本發明屬于食品加工和生物
技術領域：
，具體涉及一種利用生物技術構建基因工程菌用于鎘超標稻米（簡稱鎘米）降鎘加工生產海藻糖的方法。
背景技術：
：鎘米，一般指鎘含量超標（中國國標為0.2mg/kg）的大米。過去幾十年，由于片面追求GDP的增長和對環保的不重視，中國土壤污染越來越嚴重，大米鎘等重金屬超標也越來越嚴重；2008年南京農大潘根興團隊在全國多個縣級以上市場隨機采購樣品，結果表明10%左右的市售大米鎘超標；2013年廣東鎘米風波中報道湖南、江西等地流向廣東的鎘米最高竟超過國標6倍；由于土地污染治理困難，今后相當長一段時間中國將面臨大量鎘米的加工處理難題；楊居榮等人的研究表明，鎘在稻米中主要與蛋白質結合，與淀粉結合較少；而現在的去鎘方法多集中在物理或化學方法，少見生物方法去鎘，更缺乏將鎘米脫鎘后加工成高附加值產品如海藻糖等產品的研究。海藻糖（Trehalose）是由兩分子葡萄糖以α，α-1，1-糖苷鍵相連而成的非還原性二糖，由于其具有對生物體優良的抗逆保護作用等優良性能而被譽為“生命之糖”和“二十一世紀的新型糖類”，其大規模制造方法受到廣泛關注；海藻糖現在主要以雙酶法或單酶法生產，單酶法以麥芽糖為原料，由于只用一種酶，因而具有簡便的優點，但現有海藻糖合成酶存在反應溫度偏低，易染雜菌，反應時間較長，轉化率偏低的缺陷，而用來生產海藻糖合成酶的基因工程菌常用甘油等為發酵培養基主成分，成本較高，這些缺點均嚴重影響了單酶法的推廣和應用。展示蛋白或酶的酵母菌細胞具有固定化可重復使用的優點，又具有制備簡單，可高密度培養獲得大量菌體，成本較低的特點，因而自上世紀末問世以來，發展迅猛，已有許多種蛋白或酶被成功表達的報道；馮俠等（基于展示技術的Cd2+結合肽篩選與酵母重金屬吸附研究[J].河南農業科學，2013，42（9）：142-145）報道將十二肽展示在釀酒酵母EBY100上，誘導24h后得到能吸附Cd2+的酵母菌，但其對Cd2+的吸附率不高，只有30.4%。技術實現要素：本發明所要解決的技術問題一是構建吸附效果更好的酵母基因工程菌來更有效地脫去鎘米蛋白酶解游離出來的鎘，二是構建能產耐高溫、反應時間較短、轉化率較高的海藻糖合成酶基因工程菌，三是利用脫鎘大米蛋白肽作為海藻糖合成酶基因工程菌的主成分培養基，進一步降低海藻糖合成酶生產成本，從技術上進一步方便生產使用并降低大米生產海藻糖的加工利用成本，提升鎘米的加工附加值，降低鎘米因不能食用只能賤賣所造成的經濟損失。本發明采取的技術方案是：（1）將鎘米浸泡1~3h，磨成50~80目的米漿，加水調成20~40%（W/W）濃度的淀粉乳，調pH到6.1~6.5，按5~10U/g加α-淀粉酶在90~110℃條件下分解20~60分鐘，然后降溫到55~65℃，用板框壓濾機將其分離成鎘蛋白與液化糖漿；（2）將上述（1）所得的鎘蛋白以重量計加入1~3倍的水，加NaOH調pH到7~8，然后按1~3%（W/W）的比例加入蛋白酶攪拌4~8h后，按2~6%（W/W）加入展示金屬親和肽BMP的畢赤酵母基因工程菌（簡稱BMP基因工程菌），攪拌16~24h吸附蛋白酶分解游離出來的鎘，然后用離心機將其分離成吸鎘酵母與脫鎘大米蛋白肽，將脫鎘大米蛋白肽冷凍干燥后用作海藻糖合成酶TreS基因工程菌（簡稱TreS基因工程菌）發酵培養基的主成分；（3）在上述（1）所述液化糖漿中按15~25U/g的量加入β-淀粉酶，糖化2~4h后，得麥芽糖漿；（4）將TreS基因工程菌按4~8%的接種量接入大米蛋白肽為主成分的培養基中，發酵培養至OD約為0.6時加入終濃度為0.5mmol/L的乳糖作為誘導劑，在22~26℃，200r/min誘導16~24h，將發酵液經均質機破碎菌體細胞后即得海藻糖合成酶粗酶液；（5）以重量計將5~10份（4）所述海藻糖合成酶粗酶液加入95~90份（3）所述的麥芽糖漿中，在pH4.5~7，42~52℃溫度下進行催化反應2~8h后過濾分離，將過濾分離后所得的反應液再經壓濾、離交、色譜分離，所得的海藻糖漿經濃縮、干燥、結晶即得到結晶海藻糖，而色譜分離所得麥芽糖漿返回合并到（3）所述的麥芽糖漿中作為海藻糖生產原料。