基(ji)于(yu)(yu)細(xi)胞代謝的(de)(de)(de)(de)(de)(de)復雜性，通過(guo)(guo)基(ji)因(yin)工程(cheng)技術(shu)實(shi)現將異戊二(er)烯(xi)(xi)合(he)成(cheng)過(guo)(guo)程(cheng)中(zhong)(zhong)產(chan)(chan)生的(de)(de)(de)(de)(de)(de)二(er)氧(yang)(yang)(yang)化(hua)(hua)(hua)碳(tan)用(yong)于(yu)(yu)琥珀(po)酸(suan)(suan)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)合(he)成(cheng)存在(zai)(zai)很大的(de)(de)(de)(de)(de)(de)不(bu)可預知性和(he)不(bu)確定性，因(yin)此，目(mu)(mu)前尚(shang)沒(mei)有聯產(chan)(chan)異戊二(er)烯(xi)(xi)和(he)琥珀(po)酸(suan)(suan)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)報(bao)道。

技術實現要素：

為解決上述(shu)問(wen)題，本發(fa)明提供了一種(zhong)聯(lian)產琥珀酸和(he)異戊(wu)二烯的(de)(de)基因工程(cheng)菌(jun)及(ji)其構(gou)建方(fang)法，所采取(qu)的(de)(de)技術方(fang)案(an)如下：

本發(fa)明的(de)(de)一(yi)個(ge)目(mu)的(de)(de)在于(yu)提(ti)供一(yi)種(zhong)聯產琥(hu)珀酸和異(yi)(yi)戊二烯(xi)的(de)(de)基(ji)因工(gong)程(cheng)菌。該(gai)基(ji)因工(gong)程(cheng)菌是(shi)在大腸桿菌中同時過(guo)表達異(yi)(yi)戊二烯(xi)合成途徑所需酶(mei)的(de)(de)基(ji)因和丙酮酸羧化酶(mei)基(ji)因。

優選地，所述異戊二(er)烯合成途(tu)徑(jing)，是(shi)異戊二(er)烯MVA合成途(tu)徑(jing)或MEP合成途(tu)徑(jing)。

優選地，所述基(ji)因(yin)(yin)(yin)工程菌(jun)是在(zai)大(da)腸桿菌(jun)中共表達乙(yi)酰(xian)輔(fu)酶(mei)(mei)A酰(xian)基(ji)轉移酶(mei)(mei)/羥(qian)甲(jia)基(ji)戊(wu)(wu)二酰(xian)輔(fu)酶(mei)(mei)A還原(yuan)酶(mei)(mei)基(ji)因(yin)(yin)(yin)、3-羥(qian)-3-甲(jia)基(ji)戊(wu)(wu)二酰(xian)輔(fu)酶(mei)(mei)A合酶(mei)(mei)基(ji)因(yin)(yin)(yin)、甲(jia)羥(qian)戊(wu)(wu)酸(suan)激(ji)酶(mei)(mei)基(ji)因(yin)(yin)(yin)、甲(jia)羥(qian)戊(wu)(wu)酸(suan)-5-磷酸(suan)激(ji)酶(mei)(mei)基(ji)因(yin)(yin)(yin)、甲(jia)羥(qian)戊(wu)(wu)酸(suan)-5-二磷酸(suan)脫羧(suo)酶(mei)(mei)基(ji)因(yin)(yin)(yin)、異戊(wu)(wu)烯焦磷酸(suan)異構酶(mei)(mei)基(ji)因(yin)(yin)(yin)、異戊(wu)(wu)二烯合成酶(mei)(mei)基(ji)因(yin)(yin)(yin)和丙酮酸(suan)羧(suo)化酶(mei)(mei)基(ji)因(yin)(yin)(yin)。

