褐黃孢鏈霉菌重組表達質粒及工程菌與應用
【專利摘要】本發明涉及褐黃孢鏈霉菌重組表達質粒及工程菌與應用，通過克隆褐黃孢鏈霉菌納他霉素生物合成基因簇中的具有正調控作用的兩個基因(pimM和pimE)及外源血紅蛋白基因vgb，成功構建了表達載體pIMEP::pimE：:pimM：:vgb；通過帶有表達載體pIMEP::pimE：:pimM：:vgb的大腸桿菌ETZ與褐黃孢鏈霉菌的結合轉移實驗獲得了褐黃孢鏈霉菌工程菌株；褐黃孢鏈霉菌工程菌株因納他霉素生物合成基因簇中的調控基因pimM和膽固醇氧化酶基因pimE過表達的疊加效應，及血紅蛋白基因vgb的耐貧氧性能，可提高納他霉素生物合成基因簇的轉錄，從而顯著提高納他霉素的產量。CGMCC No.04
【專利說明】
褐黃孢鏈霉菌重組表達質粒及工程菌與應用
技術領域
[0001] 本發明涉及基因工程技術領域，尤其是褐黃孢鏈霉菌重組表達質粒及工程菌與應 用。
【背景技術】
[0002] 納他霉素是一種多烯大環內酯類廣譜抗真菌劑。它能有效地抑制和殺死霉菌、酵 母菌、絲狀真菌，因此可以有效地降低強致病性真菌素對人類的侵害。與其他抗菌成分相比 納他霉素對哺乳動物細胞的毒性極低，可以廣泛應用于真菌引起的疾病。由于納他霉素無 毒、不致畸、對人體無害無殘留等特性，1982年，美國FDA正式批準納他霉素的食品防腐劑用 途。我國衛生部于1997年也正式批準納他霉素的食品防腐劑資質。如今，納他霉素已經廣泛 被應用于食品行業，此外，納他霉素也被廣泛用于醫療、飼料、糧儲等領域中。
[0003] 目前，在鏈霉菌屬（Streptomyces)、短桿菌屬（Brevibacterium)、假單胞菌屬 (Pseudomonas)、紅球菌屬(Schizopylium)等細菌中均發現有膽固醇氧化酶。在納他霉素生 物合成基因簇中，pimE編碼膽固醇氧化酶。目前已從鏈霉菌屬中分離出膽固醇氧化酶基因， 其編碼的膽固醇氧化酶屬于乙酰膽固醇氧化酶家族的成員，可催化膽固醇形成17-酮類固 醇和過氧化氫。2007年Marta等人通過基因敲除與互補實驗發現，在納塔爾鏈霉菌中，pimE 編碼一種功能性膽固醇氧化酶，并且該酶對納他霉素的生物合成有關。納他霉素的生物合 成過程并不需要膽固醇的參與，但是通過向敲除PimE的工程菌株中，添加純化后的PimE蛋 白或異源的固醇氧化酶時，均可顯著提高納他霉素的產量。故Marta等人推測膽固醇氧化酶 是納他霉素生物合成中的一種分泌到胞外的信號蛋白，對納他霉素的生物合成起著正調控 作用。浙江大學孫志豪論文中指出，膽固醇氧化酶基因在恰塔努加鏈霉菌中也有著相似的 作用，并推測膽固醇氧化酶基因與兩個調控基因 pimR和pimM對納他霉素生物合成可能存在 協同調控作用。
[0004] 納他霉素生物合成基因簇的調控基因為pimR和pimM，分別編碼兩個轉錄因子。在 納塔爾鏈霉菌（Streptomyces natalensis)中，PimM基因是納他霉素生物合成基因簇中正 轉錄調控因子。PimM作為PAS調控蛋白，能夠激活基因簇中部分基因的轉錄。在納塔爾鏈霉 菌中，pimM敲除菌株喪失了納他霉素的合成能力，增加 pimM基因的拷貝能夠提高納他霉素 產量。浙江大學孫志豪論文指出，在恰塔努加鏈霉菌（Streptomyces chattanoogensis)中， 與納他霉素生物合成基因簇的調控基因 PimM功能類似的調控基因 ScnRII同樣為正調控基 因，且該基因很可能同樣結合在納他霉素生物合成基因簇中的八個基因的啟動子區域。在 工業生產上，通過直接增加途徑特異性調控基因的拷貝數來提高抗生素產量的方法在構建 高產鏈霉菌株廣泛應用。
[0005] 褐黃孢鏈霉菌為好氧菌，隨著發酵時間延長，菌體密度迅速增加。發酵過程中，溶 氧不足可使菌體生長緩慢，納他霉素合成關鍵酶表達量降低，進而使納他霉素產量降低。研 究發現，VHb在貧氧條件下的表達，能顯著促進大腸桿菌及釀酒酵母細胞的生長，提高蛋白 質合成能力，增加目的產物的產量。此外，vgb基因也被應用到芽孢桿菌、歐文氏菌、產黃頭 孢霉等微生物中，成功提高了淀粉酶、維生素 C，頭孢菌素 C等生化產品的產量。也有報道將 該基因導入植物中表達亦獲得成功。故本發明將該基因同樣導入到褐黃孢鏈霉菌中，通過 該基因的表達使得工程菌株獲得耐貧氧能力，進而提高納他霉素的產量。
