重組靶向Wnt融合蛋白及其在制備抗癌藥中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種融合蛋白，具體涉及一種重組靶向的Wnt信號通路融合蛋白及其 在制備抗癌藥物中的應用，屬于生物醫藥技術領域。
【背景技術】
[0002] 1.Wnt信號通路的概述
[0003] 癌癥是全世界主要的死亡病因，2030年預計全球約1200萬人死于癌癥，目前仍缺 乏有效治療藥物。Wnt信號通路在胚胎發育、干細胞、免疫系統以及腫瘤發生等生理病理過 程中發揮重要作用，該通路的持續激活與結腸癌、肝癌、肺癌、前列腺癌、腎癌、黑色素瘤等 多種人類腫瘤的發生發展密切相關。Wnt信號通路是一種在進化中高度保守的信號通路， Wnt家族蛋白通過自分泌或旁分泌作用與位于細胞膜上的受體相結合，激活細胞內信號轉 導，進而調節Wnt靶基因的表達，而絕大多數Wnt靶基因都與生長和代謝密切相關。目前， Wnt信號通路主要可分為經典的Wnt信號通路和非經典Wnt信號通路，其中經典Wnt信號 通路即Wnt/beta-catenin通路，是Wnt信號中研究最清楚的一條通路，在整個進化過程中 高度保守。研究表明，Wnt信號通路的異常與人類多種疾病的發生相關。Wnt信號過度激 活導致下游目標原癌基因的大量表達，促使細胞發生惡性轉化，對腫瘤的發生發展起著促 進作用。在人非小細胞肺癌、慢性淋巴細胞性白血病、胃癌、結直腸癌、卵巢癌、乳腺癌、肝癌 等多種癌癥中均發現有Wnt蛋白的過度表達及各種Wnt配體調節分子（如sFRP，WIF1)的 下調。在結直腸癌和肝癌中還分別發現APC和beta-catenin的組成型激活突變，從而導致 Wnt信號在該類癌癥中持續活化。因此，抑制或者阻斷Wnt信號通路的蛋白拮抗劑或化學小 分子可為惡性腫瘤的防治提供新的分子靶向策略。
[0004] 2.分泌型的Wnt蛋白拮抗劑的概述
[0005] 在Wnt信號通路的上游，除了Wnt配體和受體能夠調節Wnt信號以外，另外還有三 類分泌型的天然Wnt拮抗劑可以調控Wnt信號通路，S卩：分泌型卷曲相關蛋白（sFRP)家族， Dickkopf (Dkk)蛋白家族以及Wnt抑制因子1 (WIF-1)。
[0006] sFRP家族蛋白具有一段與Frizzeled受體相似的保守半胱氨酸富集區域，即CRD 結構域，該結構域可通過與胞外Wnt配體相互結合從而削弱或阻斷受體信號的傳導。專 利CN101600449A公開了將卷曲蛋白、分泌型卷曲相關蛋白或Ror蛋白的CRD結構域與 Fc免疫球蛋白構建嵌合的融合蛋白，可用于Wnt介導病癥的治療和診斷性檢測。與sFRP 家族蛋白不同的是，WIF-1不含有與Wnt相連接的CRD區域，而是通過其特有的WD區域 (WIF-ldomain)與Wnt相結合，實現其阻斷Wnt信號的功能。國外專利WO2005112988A2公 開了WIF-1的WD區域能夠用于治療WIF-1低表達的多種腫瘤。此外，至于Dickkopf(Dkk) 蛋白家族則主要通過與細胞膜上Wnt輔助受體LRP5/6相結合，從而導致受體發生內吞作用 降解。雖然目前已有研究人員運用現有技術將CRD或WD進行克隆或重組獲得重組蛋白，并 提示可運用于腫瘤的治療，但是至今并沒有相關臨床研究使用的報道，表明單獨的CRD或 WD重組蛋白進入臨床試驗階段還存在很大的問題。同時，基于Wnt配體蛋白家族的多樣 性，目前已發現19種Wnt蛋白參與活化Wnt信號通路，而CRD和WD具體分別與哪些Wnt配 體或受體蛋白相結合尚不清楚，完全可能選擇性地繼續活化Wnt信號。因此，上述單一某個 結構功能域的策略具有明顯的技術缺陷，急需廣譜型的Wnt信號大分子蛋白質抑制劑。

【發明內容】

[0007] 針對現有技術存在問題，本發明的目的在于提供一種重組靶向Wnt信號通路的融 合蛋白，及其在制備抗腫瘤藥物中的應用。構建基于sFRP家族蛋白的CRD結構域和WIF-1 的WD結構域，所構建的融合蛋白具有抑制Wnt信號并顯著抑制裸鼠皮下移植瘤的生長，可 應用于抗腫瘤藥物的制備或作為基因治療的藥物。
[0008] 本發明通過以下技術方案實現上述目的：
[0009] 一種重組靶向Wnt拮抗劑CRD-WD融合基因，將sFRP家族蛋白的CRD區域與WIF-1 的WD區域通過柔性氨基酸接頭連接，柔性氨基酸序列為：GSGSGS。