如[0006]所述BMP基因工程菌制備方法如下：通過半理性設計等方法，在前人基因序列基礎上進行改進，設計合成一系列新的基因序列，委托生物公司進行序列合成和多個相關基因工程菌構建；然后通過驗證實驗選擇合成鎘親和性好的SEQNO1序列（見后附序列表SEQNO1），將合成得到的DNA克隆在pUC57載體上，然后進一步亞克隆到pPIC9K載體中，再轉化到畢赤酵母GS115中，得到展示金屬親和肽BMP的畢赤酵母基因工程菌，即BMP基因工程菌，其對鎘的吸附率在70~80%。如[0006]所述TreS基因工程菌的制備方法如下：通過半理性設計等方法，在前人基因序列基礎上進行改進，設計合成一系列新的基因序列，委托生物公司進行序列合成和多個相關基因工程菌構建；然后通過驗證實驗選擇合成具有耐高溫、催化反應時間較短且活性較高特點的海藻糖合成酶DNA序列SEQNO2（見后附序列表SEQNO2），將合成的基因構建到pET28a(+)載體中的NcoI和XhoI酶切位點之間，將構建好的基因轉化到BL21(DE3)plysS大腸桿菌中，得到一種TreS反應溫度在42~52℃、反應時間2~8h的TreS基因工程菌。如[0006]（2）、（4）中所指用作TreS基因工程菌發酵培養基是按每L培養基用（2）中所述冷凍干燥后的脫鎘大米蛋白肽20~30g，與2~3gMgSO4及5~10ml微量元素液混合后，再加水復配成1L制成的；其中微量元素液預先按：FeSO4·7H2O10g/L、ZnSO4·7H2O2.25g/L、CuSO4·5H2O2.25g/L、MnSO4·5H2O0.5g/L、CaSO4·2H2O2g/L用1mol/LHCl溶解配制并儲于棕色試劑瓶中備用。本發明與現有技術相比，脫鎘率較高，達到75%左右；用脫鎘大米蛋白為主成分培養基培養海藻糖合成酶大腸桿菌基因工程菌比原來用甘油等為主成分的培養基成本降低50%以上；用該菌生產的海藻糖合成酶催化麥芽糖生產海藻糖，轉化率達到73.92%左右，反應溫度為42~52℃，難染雜菌，且反應時間較短，只要2~8h，因而海藻糖生產成本大大降低。附圖說明圖1為本發明生產工藝流程圖。具體實施方式以下通過具體實施例對本發明作進一步具體詳細描述，但本發明的實施方式不限于此，對于未特別注明的工藝參數，可參照常規技術進行。實施例1pPIC9K-BMP載體的構建：將BMP金屬親和肽DNA序列SEQNO：1人工合成，序列的5’端添加EcoRI限制性內切酶位點，3’端添加NotI位點。EcoRI-BMP-NotI委托生物公司合成并克隆到pUC57載體的多克隆位點上，命名為pUC57-BMP；分別將pUC57-BMP和pPIC9K載體進行EcoRI和NotI雙酶切反應，37℃水浴4h后用1.2%瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定；采用凝膠回收試劑盒對目的基因片斷BMP和pPIC9K載體片段進行回收；再用T4DNALigase進行連接反應，22℃過夜連接，將其轉化到DH5a感受態細胞中，并涂布在含有amp和kana抗性的LB固體培養基（1%胰蛋白胨+0.5%酵母提取物+0.5%NaCl+1.5%瓊脂）上37℃過夜培養后挑取克隆進行搖菌培養，質粒抽提，并進行EcoRI和NotI雙酶切反應，并用1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定；將陽性克隆命名為pPIC9K-BMP；實施例2pPIC9K-BMP轉化到畢氏酵母GS115中，按照如下步驟進行：（1）煮沸1ml鮭魚精DNA5min，迅速冰浴后以制備單鏈擔體DNA；（2）將pPIC9K-BMP用SacI內切酶進行線性化處理；（3）將感受態酵母菌GS115離心，用Tips去除殘余的LiCl溶液；（4）對于每一個轉化，按以下順序加入：50%PEG3350，240ml；1MLiCl，36ml；2mg/ml單鏈SalmonspermDNA，25ml；5～10mg/50mlH2O質粒DNA，50ml；（5）劇烈旋渦混勻至沉淀菌體完全分布均勻（約1min）；（6）30℃水浴孵育30min；（7）42℃水浴熱休克20～25min；（8）6000～8000rpm離心收集酵母菌體；重懸酵母于1mlYPD培養基（2%Trypton+2%Dextrose)；（9）30℃搖床孵育；(10)1～4h后，取25～100ml菌液鋪YD選擇性培養基（1.67%YNB+2%dextrose+1%瓊脂粉）平板，于30℃培養2～3d鑒定（將表達菌株和對照菌株在固體培養基平板，30℃培養至轉化子出現）。