[0006] 此外，據何艷玲報道"間歇補料分批發酵提高納他霉素產量"，通過使初始葡萄糖 濃度40g/L，間歇補糖使葡萄糖濃度維持在2%，可使納他霉素產量從1.5g/L提高到2.3g/L。 浙江大學梁景樂報道"納他霉素高產菌株空間育種、工藝優化及工業放大研究"，通過比較 不同的控制條件，30L發酵規模上的最優控制條件為:發酵過程的中pH值為5.8-6.2，全程攪 拌轉速為400rpm，通氣量為1. Ovvm，溫度為28°C。褐黃孢鏈霉菌為好氧菌，故在其發酵過程 中可以通過提供轉速提高溶氧滿足菌體對溶氧的要求。在發酵過程中，如何控制發酵條件 同樣對提高納他霉素的產量有著重要意義。

【發明內容】

[0007] 本發明所要解決的技術問題在于提供一種褐黃孢鏈霉菌重組表達質粒。
[0008] 本發明所要解決的另一技術問題在于提供含有上述褐黃孢鏈霉菌重組表達質粒 的工程菌。
[0009] 本發明所要解決的另一技術問題在于提供上述工程菌的應用。
[001 0]為解決上述技術問題，本發明的技術方案是：
[0011] 一種褐黃孢鏈霉菌重組表達質粒，是由調控基因 pimM、膽固醇氧化酶基因 pimE和 外源血紅蛋白基因 vgb分別插入含有紅霉素啟動子的載體ρΜΕΡ中得到的的重組表達載體 pIMEP: :pimE: :pimM: :vgb，重組表達載體pIMEP: :pimE: :vgb的序列為序列表〈400> 17所示序列;所述重組表達質粒為三個基因的串聯表達，每個基因前均有紅霉素啟動子，所 述pimM的核苷酸序列為序列表〈400>1所示序列，pimE的核苷酸序列為序列表〈400>2所示序 列，vgb的核苷酸序列為序列表〈400>3所示序列，pimE/pimM/vgb及啟動子的序列為序列表〈 400>16所示序列；其中，所述調控基因 pimM和出發載體ρΙΜΕΡ用BamH I/EcoR I進行酶切， pimE和出發載體ρΠΙΕΡ用BamH I進行酶切，vgb和出發載體ρΠΙΕΡ用Κρη I進行酶切;含有紅 霉素啟動子和調控基因（Perm: :pimM)的片段和出發載體pHffiP: :pimE用EcoR I進行酶切， 含有紅霉素啟動子和血紅蛋白基因（Perm: :vgb)的片段和出發載體pIMEP: :pimE: :pimM用 Mun I/Spe I進行酶切。
[0012] 優選的，上述褐黃孢鏈霉菌重組表達質粒，所述調控基因 pimM、膽固醇氧化酶基因 pimE和外源血紅蛋白基因 vgb的啟動子均為紅霉素啟動子ermE*(Perm)。
[0013] 一種含有上述褐黃孢鏈霉菌重組表達質粒的工程菌（Streptomyces gilvosporeus/pIMEP: :pimE: :pimM: : vgb)，保藏號為CGMCC No. 11790。
[0014] 上述工程菌的基因組中整合有重組表達載體pMEP: :pimE: :vgb，具有高產 納他霉素的能力，發酵120h的產量達到10.136克。
[0015] 上述工程菌的構建方法，具體步驟如下：
[0016] 將上述褐黃孢鏈霉菌重組表達質粒先化轉入大腸桿菌ETZ中，利用褐黃孢鏈霉菌-大腸桿菌結合轉移實驗，將褐黃孢鏈霉菌孢子懸浮液和含有重組表達載體pMEP: :pimE:: pimM: :vgb的重組大腸桿菌ETZ菌液混合涂布到MS(含5mM MgCl2)平板，于28°C培養箱培養 16-20h，之后涂布lml無菌水(含萘啶酮酸0.4mg和阿普霉素1.5mg)進行篩選;于28°C繼續培 養即可獲得含有重組表達載體pMEP: :pimE: :vgb的褐黃孢鏈霉菌工程菌株。
[0017] 上述褐黃孢鏈霉菌重組表達質粒為含有納他霉素生物合成基因簇的調控基因 pimM和膽固醇氧化酶基因 pimE及外源基因 vgb的重組表達載體pIMEP: :pimE: :vgb。
