專利名稱：重組蛋白a基因及其表達產物的制備的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物工程技術領域，涉及一種重組蛋白A基因，以及含有這種重組基因的載體、轉化的菌株和重組蛋白A基因表達的產物，及其純化方法和親和填料的制備和用途。
背景技術：
葡萄球菌蛋白A(Staphylococal ProteinA， SPA)是一種從金黃色葡萄球菌細胞壁分離的蛋白質。1940年，Vevwey發現在某些金黃色葡萄球菌中含有一種物質，在雙向擴散試驗中，能與正常人血清形成沉淀。1959年Jensen也發現了類似現象，將其命名為A抗原。1963年Lofkvist等人分離了 A物質，證明它是一種蛋白質，且與糖有不同；1960年Grov命名其為葡萄球菌蛋白A，簡稱SPA (ProteinA)。編碼SPA的基因于1983年被克隆并在大腸桿菌中表達。Uhlen等在1984年闡明了蛋白A的全基因序列和相應的氨基酸序列。對蛋白A的結構和功能研究發現，SPA包括A、B、C、D、E等5個同源結構域，每個結構域都有與大多數哺乳動物IgG的Fc區獨立結合的能力。2003年，L. Yang等應用表面張力探針證明每個蛋白A分子可結合兩個IgG分子。 重組蛋白A是抗體純化首選介質。盡管目前國內抗體大規模生產的產量還相對較低，但隨著我國許多抗體藥物大規模生產計劃的實施，抗體生產量將在近幾年內迅速增加，由此市場對蛋白A及其親和填料的需求量會迅速提高。 目前我們所使用的蛋白A及填料多依賴于進口 ，價格昂貴，而國內同類產品存在產量低、活性差等不足，這些都嚴重限制了其廣泛大量應用。急需一種改進的蛋白A制備瓊脂糖凝膠，以獲得更高IgG純度、載量及低proA脫落的穩定的親和填料，用于抗體的高效純化。 目前所使用的蛋白A免疫吸附材料采用的基質是瓊脂糖凝膠，與蛋白A的偶聯方式多為溴化氰或環氧氯丙烷活化偶聯，這2種活化方式有著明顯不足(l)溴化氰是一種劇毒物質，合成過程對人體和環境危害較大；(2)環氧活化時，環氧基在堿性條件下易水解，活化效率低；本研究采用N-羥基琥珀酰亞胺活性酯化法(NHS)活化載體，活化條件溫和，對蛋白A配體活性影響小，且由于活化過程中引入間隔臂，使單位體積的蛋白A親和填料可結合更多的IgG，可明顯提高其IgG結合載量。

發明內容
本發明需要解決的技術問題之一是提供一種新的重組蛋白A的基因序列，以克服現有技術的不足。 本發明需要解決的技術問題之二是提供該重組蛋白A的氨基酸序列，以克服現有技術的不足。 本發明需要解決的技術問題之三是提供含有該重組蛋白A基因的載體。 本發明需要解決的技術問題之四是提供被含有重組蛋白A基因的表達載體轉化宿主細胞。 本發明需要解決的技術問題之五是提供該重組蛋白A的制備方法。 本發明需要解決的技術問題之六是提供該重組蛋白A的用途。 本發明需要解決的技術問題之七是提供一種由該重組蛋白A和層析介質載體組
成的親和層析介質。 本發明的技術方案如下 本發明提供的重組蛋白A基因是以6個人工合成的重組蛋白A基因單體(基因序 列根據大腸桿菌對密碼子的偏愛性進行了優化)串聯而成，5'端Ala-Asp變成Val-Asp，以 形成Accl酶切位點，各重組蛋白A基因單體間以Accl酶切位點相連，其中第一個重組蛋白 A基因單體前端引入與表達載體pBV220 —致的EcoRI酶切位點及6個His標簽，最后一個 重組蛋白A基因單體末端加入終止密碼子TAA及與表達載體一致的BamHI酶切位點。該基 因由1073個核苷酸組成，編碼352個氨基酸。該基因序列及編碼的氨基酸序列見序列表 SEQ No. 1和SEQ No. 2。 本發明還構建了含有上述重組蛋白A基因的重組表達載體，構建方法是將化學合 成的重組蛋白A基因單體用EcoRI和BamHI雙酶切后連接到同樣酶切的pBV220載體上，再 以Accl內切酶進行單酶切，構建含6個串聯重組蛋白A基因單體的重組蛋白A基因表達載 體。 本發明還提供了利用上述含大腸桿菌重組表達載體的大腸桿菌生產重組蛋白A 的方法，該方法是將菌株進行發酵，高效表達重組蛋白A，再離心菌液收集菌體，超聲破碎， 取離心上清進行分離純化，獲得重組蛋白A產品。 本發明生產的重組蛋白A為可溶性表達，且具有表達量高(占細菌可溶性蛋白總 量的80%以上)、表達時間短(僅數小時)、易于純化、成本低等優點，有利于基因工程重組 蛋白A的產業化生產。 本發明的重組蛋白A基因的表達產物重組蛋白A用于與瓊脂糖凝膠等層析介質載 體偶聯制備親和層析填料用于抗體(藥物)的分離純化。 本發明生產的重組蛋白A具有IgG結合活性強、純度及產量高等優點。 本發明生產的重組蛋白A親和填料具有IgG載量高、結合特異性強、親和力好、蛋