更優選地(di)，所述(shu)(shu)乙酰輔(fu)酶(mei)A酰基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)轉移酶(mei)/羥(qian)甲(jia)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)戊(wu)二(er)(er)酰輔(fu)酶(mei)A還原酶(mei)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)、3-羥(qian)-3-甲(jia)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)戊(wu)二(er)(er)酰輔(fu)酶(mei)A合酶(mei)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)和(he)異(yi)戊(wu)二(er)(er)烯(xi)合成酶(mei)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)連接(jie)于pACYCDuet-1質粒(li)的多克隆位(wei)點(dian)上(shang)；所述(shu)(shu)甲(jia)羥(qian)戊(wu)酸激酶(mei)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)、甲(jia)羥(qian)戊(wu)酸-5-磷酸激酶(mei)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)、甲(jia)羥(qian)戊(wu)酸-5-二(er)(er)磷酸脫羧酶(mei)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)和(he)異(yi)戊(wu)烯(xi)焦(jiao)磷酸異(yi)構酶(mei)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)連接(jie)于pTrc質粒(li)的多克隆位(wei)點(dian)上(shang)；所述(shu)(shu)丙酮酸羧化酶(mei)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)連接(jie)于pCOLADuet-1質粒(li)上(shang)。

優選地，所(suo)述大(da)腸桿菌，共表達1-脫氧-D-木酮糖-5-磷(lin)(lin)酸合成酶基(ji)(ji)因(yin)、5-磷(lin)(lin)酸脫氧木酮糖還原異(yi)構酶基(ji)(ji)因(yin)、異(yi)戊二烯合成酶基(ji)(ji)因(yin)和丙酮酸羧(suo)化酶基(ji)(ji)因(yin)。

更(geng)優選地，所述1-脫氧-D-木(mu)酮(tong)糖-5-磷酸合成酶基(ji)因(yin)、5-磷酸脫氧木(mu)酮(tong)糖還原(yuan)異(yi)構酶基(ji)因(yin)和異(yi)戊二烯合成酶基(ji)因(yin)連(lian)接(jie)于(yu)pACYDuet-1質粒(li)的多(duo)克隆表達位點上；所述丙酮(tong)酸羧化酶基(ji)因(yin)連(lian)接(jie)于(yu)pCOLADuet-1質粒(li)上。

本(ben)發明(ming)的(de)另一目的(de)是提供一種所述基因工(gong)程(cheng)菌(jun)的(de)構建方(fang)法(fa)，該方(fang)法(fa)的(de)步(bu)驟如下：

1)將(jiang)乙酰輔酶(mei)(mei)A酰基(ji)(ji)轉移酶(mei)(mei)基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)/羥甲基(ji)(ji)戊二(er)酰輔酶(mei)(mei)A還(huan)原酶(mei)(mei)基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)mvaE、3-羥-3-甲基(ji)(ji)戊二(er)酰輔酶(mei)(mei)A合(he)酶(mei)(mei)基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)mvaS以及異(yi)戊二(er)烯合(he)成酶(mei)(mei)基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)isps4克隆(long)到質(zhi)粒pACYCDuet-1，構建重組質(zhi)粒pACY-mvaE-mvaS-isps4；

2)將甲羥(qian)戊酸(suan)激酶基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)ERG12、甲羥(qian)戊酸(suan)-5-磷酸(suan)激酶基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)ERG8、甲羥(qian)戊酸(suan)-5-二磷酸(suan)脫羧酶基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)ERG19以及異戊烯焦(jiao)磷酸(suan)異構酶基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)IDI1克隆到pTrcHis2B，得(de)到重(zhong)組質(zhi)粒pTrc-low；

3)將(jiang)丙酮酸羧化(hua)酶(mei)基因pyc克隆到質粒(li)pCOLADUet-1上(shang)，得到重(zhong)組質粒(li)pCOLA-PYC；

4)將步驟1)，2)和3)所(suo)得(de)的重組(zu)質粒轉化到大腸桿(gan)菌宿主細胞(bao)中，獲得(de)基因工程(cheng)菌。

本發(fa)明還提供了(le)另(ling)一種所述基(ji)因工程菌(jun)的(de)(de)構建方法(fa)，該方法(fa)的(de)(de)步(bu)驟如下：

1)將丙酮(tong)酸(suan)羧化酶(mei)基因pyc克隆到質(zhi)粒pCOLADUet-1上，得到重(zhong)組質(zhi)粒pCOLA-PYC；

2)將1-脫(tuo)氧-D-木酮糖-5-磷(lin)酸合成酶(mei)基(ji)因(yin)dxs、5-磷(lin)酸脫(tuo)氧木酮糖還原異構(gou)酶(mei)基(ji)因(yin)dxr和異戊二烯合成酶(mei)基(ji)因(yin)isps4克隆到質粒(li)pACYCDuet-1，構(gou)建重組質粒(li)pACY-dxs-dxr-isps4；