[0018] 優選的，上述工程菌的構建方法，利用褐黃孢鏈霉菌工程菌株含有阿普霉素抗性， 在含有阿普霉素抗性的SS平板上篩選轉化子，平板中阿普霉素終濃度為15μg/ml;將平板驗 證正確的轉化子提取基因組，用PCR方法驗證重組表達載體pIMEP: :pimE: :vgb是否 成功插入到褐黃孢鏈霉菌基因組中。
[0019] 上述工程菌高產納他霉素的應用。
[0020] 優選的，上述工程菌的應用，所述工程菌的發酵條件為：制備新鮮孢子懸液，按 2 % -5 %的接種量接種于種子培養基，28 °C、200rpm培養2d，種子培養基按5 %的接種量轉接 到到發酵培養基中28 °C、200rpm發酵培養。
[0021]優選的，上述工程菌的應用，所述種子培養基按g/L計為：葡萄糖20,蛋白胨6， yeast extract 6，NaCl 10，ρΗ=7·0，12?·?滅菌20min〇
[0022] 優選的，上述工程菌的應用，所述發酵培養基按g/L計為：葡萄糖40,大豆蛋白胨 15，yeast extract 5，beef extract powder 5，pH=7.5,121°C滅菌20min，其中葡萄糖配 制濃度為50 %，115 °C滅菌30min，發酵培養條件:發酵培養基中28 °C、200rpm發酵培養。
[0023] 優選的，上述工程菌的應用，包括補充碳源，調控通氣量和攪拌轉速，發酵過程中 30h-108h以2.5g/L-3g/L的流速流加50 %葡萄糖溶液;控制發酵液pH為6;初始通氣量為4L/ min，7h升至6L/min;在相應的不同時間點調節轉速，至58h調至650rpm后不再變化。
[0024]本發明的有益效果是：
[0025]本發明利用基因工程技術克隆了來自于褐黃孢鏈霉菌本身的調控基因 pimE和 pimM及外源血紅蛋白Vgb基因，并使其成功表達，獲得了納他霉素產量較褐黃孢鏈霉菌出發 菌株高的褐黃孢鏈霉菌工程菌株S.gilvosporeus/pIMEP: :pimE: :vgb。該褐黃孢鏈 霉菌工程菌株應用于納他霉素生產中，在消耗相同底物情況下褐黃孢鏈霉菌工程菌株能生 產更多的納他霉素，降低生產成本，進而提高企業生產效益。
【附圖說明】
[0026] 圖1為本發明重組表達載體pBffiP: :pimE: :vgb的構建質粒圖譜。
[0027] 圖2為本發明將重組表達載體pIMEP: :pimE: :vgb轉入褐黃孢鏈霉菌 (Streptomyces gilvosporeus)的得到的轉化子。
[0028] 圖3為本發明重組表達載體pIMEP: :pimE: : vgb轉化褐黃孢鏈霉菌 (Streptomyces gilvosporeus)后獲得重組菌株的PCR驗證電泳圖：隨機挑取的3個轉化子 全部能擴增出大小為3230bp的特異條帶，結果表明均為陽性轉化子，其中，其中，1指陰性對 照，未加模板;2為陽性對照，其模板為構建的重組表達載體;3為野生株對照，其模板為褐黃 孢鏈霉菌基因組;4，5，6為陽性轉化子，其模板為相應轉化子的基因組。
[0029]圖4為褐黃孢鏈霉菌工程菌株與野生型菌株經搖瓶發酵后，其納他霉素產量與菌 體干重的比值隨時間變化圖：從圖中可以看出，褐黃孢鏈霉菌工程菌株合成納他霉素的能 力強于野生型菌株，其中，（□)指代褐黃孢鏈霉菌(S.gilvosporeus S139);(A)指代褐黃 抱鏈霉菌工程菌株（S.gilvosporeus/pIMEP: :pimE: :vgb)〇
[0030] 圖5為褐黃孢鏈霉菌工程菌株與野生型菌株搖床發酵后，取第4天的發酵液做的抑 菌圈實驗。其中，左邊為褐黃孢鏈霉菌（S. gi 1 vosporeus S139)，右邊為褐黃孢鏈霉菌工程 菌株(S.gilvosporeus/pIMEP: :pimE: :vgb)。指示菌株為酵母菌。其結果與圖4結果 一致。
[0031] 保藏信息
[0032] 分類名詞：褐黃抱鏈霉菌Streptomyces gilvosporeus
[0033] 保藏單位名稱：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心
[0034] 保藏單位地址:北京市朝陽區北辰西路1號院3號 [0035] 保藏日期：2015年12月04日