[0010] 上述重組靶向Wnt拮抗劑CRD-WD融合基因，其編碼的蛋白質為重組靶向Wnt信號 通路融合蛋白CRD-WD，氨基酸序列如SEQIDNO. 1所示。
[0011] 所述重組靶向Wnt信號通路融合蛋白CRD-WD可通過XbaI、PmeI酶切位點克隆 至慢病毒表達載體pLVX-puro〇
[0012] 所述的重組靶向Wnt信號通路融合蛋白CRD-WD可應用于制備對Wnt信號異常的 病癥的藥物中，所述對Wnt信號異常的病癥包括癌癥。
[0013] 本發明所述的Wnt信號通路融合蛋白CRD-WD可直接作為藥物使用，其余輔料為藥 物學上可接受的、對人和動物無毒和惰性的藥用載體。
[0014] 與現有技術相比，本發明具有以下有益的技術效果：
[0015] (1)本發明基于Wnt信號通路中復雜的蛋白質相互作用規律，將Wnt拮抗劑sFRP 家族蛋白和WIF-1與Wnt配體蛋白結合的結構域通過融合PCR方法將兩者融合，從而構建 了重組靶向Wnt信號通路的融合蛋白CRD-WD，該融合蛋白能顯著抑制肝癌!fepG2細胞Wnt 信號的活性，其抑制率為84% (P〈0. 01)。
[0016] (2)本發明基于重組靶向Wnt信號通路的融合蛋白CRD-WD，構建了該融合蛋白 的慢病毒載體pLVX-puro-CRD-WD，并應用于腫瘤基因治療的研究：該重組慢病毒感染肝癌 HepG2細胞并經嘌呤霉素篩選獲得穩定表達該融合蛋白的細胞株，通過裸鼠皮下異種移植 模型，該融合蛋白能顯著抑制裸鼠皮下移植瘤的生長，其抑制率為80% (P〈0. 01)。
【附圖說明】
[0017] 圖1為構建的CRD-WD融合基因的電泳檢測結果圖。
[0018] 圖2為該融合基因表達載體的酶切鑒定結果圖。
[0019] 圖3為CRD-WD穩定細胞株鑒定的結果圖。
[0020] 圖4為通過熒光素酶報告基因檢測系統檢測融合蛋白CRD-WD對宿主腫瘤細胞Wnt 活性抑制的結果圖。
[0021] 圖5為該融合蛋白在裸鼠皮下異種移植模型中的腫瘤增殖抑制結果圖。
【具體實施方式】
[0022] 本發明利用人源sFRP(secretedfrizzled-relatedprotein)家族蛋白的CRD結 構域和WIF-1(Wntinhibitoryfactor1)的WD結構域均能結合Wnt配體特性，構建重組 靶向Wnt拮抗劑CRD-WD融合基因。所構建的融合基因CRD-WD是分別克隆sFRP家族蛋白 的CRD結構域和WIF-1的WD結構域，然后通過六個柔性氨基酸接頭進行連接，采用融合PCR 技術進行重組。下面結合該融合基因CRD-WD、表達載體的構建及重組慢病毒的制備，以及該 融合蛋白抑制Wnt信號的活化和抑癌活性等功能性研究，對本發明做進一步地詳細說明。
[0023] 1、CRD-WD融合基因
[0024] 1. 1CRD和WD結構域的克隆
[0025] 相關分子生物學實驗技術按常規方法進行。根據Genbank中的sFRP3的CRD基因 序列和WIF-1的WD基因序列分別設計擴增引物P1、P2和P3、P4,擴增引物對P2、P3用于融 合基因的重組擴增，具體的引物序列分別為：
[0034] 首先，擴增CRD的下游引物序列P2中引入WD基因片段的5'端的幾個反向互補核 苷酸，同時加入六個柔性氨基酸接頭，P2和P3為反向互補配對序列。同時，在擴增CRD的 上游引物中引物酶切位點XbaI，擴增WD的下游引物序列中引入酶切位點PmeI。其次， 以現有的pLVX-pur〇-sFRP3質粒和pLVX-puro-WIF-Ι質粒為模板，分別以引物對P1和P2、 P3和P4為擴增引物對，PCR擴增CRD和WD結構域，PCR擴增程序為：94°C5min，94°C30s， 55°C45s，72°C30s，35個循環。最后，收集PCR擴增產物，經膠回收純化后分別獲得CRD結 構域和WD結構域。
[0035] 1. 2CRD-WD融合基因的構建
[0036] 通過融合PCR技術，將擴增的CRD結構域基因與擴增的WD結構域基因進行基因融 合，具體如下：
[0037] 以擴增的CRD結構域基因與WD結構域基因等量混合物（1:1混合）為模板，以P2 和P3引物對作為擴增引物，進行融合PCR，使CRD和WD相融合，PCR擴增程序為：94°C5min， 94°C30s，55°C45s，72°Clmin，35個循環。收集融合PCR擴增的產物，純化后獲得CRD-WD 融合基因。
[0038] 對CRD、WD結構域基因以及CRD