3)將步驟(zou)1)和步驟(zou)2)所制備的重(zhong)組質(zhi)粒轉化到大腸桿菌宿主細胞中，獲得(de)基因(yin)工(gong)程菌。

所述(shu)任一基因工程菌(jun)在(zai)發酵生產異戊二烯和琥珀(po)酸中的應用也在(zai)本發明的保護范圍之內。

所述應用的(de)步驟如下：

1)將(jiang)權利要求1所(suo)述基因工程菌接種到M9種子培(pei)養基中，在37℃、180rpm活化培(pei)養18-24h，獲(huo)得種子菌液；

2)將步驟1)所得的種子菌液以10％的接種量接種到發酵培養基中，在轉速300-800rpm，37℃的條件下培養至OD₆₀₀為(wei)20-40，再添加(jia)總濃度為(wei)0.1-1.0mM的IPTG，關(guan)閉空氣，通過氮氣或二(er)氧(yang)化碳，并(bing)利用(yong)氨水或碳酸鉀(jia)控制pH在7.0，在厭氧(yang)25-37℃的條件下誘導表達。

本發明所涉(she)及的各種基(ji)因(yin)(yin)中，所述(shu)(shu)乙酰(xian)輔酶(mei)(mei)(mei)(mei)A酰(xian)基(ji)轉(zhuan)移酶(mei)(mei)(mei)(mei)基(ji)因(yin)(yin)/羥甲基(ji)戊(wu)(wu)(wu)二酰(xian)輔酶(mei)(mei)(mei)(mei)A還(huan)(huan)原酶(mei)(mei)(mei)(mei)基(ji)因(yin)(yin)、3-羥-3-甲基(ji)戊(wu)(wu)(wu)二酰(xian)輔酶(mei)(mei)(mei)(mei)A合酶(mei)(mei)(mei)(mei)基(ji)因(yin)(yin)優選來源(yuan)于糞腸(chang)(chang)球(qiu)菌(jun)(Enterococcus faecalis)；所述(shu)(shu)甲羥戊(wu)(wu)(wu)酸(suan)激酶(mei)(mei)(mei)(mei)基(ji)因(yin)(yin)、甲羥戊(wu)(wu)(wu)酸(suan)-5-磷(lin)(lin)酸(suan)激酶(mei)(mei)(mei)(mei)基(ji)因(yin)(yin)、甲羥戊(wu)(wu)(wu)酸(suan)-5-二磷(lin)(lin)酸(suan)脫羧酶(mei)(mei)(mei)(mei)基(ji)因(yin)(yin)、異(yi)(yi)戊(wu)(wu)(wu)烯焦磷(lin)(lin)酸(suan)異(yi)(yi)構酶(mei)(mei)(mei)(mei)基(ji)因(yin)(yin)優選來源(yuan)于釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。所述(shu)(shu)異(yi)(yi)戊(wu)(wu)(wu)二烯合成(cheng)酶(mei)(mei)(mei)(mei)基(ji)因(yin)(yin)來源(yuan)于銀白楊(yang)(Populus alba)；所述(shu)(shu)丙酮(tong)酸(suan)羧化(hua)酶(mei)(mei)(mei)(mei)基(ji)因(yin)(yin)，優選來源(yuan)于枯草芽(ya)孢(bao)桿菌(jun)(Bacillus subtilis)；所述(shu)(shu)1-脫氧-D-木酮(tong)糖(tang)-5-磷(lin)(lin)酸(suan)合成(cheng)酶(mei)(mei)(mei)(mei)基(ji)因(yin)(yin)、5-磷(lin)(lin)酸(suan)脫氧木酮(tong)糖(tang)還(huan)(huan)原異(yi)(yi)構酶(mei)(mei)(mei)(mei)基(ji)因(yin)(yin)，優選來源(yuan)于枯草芽(ya)孢(bao)桿菌(jun)(Bacillus subtilis)或大腸(chang)(chang)桿菌(jun)。

本發明所述宿主大腸(chang)桿菌優選大腸(chang)桿菌BL21(DE3)。

本發明獲得(de)的有益(yi)效果如下：

(1)沒有碳的浪費，具(ju)有原子經濟性。

(2)產(chan)品(pin)異戊二烯和(he)琥珀酸(suan)都(dou)是具(ju)有(you)(you)很(hen)高(gao)附加值(zhi)的產(chan)品(pin)，具(ju)有(you)(you)創造性(xing)。