[0036] 保藏號：CGMCC No .11790
[0037] 參據的生物材料(株）：S280
【具體實施方式】
[0038] 為了使本領域的技術人員更好的理解本發明的技術方案，下面結合【具體實施方式】 對本發明所述技術方案作進一步的詳細說明。
[0039] -、如圖1所不，構建含有調控基因 pimM、膽固醇氧化酶基因 pimE和血紅蛋白基因 vgb的表達載體pIMEP: :pimE: : vgb，引物序列為序列表〈400>4-〈400>15所示序列；
[0040] 二、構建含有表達載體pMEP: :pimE: :vgb的褐黃孢鏈霉菌工程菌株:該菌 株已被中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏日：2015年12月04日保 藏號為:CGMCC No. 11790;
[0041 ]三、褐黃孢鏈霉菌工程菌株的發酵控制及納他霉素含量的測定；
[0042] 本發明以褐黃孢鏈霉菌（Streptomyces gilvosporeus)菌株基因組為模板，將納 他霉素生物合成基因簇中編碼調控基因 pimM、編碼膽固醇氧化酶基因 pimE、及外源透明顫 菌血紅蛋白基因 vgb克隆到出發載體ρΙΜΕΡ上，使調控基因 pimM、膽固醇氧化酶基因 pimE、血 紅蛋白基因 vgb位于該載體紅霉素啟動子Perm之后。經菌落PCR驗證和酶切驗證后，成功構 建表達載體pIMEP: :pimM/pIMEP: :pimE/pIMEP: :vgb。之后以表達載體pIMEP: :pimE為出發 載體，以表達載體ρΜΕΡ: :pimM為模板擴增基因 Perm: :pimM，用EcoRI單酶切構建重組表達 載體p頂EP: :pimE: :pimM。然后以表達載體p頂EP: :pimE: :pimM為出發載體，以表達載體 pIMEP: :vgb為模板擴增基因 Perm: :vgb，用Mun I/Spe I單酶切構建重組表達載體ρΙΜΕΡ:: pimE: :vgb。將該載體化轉入大腸桿菌ETZ感受態細胞中。利用含有重組表達載體 pIMEP: :pimE: :vgb的大腸桿菌ETZ和褐黃孢鏈霉菌結合轉移實驗即可獲得褐黃孢鏈 霉菌工程菌株3.8；[1￥08口0^118/^11^?:4；[11￡::口；[11^[::￥813。將獲得的褐黃孢鏈霉菌工程菌 株進行搖床發酵試驗，并取發酵液與甲醇以1:9比例混合，超聲波超聲20min后稀釋適當倍 數，用HPLC法測定褐黃孢鏈霉菌工程菌株納他霉素的產量。
[0043] 實施例1
[0044] 表達載體pIMEP: :pimE: :vgb的構建
[0045] (1)表達載體pBffiP: :pimE的構建
[0046] 以褐黃孢鏈霉菌(Streptomyces gilvosporeus)基因組為模板，利用表1的引物擴 增納他霉素生物合成基因簇中膽固醇氧化酶基因 pimE，其下游引物pimE-R帶有his標簽。
[0047] 利用表1 的引物PCR擴增體系為：2XPCR Buffer(含Mg2+) 10μ1，dNTP(2.5πιΜ)2μ1，上 游引物pimE-F和下游引物pimE-R(lOyM)各ΙμL，模板(褐黃孢鏈霉菌基因組DNA)lyl，K0D Fx DNA(購自Τ0Υ0Β0公司，貨號KFX-101)聚合酶0.5μ1，加無菌水至終體積為20μ1。
[0048] PCR反應條件為：94°C預變性2min，98°C變性15s，58°C退火30s，68°C延伸100s，反 應35個循環，68°C后延伸lOmin。
[0049] 表1所用引物序列
[0050]
[0051] 將已獲得的DNA片段pimE用BamH I進行酶切，回收后與同樣內切酶處理過的質粒 片段ρΜΕΡ進行連接。將連接產物轉化大腸桿菌JM109感受態細胞，并均勻涂布于帶有阿普 霉素抗性（50μg/ml)的LB平板上，37 °C培養過夜，挑取單克隆，進行菌落PCR驗證和酶切驗 證，即可獲得表達載體p IMEP: : p imE。
[0052] (2)表達載體pBffiP: :pimM的構建