白A配體脫落少等優點，各項指標等同于或優于目前市售的protein A S印harose 4Fast
Flow。


圖1是本發明構建的重組表達載體pBV220-P，是在載體pBV220中加入protein A基因。 圖2重組蛋白A表達產物分步純化的SDS-PAGE電泳圖。其中泳道1是低分子蛋 白marker ;泳道2是經誘導的DH5a/pBV220-P菌體超聲破菌后的離心上清；泳道3是樣品 經金屬鎳親和層析柱純化的重組蛋白A ;泳道4是經分子篩S印hacryl S200純化的重組蛋 白A。 圖3是本發明的重組蛋白A與市售的幾種蛋白A的ELISA活性比較圖。 圖4是用人IgG s印harose 6FF測定重組蛋白A的hlgG結合活性的色譜圖。圖中第1個峰為蛋白A流穿峰，第二個峰為洗脫的蛋白A。 圖5是重組蛋白A瓊脂糖凝膠6B FF分離兔血清中的IgG的分離純化色譜圖。 圖6是重組蛋白A瓊脂糖凝膠6B FF分離兔血清中的IgG的SDS-PAGE電泳圖，其
中泳道1 :低分子量marker ;泳道2 :兔血清；泳道3 :純化的兔IgG。 圖7是在不同條件下的重組蛋白A的活性ELISA檢測結果條形圖。 圖8是重組蛋白A瓊脂糖凝膠6B FF的IgG載量穩定性檢測的分離純化色譜圖。 圖9是重組蛋白A瓊脂糖凝膠6B FF純化的IgG樣品中脫落配基蛋白A檢測的標
準曲線圖。
具體實施例方式
實施例1重組蛋白A基因單體的合成 為促進金黃色葡萄球菌蛋白A基因在大腸桿菌中的表達，根據大腸桿菌密碼子的 偏愛性，優化蛋白A的B結構域基因中某些堿基序列(有多種優化方案，序列表SEQNo. 1為 其中一種優化后序列)，通過化學合成的方法，設計合成重組蛋白A基因單體序列，其序列 長度為174bp，兩端是AccI酶切位點，用于多個重組蛋白A基因單體連接的接頭。此外，還 包括起始密碼子ATG，終止密碼子TAA、克隆用EcoRI和BamHI限制性內切酶位點及5'端 6XHis標簽序列。 實施例2含有一個重組蛋白A基因單體的pBV220表達載體的構建 將化學合成的重組蛋白A基因單體用EcoRI和BamHI雙酶切后連接到同樣酶切的
pBV220載體上，轉化大腸桿菌，篩選具有氨芐青霉素抗性的轉化子，抽提質粒經PCR、酶切
及測序鑒定后證明重組蛋白A基因單體已克隆至pBV220中。 實施例3含有重組蛋白A基因的pBV220-P表達載體的構建 將上述的含一個重組蛋白A基因單體的pBV220載體及重組蛋白A基因單體以 Accl酶切，回收相應片段后連接，轉化大腸桿菌，篩選具有氨芐青霉素抗性的轉化子，抽提 質粒經PCR、酶切及測序鑒定后證明重組蛋白A基因(6個蛋白A基因單體串聯)已克隆至 pBV220中。結果如說明書附圖l所示。
實施例4pBV220-P表達載體轉化大腸桿菌 pBV220-P用CaCl2法轉化E. coli DH5 a ，在含有氨芐青霉素的LB平板上篩選轉
化子，經PCR、酶切及測序鑒定獲得含有pBV220-P的克隆子。 實施例5利用工程菌E. coli DH5 a /pBV220-P生產重組蛋白A 1)菌種的培養發酵 按l : 50將大腸桿菌工程菌E. coli DH5a/pBV220-P接種于新鮮LB培養基中， 3(TC培養過夜；次日在無菌條件下將上述培養好的種子培養基按1 : 20接種至發酵培養基 中，3(TC培養至0D6。。達到0. 5-0. 8時，升溫至42。C誘導，誘導4h后離心收菌。