(3)產品(pin)異戊二烯為(wei)氣體(ti)，琥珀酸為(wei)液體(ti)，易于分(fen)離，具(ju)有(you)規模化潛力。

(4)有(you)助于細(xi)胞體內氧化(hua)還原平衡，提高目(mu)標產物(wu)總(zong)產率。

(5)本發明沒有二氧化碳氣體排放，綠色(se)環保。

附圖說明

圖(tu)1為pLWPYC1的(de)質粒(li)圖(tu)譜。

具體實施方式

下面結合(he)具體實(shi)施例對本發(fa)明(ming)做進一(yi)步說(shuo)明(ming)，但本發(fa)明(ming)不(bu)受實(shi)施例的(de)限制。

以(yi)下實施例(li)中所(suo)用材料、試劑(ji)、儀(yi)器(qi)和(he)方法，未經特殊(shu)說明(ming)，均為本領域中的常(chang)規材料、試劑(ji)、儀(yi)器(qi)和(he)方法，均可通過商(shang)業渠道獲得(de)。

實施例1

(1)丙酮酸羧(suo)化酶基因的(de)克隆、表(biao)達

以枯草芽孢桿菌的基因組(Bacillus subtilis subsp.subtilis str.168，NC_000964.3)為模板，擴增基因片段，同時連入酶切位點AatⅡ和XhoI。以PYC-F-AatⅡ:5’-ATCGGACGTCATGTTTGGTGACAAGGTAAAAG-3’

PYC-R-XhoI:5’-CCGCTCGAGTTATGCTTTTTCAATTTCAAGG-3’為(wei)引物，以枯草芽孢桿菌的DNA為(wei)模板進(jin)行擴增。擴增體系如表1所示：

表1 PCR擴增體系(xi)

PCR擴(kuo)增程序：95℃預變性(xing)5min；95℃變性(xing)30s，53℃退火(huo)30s，72℃延伸2min，35個循環；72℃延伸10min。PCR產(chan)物純化后，利用內切(qie)酶(mei)AatⅡ和XhoI進(jin)行雙酶(mei)切(qie)，再連接到同樣進(jin)行雙酶(mei)切(qie)的pCOLADUet-1載體上，形成質(zhi)粒pLWPYC1。

連接產物轉化E.coli DH5α，然后涂布加有50μg·mL^-1卡那霉素的LB固體(ti)平板(ban)，PCR篩選(xuan)陽性(xing)(xing)克隆，從(cong)陽性(xing)(xing)克隆中提(ti)取(qu)重組質粒后，再通過限制(zhi)性(xing)(xing)酶切和測序鑒(jian)定。