[0053] 同樣以褐黃孢鏈霉菌（Streptomyces gilvosporeus)基因組為模板，利用表2的引 物擴增納他霉素生物合成基因簇中調控基因 pimM，其下游引物pimM-R帶有his標簽
[0054] PCR擴增體系為：2 XPCR Buffer(含Mg2+) 10μ1，dNTP(2 · 5πιΜ)2μ1，上游引物pimM-F 和下游引物PimM-R(1 ΟμΜ)各1 μ 1，模板（褐黃孢鏈霉菌基因組DNA) 1μ 1，K0D Fx DNA(購自 Τ0Υ0Β0公司，貨號KFX-101)聚合酶0.5μ1，加無菌水至終體積為20μ1。
[0055] PCR反應條件為:94°C預變性2min，98°C變性15s，58°C退火30s，68°C延伸37s，反應 35個循環，68°C后延伸10min。
[0056] 表2所用引物序列
[0057]
[0058] 同樣將已獲得的DNA片段pimM用BamH I/EcoR I進行酶切，回收后與同樣內切酶處 理過的質粒片段ρΜΕΡ進行連接。將連接產物轉化大腸桿菌JM109感受態細胞，并均勻涂布 于帶有阿普霉素抗性(50μg/ml)的LB平板上，37 °C培養過夜，挑取單克隆，進行菌落PCR驗證 和酶切驗證，獲得表達載體pMEP: :pimM。
[0059] (3)表達載體pIMEP: :pimE: :pimM的構建
[0060]以構建成功的表達載體pMEP: :pimM為模板，同時以構建成功的表達載體ρΠΙΕΡ:: pimE為出發載體。用表3的引物擴增Perm: :pimM基因。
[0061 ] PCR擴增體系為：2 XPCR Buffer(含Mg2+) 10μ1，dNTP(2 · 5πιΜ)2μ1，上游引物Perm-F 和下游引物PimM-R(1 ΟμΜ)各1 μ 1，模板（褐黃孢鏈霉菌基因組DNA) 1μ 1，KOD Fx DNA(購自 Τ0Υ0Β0公司，貨號KFX-101)聚合酶0.5μ1，加無菌水至終體積為20μ1。
[0062] PCR反應條件為:94°C預變性2min，98°C變性15s，58°C退火30s，68°C延伸52s，反應 35個循環，68°C后延伸10min。
[0063] 表3所用引物序列
[0064]
[0066] 將已獲得的DNA片段Perm: :pimM用EcoR I進行酶切，回收后與同樣內切酶處理過 的質粒片段pMEP: :pimE進行連接。將連接產物轉化大腸桿菌JM109感受態細胞，并均勻涂 布于帶有阿普霉素抗性(50μg/ml)的LB平板上，37 °C培養過夜，挑取單克隆，進行菌落PCR驗 證和酶切驗證，獲得表達載體pIMEP: :pimE: :pimM。
[0067] (4)表達載體pBffiP: :vgb的構建
[0068] 以質粒載體puc57 : : vgb(pLH217)為模板，利用表4的引物擴增vgb基因，該基因攜 帶有his標簽。
[0069] PCR擴增體系為：2 XPCR Buffer(含Mg2+) 10μ1，dNTP(2 · 5πιΜ)2μ1，上游引物vgb-F和 下游引物vgb-R(1 ΟμΜ)各1 μ 1，模板(褐黃孢鏈霉菌基因組DNA) 1 μ 1，KOD Fx DNA (購自Τ0Υ0Β0 公司，貨號KFX-101)聚合酶0.5μ1，加無菌水至終體積為20μ1。
[0070] PCR反應條件為：94°C預變性2min，98°C變性15s，58°C退火30s，68°C延伸29s，反應 35個循環，68°C后延伸10min。
[0071] 表4所用引物序列
[0072]
[0073]將已獲得的DNA片段vgb用Κρη I進行酶切，回收后與同樣內切酶處理過的質粒片 段ρΜΕΡ進行連接。將連接產物轉化大腸桿菌JM109感受態細胞，并均勻涂布于帶有阿普霉 素抗性(50μg/ml)的LB平板上，37 °C培養過夜，挑取單克隆，進行菌落PCR驗證和酶切驗證， 即可獲得表達載體P MEP: : vgb。
[0074] (5)表達載體pIMEP: :pimE: :vgb的構建