2)表達產物的純化 取發酵誘導菌用PBS洗滌3次，溶解，超聲破碎，4t:離心，收集上清，用0. 45 y m濾 器過濾，適當稀釋后，用金屬螯合鎳瓊脂糖凝膠親和層析柱進行純化，收集洗脫峰，再將洗 脫液進行S印hacryl S200分子篩進行純化，收集特征峰即為純化的重組蛋白A，其純化可 達95%以上，而在菌體上清蛋白中蛋白A含量已超過80% (含量明顯高于其它相關專利報道)。結果如說明書附2所示。 實施例6重組蛋白A的ELISA活性 1)兔IgG(2ug/ml)包被，37。C，2h 2)37"，封閉2h，洗板 3)加入不同濃度的重組蛋白A，37t:，lh，洗板 4)加入1 : 1000的辣根標記兔IgG抗體，37t: lh，洗板 5)顯色，酶標儀讀數0D450 經ELISA檢測表明，本發明的重組蛋白A與兔IgG有很好的結合活性，其活性高于 目前市售的幾種重組蛋白A，且每孔加入lng重組蛋白A即可獲得明顯檢測信號。結果見附 3。 實施例7重組蛋白A的人IgG結合活性 人IgG s印harose 6FF膠裝柱1ml (配基含量為18mg IgG/ml膠) 1)填料裝柱后，用平衡緩沖液流PBS洗5 10個柱床體積平衡柱子。 2)將樣品(蛋白A濃度約10mg/ml)稀釋10倍上柱，上樣流速0. 5ml/min。 3)平衡緩沖液再洗5 10個柱床體積，把UV洗至基線。 4)洗脫緩沖液0. 1M glycine-HCl， pH 3. 0洗脫，收集洗脫峰，立即用PBS中和到 中性。 5) 0. 1M glycine-HCl洗脫緩沖液流洗3 5個柱床體積。再用PBS流洗3 5個
柱床體積。 結果 用BCA法測洗脫峰蛋白量為2. 5mg.由此得知本發明的重組蛋白A的人IgG結合
活性為7. 2mglgG/mg proA。 色譜圖見說明書附4 。 實施例8重組蛋白A瓊脂糖凝膠6B FF的制備 1)室溫下將瓊脂糖凝膠6B FF與0. lmol 二環己基碳二亞胺(DCC)和0. lmol/L
N-N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)的無水二氧六環反應90min。 2)合成的酯用二氧六環和甲醇充分洗滌以除去沉淀的二環己基脲。 3)在pH7. 5，4t:和磷酸鹽緩沖液的條件下，加入重組蛋白A(8mg/ml膠)反應6h。 4)偶聯反應結束后，將凝膠在室溫和pH9的條件下與lmol/L甘氨酸反應2h，以破
壞殘留的活性酯。 5)用磷酸鹽緩沖液充分洗滌。 重組蛋白A瓊脂糖凝膠6B FF具有以下特點 1)基質6%的交聯瓊脂糖凝膠 2)配體重組蛋白A 3)配體密度約6mg重組蛋白A/ml 4)吸附載量30-40mg人IgG/ml 5)蛋白A脫落少，結合特異性高 6)最大流速300cm/h 7)pH范圍3-10
8)使用溫度室溫 9)保存溫度及液體4-8°C ， 20%乙醇 10)穩定性高親和填料可重復使用多次而IgG載量無明顯下降。
實施例9重組蛋白A瓊脂糖凝膠6B FF從兔血清中分離純化IgG
1)重組蛋白A瓊脂糖凝膠6B FF裝柱。 2)用緩沖液A洗5 10個柱床體積平衡柱子，流速為lml/min。 3)將兔血清用緩沖液A稀釋10倍，0. 45 ii m濾膜過濾，上樣，流速為lml/min。4)用緩沖液A再洗5 10個柱床體積，流速為lml/min。 5)用緩沖液B洗脫，流速為lml/min，收集洗脫峰，立即用中和緩沖液中和到中性。
5)用純水洗10個柱床體積，再用20%的乙醇流洗10個柱床體積，流速為2ml/ min，柱子置于4-8t:保存。 6)將分離純化的IgG樣品進行SDS-PAGE電泳分析。
緩沖液組成 緩沖液A :20mM磷酸鹽緩沖液，pH7. 4。 配制0. 2M NaH2P0419ml， 0. 2M Na2HP0481ml， NaCl 9g加水至1000ml 。 緩沖液B :20mM檸檬酸緩沖液，pH4. 0。配制檸檬酸2. lg加水950ml，用5M NaOH 調至pH4. O，加水至1000ml。
結果 分離純化色譜圖見圖5 ;SDS-PAGE電泳分析結果見圖6，泳道1為低分子量蛋白 marker,泳道2為兔血清，泳道3為本發明的重組蛋白A瓊脂糖凝膠6B FF親和填料所裝的 柱子洗脫峰樣品，其上下兩條帶分別是IgG的重鏈和輕鏈。實驗結果表明，用本發明的重組 蛋白A瓊脂糖凝膠6B FF親和層析介質經一步純化就可以得到純度大于95 %的IgG，用BCA 法測洗脫IgG量為35mg/ml膠。 實施例10本發明的重組蛋白A不同條件下穩定性檢測取本發明的重組蛋白A(lmg/ml)分別置于4°C 、室溫7天及pH3和pHll條件下2h， 反復凍融10次，分別取樣4次，進行ELISA活性測定，觀察蛋白A在不同條件下穩定性情況。 ELISA活性測定見實施例6重組蛋白A的ELISA活性
結果 除在室溫下重組蛋白A活性呈明顯下降趨勢，在其他條件下蛋白活性無顯著降 低，這表明在常見條件下蛋白A活性穩定性較好。