(2)E.coli重組(zu)菌株的構(gou)建

將來源(yuan)于糞腸球菌(Enterococcus faecalis)的(de)(de)乙酰輔(fu)酶(mei)(mei)A酰基(ji)(ji)(ji)(ji)轉移(yi)酶(mei)(mei)基(ji)(ji)(ji)(ji)因/羥(qian)(qian)(qian)甲(jia)基(ji)(ji)(ji)(ji)戊(wu)(wu)(wu)二酰輔(fu)酶(mei)(mei)A還原酶(mei)(mei)基(ji)(ji)(ji)(ji)因mvaE，3-羥(qian)(qian)(qian)-3-甲(jia)基(ji)(ji)(ji)(ji)戊(wu)(wu)(wu)二酰輔(fu)酶(mei)(mei)A合(he)酶(mei)(mei)基(ji)(ji)(ji)(ji)因mvaS和來源(yuan)于楊樹(Populus alba)的(de)(de)的(de)(de)異戊(wu)(wu)(wu)二烯合(he)成酶(mei)(mei)基(ji)(ji)(ji)(ji)因isps4(Gen Bank No.AB198180)連(lian)接(jie)到(dao)pACYCDuet-1質(zhi)(zhi)粒(li)(li)(li)的(de)(de)多克隆(long)位點上，具體(ti)連(lian)接(jie)方(fang)法(fa)參(can)見文獻(Bioresource Technology 104(2012)642–647)，構(gou)建出MVA上游質(zhi)(zhi)粒(li)(li)(li)(pACY-MvaE-MVAS-isps4)。將來源(yuan)于釀酒(jiu)酵母的(de)(de)甲(jia)羥(qian)(qian)(qian)戊(wu)(wu)(wu)酸(suan)(suan)激酶(mei)(mei)基(ji)(ji)(ji)(ji)因ERG12，甲(jia)羥(qian)(qian)(qian)戊(wu)(wu)(wu)酸(suan)(suan)-5-磷酸(suan)(suan)激酶(mei)(mei)基(ji)(ji)(ji)(ji)因ERG8，甲(jia)羥(qian)(qian)(qian)戊(wu)(wu)(wu)酸(suan)(suan)-5-二磷酸(suan)(suan)脫羧(suo)酶(mei)(mei)基(ji)(ji)(ji)(ji)因ERG19，異戊(wu)(wu)(wu)烯焦磷酸(suan)(suan)異構(gou)酶(mei)(mei)基(ji)(ji)(ji)(ji)因IDI1，連(lian)接(jie)到(dao)質(zhi)(zhi)粒(li)(li)(li)pTrcHis2B上，具體(ti)連(lian)接(jie)方(fang)法(fa)參(can)加(jia)文獻(Bioresource Technology 104(2012)642–647)，形成MVA下游質(zhi)(zhi)粒(li)(li)(li)pTrc-low。將MVA上游質(zhi)(zhi)粒(li)(li)(li)(pACY-MvaE-MVAS-isps4)和下游途徑質(zhi)(zhi)粒(li)(li)(li)pTrc-low及pLWPYC1共同熱(re)擊轉化到(dao)E.coli BL21(DE3)感(gan)受態細胞，涂布于加(jia)有氯霉素(su)、卡那霉素(su)和氨(an)芐霉素(su)抗生素(su)的(de)(de)LB固(gu)體(ti)平(ping)板(ban)，通過PCR篩選(xuan)獲得陽性克隆(long)，由此獲得工程大腸桿菌LWPYC1。

將MVA上游(pACY-MvaE-MVAS-isps4)和(he)下游途徑(jing)(pTrc-ERG12-EGR8-ERG19-IDI1)共同熱擊轉化E.coli BL21(DE3)感受態細胞，涂布于加有氯霉(mei)素和(he)氨芐霉(mei)素抗(kang)生素的LB固體平板，由此獲得(de)工程大(da)腸桿菌(jun)LWIP1作為(wei)對照菌(jun)。

(3)發(fa)酵產異戊二烯和琥珀酸

挑取步(bu)驟(2)獲得的LWPYC1的白色單(dan)克隆(12h內(nei)長出的)在(zai)3ml LB(氯霉(mei)素(su)(su)Cm+氨芐霉(mei)素(su)(su)Amp+卡那(nei)霉(mei)素(su)(su)Kan,1‰)中(zhong)，于37℃搖床培養活化。菌體濃度為1.0左右轉接至(zhi)30ml LB(Amp+Cm+Kan)中(zhong)進行擴培，作(zuo)為種子。

取擴培后的菌液按1％接種量接入100ml發酵培養基(K₂HPO₄·3H₂O 0.98g；一水合檸檬酸0.21g；檸檬酸鐵銨0.03g；MD牛肉粉0.9g；葡萄糖0.2g；MgSO₄(1M)200ul；微量元素100μl((NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O 7.4g/L，ZnSO₄·7H₂O 5.8g/L，H₃BO₄49.4g/L，CuSO₄·5H₂O 5g/L，MnCl₂·4H₂O 31.6g/L)；氨芐青霉素50μg/mL；氯(lv)霉素34μg/mL)，37℃搖菌，菌體濃度長至(zhi)1.0左右加入終濃度為(wei)0.5mM的IPTG，加瓶塞，進行厭氧發酵。30℃，180rpm搖菌。

對照(zhao)菌LWIP1培養(yang)同(tong)LWPYC1，僅抗生素為(Amp+Cm)。

(4)產物檢測

發酵(jiao)24-48h后，抽上層(ceng)氣體進(jin)行GC-MS檢(jian)測異戊二(er)烯。取發酵(jiao)液(ye)檢(jian)測琥(hu)(hu)珀酸(suan)(suan)。琥(hu)(hu)珀酸(suan)(suan)的(de)(de)檢(jian)測利用LC-MS進(jin)行。結果表明菌(jun)株LWPYC1可合成0.8g/L異戊二(er)烯及(ji)1g/L的(de)(de)琥(hu)(hu)珀酸(suan)(suan)，異戊二(er)烯和琥(hu)(hu)珀酸(suan)(suan)的(de)(de)總轉化率(lv)(lv)之和達35.5％；對照菌(jun)LWIP1合成異戊二(er)烯0.79g/L及(ji)200mg/L琥(hu)(hu)珀酸(suan)(suan)。轉化率(lv)(lv)為11％。