[0075] 以構建成功的表達載體pMEP: :vgb為模板，同時以構建成功的表達載體ρΜΕΡ:: pimE: :pimM為出發載體。用表5的引物擴增Perm: :vgb基因。
[0076] PCR擴增體系為：2 XPCR Buffer(含Mg2+) 10μ1，dNTP(2 · 5πιΜ)2μ1，上游引物Perm-F 和下游引物vgb-R(lOyM)各ΙμL，模板（褐黃孢鏈霉菌基因組DNA)lyl，K0D Fx DNA(購自 Τ0Υ0Β0公司，貨號KFX-101)聚合酶0.5μ1，加無菌水至終體積為20μ1。
[0077] PCR反應條件為:94°C預變性2min，98°C變性15s，58°C退火30s，68°C延伸43s，反應 35個循環，68°C后延伸lOmin。
[0078] 表5所用引物序列
[0079]
[0080] 將已獲得的DNA片段Perm: :vgb用Mun I/Spe I進行酶切，回收后與同樣內切酶處 理過的質粒片段pMEP: :pimE: :pimM進行連接。將連接產物轉化大腸桿菌JM109感受態細 胞，并均勻涂布于帶有阿普霉素抗性(50μg/ml)的LB平板上，37 °C培養過夜，挑取單克隆，進 行菌落PCR驗證和酶切驗證，獲得表達載體pIMEP: :pimE: :vgb。
[0081] LB培養基：
[0082] 胰蛋白胨：10.0 g，酵母浸出物：5. Og，NaCl: 10.0 g，去離子水溶解后，定容至1.0L， pH調至7.0-7.2，固體培養基加1.5%的瓊脂粉。121°C滅菌20min。
[0083] 實施例2
[0084] 含有表達載體pBffiP: :pimE: :vgb的褐黃孢鏈霉菌工程菌株的構建
[0085] 1.大腸桿菌-褐黃孢鏈霉菌的結合轉移
[0086] (1)將驗證正確的重組質粒pIMEP: :pimE: :vgb轉化大腸桿菌ETZ感受態細 胞中，于37°C搖床中培養45min后，取100μ1發酵液均勻涂布于含有卡那霉素（終濃度為50μ g/ml)，四環素(終濃度為15μg/ml)，氯霉素(終濃度為25μg/ml)和阿普霉素(終濃度為50yg/ ml)抗性的LB平板上，待長出菌落后，挑取單克隆接于含有同樣四種抗生素的液體LB培養基 中，進行菌落PCR驗證和酶切驗證。
[0087] (2)將驗證正確的單克隆接于含有相同四種抗生素的液體LB培養基中，培養至 0D6QQ值在0.4和0.6之間。用1.5ml EP管收集菌體，用液體LB培養基洗滌菌體2-3次后，用 0.5ml LB液體培養基在1.5ml EP中懸浮菌體備用。
[0088] (3)用滅菌的棉簽收集新鮮的褐黃孢鏈霉菌孢子于1.5ml EP管中，用0.5ml 2XYT 液體培養基中，50 °C水浴1 Omin，取出冷卻至室溫。
[0089] (4)混合處理好的大腸桿菌細胞和褐黃孢鏈霉菌孢子懸浮液，涂布MS(含5mM MgCl2)平板，于28°C培養箱培養16-20h，之后涂布lml無菌水(含萘啶酮酸0.4mg和阿普霉素 1.5mg)。于28°C繼續培養至長有菌落。
[0090] (5)每個平板約長出50-200個轉化子(圖2)。轉化子轉接到帶有阿普霉素抗性的SS 平板上。
[0091] 2.轉化子的驗證
[0092] 將得到的褐黃孢鏈霉菌工程菌株的轉化子取新鮮孢子接種到種子培養基中，培養 兩天后離心菌液提取基因組。以轉化子的基因組為模板，野生型菌株的基因組為對照，表達 質粒pIMEP: :pimE: :vgb為陽性對照進行PCR驗證。
[0093] PCR反應體系為：10XPCR Buffer 2yl，dNTP(10mM)0.4yl，上游引物pimE-F和下游 引物pimM_R( ΙΟμΜ)見表6各0 · 4μ1，模板ΙμL，Taq DNA聚合酶（購自Fermentas公司，貨號 ΕΡ0405)0.4μ1，加無菌水至終體積為20μ1。
[0094] PCR反應條件為：94°C預變性5min，96°C變性30s，58°C退火30s，72°C延伸194s，反 應35個循環，72°C再延伸lOmin。
[0095] 表6所用引物序列
[0096]