實施例3BMP基因工程菌制備：將畢赤酵母重組菌接種到YPD液體培養基中，30℃，180r/min培養24h進行活化；按1%的接種量轉接至新鮮的BMGY培養基（1%Yeastextract+2%Peptone+1.34%YNB+4×10-5生物素+1%甘油/0.5%甲醇+10%1MPBS)中，30℃，180r/min培養4～5d，每24h添加甲醇進行誘導；收集發酵菌體，菌泥用pH8.0緩沖液洗滌3次；經離心后得濕菌體，制得BMP基因工程菌。實施例4BMP基因工程菌對鎘米脫鎘處理：將鎘米浸泡2h，磨成60目的米漿，加水調成30%（W/W）濃度的淀粉乳，調pH到6.3，按8U/g加α-淀粉酶在100℃條件下分解30~40分鐘，然后降溫到60℃，用板框壓濾機將其分離成鎘蛋白與液化糖漿；將所得鎘蛋白以重量計加入2倍的水，加NaOH調pH到7.5，然后按2%（W/W）的比例加入蛋白酶攪拌6h后，按4%（W/W）加入BMP基因工程菌，振蕩20h吸附蛋白酶分解游離出來的鎘等重金屬，然后用離心機將其分離成吸鎘酵母與脫鎘大米蛋白肽，將脫鎘大米蛋白肽冷凍干燥后用作海藻糖合成酶基因工程菌發酵培養基的主成分。實施例5酵母工程菌脫鎘程度的測定：按國標法用原子吸收分光光度計測定Cd2+離子質量濃度，然后計算吸收率，進而計算對鎘的吸附率，測定結果如下：表1MBP酵母工程菌脫鎘效果鎘蛋白中鎘含量脫鎘多肽中鎘含量BMP基因工程菌脫鎘率0.60±0.11mg/kg0.15±0.03mg/kg75.0±5.0%實施例6TreS基因工程菌的制備：按SEQNO2所示TreSDNA序列，將合成的基因構建到pET28a(+)載體中的NcoI和XhoI酶切位點之間，再將構建好的基因轉化到BL21(DE3)plysS大腸桿菌中，得到一種反應溫度在42~52℃、反應時間2~8h的TreS基因工程菌。實施例7TreS基因工程菌發酵培養基的配制：每L培養基按將上述所得冷凍干燥后的脫鎘大米蛋白肽以重量計按25g加入2.08gMgSO4、10ml微量元素液的比例再加水復配成1L發酵培養基方式配制，供TreS基因工程菌經LB種子發酵和搖瓶發酵后進一步發酵擴培生產用；其中微量元素液按：FeSO4·7H2O10g/L、ZnSO4·7H2O2.25g/L、CuSO4·5H2O2.25g/L、MnSO4·5H2O0.5g/L、CaSO4·2H2O2g/L用1mol/LHCl溶解并儲于棕色試劑瓶中配制備用。實施例8海藻糖合成酶的制備：以[0019]中所述培養基，將TreS基因工程菌按5%的接種量接入，培養至OD約為0.6時加入終濃度為0.5mmol/L的乳糖作為誘導劑，在25℃，200r/min誘導20h，將發酵液經均質機破碎后離心，取上清液即為海藻糖合成酶粗酶液。實施例9海藻糖漿的制備：在[0016]所述液化糖漿中按20U/g的量加入β-淀粉酶，糖化3h后，得麥芽糖漿；以重量計將10份[0020]中所述的海藻糖合成酶粗酶液加到90份該麥芽糖漿中，在pH4.5~7，42~52℃溫度下進行催化反應6h后，用HPLC對反應產物進行各種糖含量分析，結果為海藻糖21.51±2.33%，麥芽糖5.58±1.37%，葡萄糖含量1.83±0.36%，由底物濃度29.10%，計算轉化率為21.51/29.1=73.92%；將催化反應所得糖漿再經壓濾、離交、色譜分離，即得海藻糖漿和麥芽糖漿，如圖1所示，海藻糖漿可根據市場需要調配成海藻糖濃度為20~70%的糖漿出售或進一步制成結晶海藻糖，而麥芽糖漿可重新用作海藻糖生產原料。實施例10結晶海藻糖的生產：[0021]所述生產所得海藻糖漿如圖1所示經濃縮、結晶、離心、干燥后得到純度在98%以上的結晶海藻糖。當前第1頁1 2 3