實施例2

(1)E.coli重組菌(jun)株的構建(jian)

將經過密碼子優化(hua)后的(de)來源于楊樹(shu)(Populus nigra)的(de)異(yi)戊(wu)二烯合(he)(he)成(cheng)酶基(ji)因(yin)ispS(GenBank accession No.HQ684728)和來源于枯草芽孢(bao)桿(gan)菌(jun)(jun)(Bacillus subtilis)的(de)1-脫氧-D-木酮(tong)糖-5-磷(lin)酸合(he)(he)成(cheng)酶基(ji)因(yin)dxs(Gene ID:938609)和1-脫氧-D-木酮(tong)糖-5-磷(lin)酸還原異(yi)構酶基(ji)因(yin)dxr(Gene ID:939636)連接(jie)到質粒(li)pACYCDuet-1上，構建出(chu)質粒(li)pAdxs2/dxr2/ispS，具體連接(jie)方法參加(jia)文獻(Applied Microbiology and Biotechnology(2011)90:1915–1922)。將質粒(li)pAdxs2/dxr2/ispS轉化(hua)導入(ru)E.coli BL21(DE3)細胞(bao)中，構建出(chu)含有MEP途徑的(de)工程(cheng)菌(jun)(jun)株ZYR4。將ZYR4制備成(cheng)感受態細胞(bao)，再將質粒(li)pLWPYC1轉入(ru)感受態細胞(bao)，涂布(bu)于加(jia)有氯霉素(su)和卡那霉素(su)的(de)LB固體平板(ban)，通過PCR篩選獲得(de)陽性克(ke)隆(long)，由此(ci)獲得(de)工程(cheng)大腸(chang)桿(gan)菌(jun)(jun)LWPYC2。以工程(cheng)菌(jun)(jun)ZYR4作為對(dui)照菌(jun)(jun)。

(3)發酵產異戊二烯和(he)琥珀酸(suan)

挑取步驟(2)獲(huo)得的(de)(de)LWPYC2的(de)(de)白色單(dan)克隆(12h內(nei)長(chang)出的(de)(de))在3ml LB(Cm+Kan,1‰)中，于37℃搖床培養活(huo)化。菌液(ye)濃度為(wei)1.0左右轉接(jie)至30ml LB(Cm+Kan)中進行擴培，作(zuo)為(wei)種子(zi)。

取擴培后的菌液按1％接種量接入100ml發酵培養基(K₂HPO₄·3H₂O 0.98g；一水合檸檬酸0.21g；檸檬酸鐵銨0.03g；MD牛肉粉0.9g；葡萄糖0.2g；MgSO₄(1M)200ul；微量元素100μl((NH₄)6Mo₇O₂₄·4H₂O 7.4g/L，ZnSO₄·7H₂O 5.8g/L，H₃BO₄49.4g/L，CuSO₄·5H₂O5g/L，MnCl₂·4H₂O 31.6g/L)；氨芐青霉素50μg/mL；氯霉素34μg/mL)，37℃搖菌(jun)，菌(jun)濃長(chang)至1.0左右加入(ru)終濃度(du)為0.5mM的IPTG，加瓶塞，進行厭氧發酵。30℃，180rpm搖菌(jun)。對照菌(jun)ZYR4培養同LWPYC2，僅抗(kang)生素為氯霉素。

(4)產物檢測

發(fa)酵24-48h后，抽上(shang)層氣(qi)體進行GC-MS檢(jian)測異戊(wu)(wu)二烯(xi)(xi)。取發(fa)酵液檢(jian)測琥(hu)珀(po)酸(suan)。琥(hu)珀(po)酸(suan)的(de)檢(jian)測利(li)用琥(hu)珀(po)酸(suan)檢(jian)測試劑盒(he)(Oxaloacetate Assay Kit,sigma)進行。結(jie)果表明菌(jun)株LWPYC2可合(he)成(cheng)(cheng)300mg/L異戊(wu)(wu)二烯(xi)(xi)及(ji)5g/L的(de)琥(hu)珀(po)酸(suan)；對(dui)照菌(jun)ZYR4合(he)成(cheng)(cheng)異戊(wu)(wu)二烯(xi)(xi)280mg/L及(ji)400mg/L琥(hu)珀(po)酸(suan)。