[0097] 結果如圖3所示，與褐黃孢鏈霉菌野生型菌株相比，重組表達載體pMEP: :pimE:: pimM: :vgb、褐黃孢鏈霉菌工程菌株能夠擴增出3230bp的條帶，說明重組表達載體ρΜΕΡ:: pimE: : vgb已經成功插入到褐黃孢鏈霉菌基因組中。其中，1指陰性對照，未加模板;2 為陽性對照，其模板為構建的重組表達載體pIMEP: :pimE: :vgb;3為野生株對照，其 模板為褐黃孢鏈霉菌基因組;4，5，6為陽性轉化子，其模板為相應轉化子的基因組。
[0098]培養基配方：
[0099] MS培養基：
[0100]甘露醇：20.Og;黃豆粉:20.0 g;瓊脂：15.Og;去離子水溶解后，定容至1.0L<a2rC 滅菌20min。
[0101] 種子培養基：
[0102] 葡萄糖：20 · 0g，蛋白胨：6 · 0g，yeast extract: 6 · 0g，NaCl: 10 · 0g，去離子水溶解 后，定容至l.〇L，PH 7.0，121°C滅菌20min。
[0103] 實施例3
[0104] 褐黃孢鏈霉菌工程菌株的發酵控制及納他霉素含量的測定
[0105] 1、褐黃孢鏈霉菌工程菌株的搖床發酵控制
[0106] 將篩選到的褐黃抱鏈霉菌工程菌株（Streptomyces gi 1 vosporeus/pIMEP :: pimE: : pimM: : vgb)CGMCC No · 11790和野生型菌株（S · gilvosporeus S139)均劃線于SS平 板，在28°C培養8-12d。用無菌水洗取新鮮孢子，制備新鮮孢子懸浮液。把孢子懸液按2%-5%的接種量接種到裝有20ml種子培養基的50ml的三角瓶中，28°C、200rpm培養2d。然后將 種子培養基按5%的接種量轉接到盛有50ml發酵培養基的250ml三角瓶中，28°C、200rpm發 酵培養5d。
[0107] 2、褐黃孢鏈霉菌工程菌株5L發酵罐發酵控制
[0108] 將篩選到的褐黃抱鏈霉菌工程菌株（S.gilvosporeus /pIMEP: :pimE: :pimM:: vgb)和野生型菌株(S.gilvosporeu S139)均劃線于SS平板，在28°C培養8-12d。用無菌水洗 取新鮮孢子，制備新鮮孢子懸浮液。把孢子懸液按2%_5%的接種量接種到裝有150ml種子 培養基的500ml的三角瓶中，28°C、200rpm培養2d。然后將種子培養基按5%的接種量轉接到 5L發酵罐中，發酵液總體積為3L。發酵初始通氣量為4L/min，整個發酵過程中PH值控制在 6.0左右，溫度為28°C。并且在30h時(發酵液殘糖低于2% )，以每小時2.5g-3.0g的流速滴加 50%葡萄糖，108h時停止流加。在整個發酵過程中發酵過程控制如下所示：
[0109] (1) 0-7h轉速為250rpm，通氣量維持在4L/min;
[0110] (2) 7-8h轉速為250rpm，通氣量維持在6L/min;
[0111] (3) 8-12h 轉速為 300rpm，通氣量維持在 6L/min;
[0112] (4)12-16h 轉速為 350rpm，通氣量維持在 6L/min;
[0113] (5) 16-20h轉速為至400rpm，通氣量維持在6L/min;
[0114] (6) 20-24h 轉速為450rpm，通氣量維持在 6L/min;
[0115] (7) 24-30h 轉速為 500rpm，通氣量維持在 6L/min;
[0116] (8) 30-38h 轉速為 550rpm，通氣量維持在 6L/min;
[0117] (9) 38-50h 轉速為600rpm，通氣量維持在 6L/min;
[0118] (10) 50-58h 轉速為625rpm，通氣量維持在 6L/min;
[0119] (11) 58-120h 轉速為650rpm，通氣量維持在 6L/min。
[0120] 種子培養基：
[0121 ]葡萄糖：20 · 0g，蛋白胨：6 · 0g，yeast extract: 6 · 0g，NaCl: 10 · 0g，去離子水溶解 后，定容至 1.0L，pH 7.0，121°C滅菌20min。
[0122] 發酵培養基：