實施例3

M9種子培養基(/L)：20g葡萄糖，6g Na₂HPO₄，3g KH₂PO₄，1g NH₄Cl，0.5gNaCl，0.24g MgSO₄，121℃高(gao)壓蒸汽滅菌15min。

發酵培養基(/2L)：19.6g K₂HPO₄·3H₂O，4.2g citric acid·H₂O，0.6g檸檬酸鐵銨，0.8ml濃硫酸，40g葡萄糖，0.123mg(NH₄)₆Mo₇O₂·4H2O，0.097mg ZnSO₄·7H₂O，0.823mg H₃BO₄，0.083mg CuSO₄·5H₂O，0.527mg MnCl₂·4H₂O，4ml 1M MgSO₄，1900ml蒸餾(liu)水。

挑取菌株LWPYC1單克隆到50ml M9種子培養基中，37℃、180rpm活化過夜(18-24h)。將種子按10％的接種量接種至含有2L發酵培養基的5L小型發酵罐中，通氣量1.3VVM，轉速400rpm，37℃培養至OD₆₀₀約為20時，添加終濃度為0.1-1mM的IPTG，25℃-37℃誘導表達，通入二氧化碳，以碳酸鉀和氫氧化鉀調pH，控制pH在7.0，每隔8h補加一次IPTG。得到的異戊二烯產物通過GC-MS對其進行定性和定量分析。培養過程中對發酵液中殘余葡萄糖進行檢測，并通過變速流加濃度為800g/L的糖液，維持殘糖濃度在0.5g/L以下。每4h取發酵液5ml，測定細胞OD₆₀₀、葡萄糖濃度；每15min取尾氣1ml，利(li)用氣相色譜檢(jian)測產物異戊二烯和二氧化(hua)碳(tan)濃度。直到OD不再變(bian)化(hua)，產物不再產生為止。

結果表明(ming)菌株LWPYC1可合成6g/L異戊二烯及12g/L的(de)琥珀酸，異戊二烯和琥珀酸的(de)總轉(zhuan)化率之和達24％，是對照菌的(de)3倍。

實施例4

挑取菌株LWPYC1單克隆到50ml M9種子培養基中，37℃、180rpm活化過夜(18-24h)。將種子按10％的接種量接種至含有2L發酵培養基的5L小型發酵罐中，通氣量1.3VVM，轉速400rpm，37℃培養至OD₆₀₀約為40時，添加終濃度為0.1-1mM的IPTG，25℃-37℃誘導表達，通入二氧化碳，以碳酸鉀和氫氧化鉀調pH，控制pH在7.0，每隔8h補加一次IPTG。得到的異戊二烯產物通過GC對其進行定性和定量分析。培養過程中對發酵液中殘余葡萄糖進行檢測，并通過變速流加濃度為800g/L的糖液，維持殘糖濃度在0.5g/L以下。每4h取發酵液5ml，測定細胞OD₆₀₀、葡萄糖濃度；每15min取(qu)尾氣(qi)1ml，利用氣(qi)相色譜檢測產(chan)物異戊二烯和二氧化碳濃度。直到OD不再變化，產(chan)物不再產(chan)生為止(zhi)。

結果表明菌(jun)株LWPYC1可合成(cheng)10g/L異戊(wu)二(er)烯及25g/L的琥珀酸，異戊(wu)二(er)烯和琥珀酸的總轉化(hua)率是對(dui)照菌(jun)的2.8倍。

雖然本發(fa)(fa)明(ming)已以較佳(jia)的(de)(de)實(shi)施例公(gong)開(kai)如上，但其并非用以限定本發(fa)(fa)明(ming)，任何熟悉此技(ji)術的(de)(de)人，在不(bu)脫離(li)本發(fa)(fa)明(ming)精神和(he)范(fan)圍內，都(dou)可(ke)以做各種的(de)(de)改動與修飾，因(yin)此，本發(fa)(fa)明(ming)的(de)(de)保護范(fan)圍應該以權利要求(qiu)書所界定的(de)(de)為準(zhun)。