[0123] 葡萄糖:40.0g，大豆蛋白胨：15.0g，yeast extract: 5.0g，牛肉浸粉:5.0g，去離子 水溶解后，定容至1.0L，pH 7.5，121°C滅菌20min，其中葡萄糖配制濃度為50%，115°C滅菌 30min〇
[0124] SS培養基：
[0125] 葡萄糖：15.0區；蛋白胨：5.(^，76&8七6叉1^&(31: :3.(^，麥芽浸粉：3.(^，瓊脂粉： 15.(^，去離子水溶解后，定容至1.01^，121<€滅菌2〇111；[11。
[0126] 3、發酵液中納他霉素含量的測定
[0127] 發酵結束后，取lml發酵液與9ml甲醇混合，混勻，超聲20min，之后8000r/min離心 15min，然后用0.22μπι的有機膜過濾得到待測樣品，用HPLC定量分析納他霉素。
[0128] HPLC分析條件：流動相：甲醇：水=70: 30;流速:0 · 700ml/min;檢測波長為303nm; 進樣量為1〇μ1;柱溫為30°C。
[0129] 搖床數據如圖4所示：褐黃孢鏈霉菌工程菌株（3.8；11￥〇8。〇代118/^11^?:4；[11^:: pimM: :vgb)與出發菌株(S.gilvosporeus S139)搖床發酵后的納他霉素產量與菌體干重比 值隨時間變化情況。從圖4中可以看出褐黃孢鏈霉菌工程菌株（5411%叩0代1^/?1腿？：： pimE: :vgb)納他霉素產量比野生株高，且在第4天時這種差異最為顯著。計算結果表 明，褐黃孢鏈霉菌工程菌株（3.〖；11￥08卩0代118/卩11^::卩；[11￡::卩；[11^[::￥〖13)在第4天時其發酵 液單位菌體所產的納他霉素較出發菌株提高了56%。由此證明他霉素生物合成基因簇中調 控基因 pimM和膽固醇氧化酶基因 pimE的置加效應以及外源基因 vgb的表達可明顯提尚褐黃 孢鏈霉菌中納他霉素的產量。圖5為用第4天發酵液做的抑菌圈實驗，其指示菌株為酵母菌。 該圖更為直觀的看出褐黃孢鏈霉菌工程菌株(S.gilvosporeus/pIMEP: :pimE: :vgb) 合成納他霉素的能力高于野生株。野生菌株和工程菌株5L發酵罐培養后數據如表7所示，由 于pimM和pimE過表達及外源基因 vgb表達的疊加效應，工程菌株上罐發酵后納他霉素產量 增加，其增長率在后期逐漸降低;但在120h時，其納他霉素產量較野生菌株產量仍提高了 15.6%，達到10.136g/L。可見，由于三者之間的疊加效應，使納他霉素合成時間大大縮短。
[0130] 表7出發菌株與工程菌株納他霉素產量比較
[0131]
[0132] 上述參照【具體實施方式】對該褐黃孢鏈霉菌重組表達質粒及工程菌與應用進行的 詳細描述，是說明性的而不是限定性的，可按照所限定范圍列舉出若干個實施例，因此在不 脫離本發明總體構思下的變化和修改，應屬本發明的保護范圍之內。
【主權項】
1. 一種褐黃孢鏈霉菌重組表達質粒，其特征在于:是由調控基因 PimM、膽固醇氧化酶基 因 PimE和外源血紅蛋白基因 vgb分別插入含有紅霉素啟動子的載體pMEP中得到的的重組 表達載體pIMEP: :pimE: :vgb，重組表達載體pIMEP: :pimE: :vgb的序列為序列 表〈400>17所示序列。2. -種含有權利要求1所述褐黃孢鏈霉菌重組表達質粒的工程菌，其特征在于:保藏號 為CGMCC No.11790。3. 權利要求2所述工程菌高產納他霉素的應用。4. 根據權利要求3所述的工程菌的應用，其特征在于:包括補充碳源，調控通氣量和攪 拌轉速，發酵過程中30h-108h以2.5g/L-3g/L的流速流加50 %葡萄糖溶液;控制發酵液pH為 6;初始通氣量為4L/min，7h升至6L/min;在相應的不同時間點調節轉速，至58h調至650rpm 后不再變化。
【文檔編號】C12P19/62GK105907778SQ201610203779
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年3月31日
【發明人】劉浩, 孫春杰, 何希宏, 王海霞
【申請人】天津科技大學