結果見圖7。 實施例11重組蛋白A瓊脂糖凝膠6B FF穩定性檢測 方法見實施例8重組蛋白A瓊脂糖凝膠6B FF從兔血清中分離純化IgG 上述試驗重復進行10次 結果 BCA法測10次洗脫峰蛋白量都在30-40mg/ml膠范圍內。 從純化峰圖及BCA所測IgG濃度結果看，重組蛋白A瓊脂糖凝膠6B FF經過10次 兔血清純化試驗IgG載量無下降趨勢，這表明本發明的重組蛋白A瓊脂糖凝膠6B FF的IgG 載量穩定性很好。分離純化色譜圖見圖8。
實施例12重組蛋白A瓊脂糖凝膠6B FF純化IgG樣品中脫落配基蛋白A檢測 用cygnus protein A ELISA試劑盒F400進行IgG樣品的殘留蛋白A檢測。 方法見cygnus protein A ELISA試劑盒F400使用說明書。 結果 蛋白A ELISA標準曲線見圖9。 根據此標準曲線計算IgG樣品中殘留蛋白A含量〈lng/mg IgG，普遍低于國內外
同類產品水平。 序列表 1. —般信息 發明名稱高效抗體純化介質_重組蛋白A及其親和填料的制備 序列數目2 2. SEQ ID Nol的信息 Organization Applicant -------------------- Street :北京經濟技術開發區永昌中路6號 City:北京 State: Country :中國 PostalCode :100176 PhoneNumber :86-10-67871177 FaxNumber :86-10-67877776 EmailAddress :gong_zl@agtc. com. cn 〈110>bastName :zhaolong 〈110>FirstName :gong 〈110〉Middlelnitial : 〈110〉Suffix: Application Proj ect ------------------- 〈120〉Title :重組蛋白A基因及其表達產物的制備 〈130>AppFileReference :Cloned Genes Encoding Recombinant protein A 〈140>CurrentAppNumber : 〈141〉CurrentFilingDate :2008-12-21 Sequence -------- 〈213>0rganismName -Staphylococcus aureus 〈400〉PreSequenceString : g朋ttcatet ggtggtggat朋ca朋ttc;a 3C3朋g3gca gcag朋cgcg ttctecgaga 60 tcctgcatct gccgaacctg aacgaagaac agcgteacgc cttcatccag tctctgaaag 120 atgacccatc tcaaagcgct aaccttctgg cagaagctea gaagctg朋t gatgctcagg 180






































3gc3gcag皿cgcgttctec gagatcctgc240
cctg皿cg皿g皿cagcgteacgccttcat ccagtctctg aaagatgacc300
cgcteaccttctggcag皿gcteag皿gct g皿tgatgct caggcgccg3360
皿3g3gC3gCagaacgcgtt ctecgagatc ctgcatctgc420
Cg皿g皿C3gcgteacgccttcatccagtc tctgaaagat gacccatctc■
ccttctggcag皿gcteaga3gctg皿tga tgctcaggcg ccg皿ggteg540
C3gC3g皿Cgcgttctecga gatcctgcat ctgccgaacc600
3cagcgteacgccttcatccagtctctg皿3g3tgaccc3 tctca皿gcg660
ggcag皿gct皿g皿gctga3tgatgctc3 ggcgccg皿g gtegac皿c3720
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teacgccttcatccagtctctg皿3gatg3 cccatctc皿agcgcteacc840
3gcteag皿gctg皿tgatgctcaggcgcc g皿ggtegac皿c朋attc3■
gcag皿cgcgttctecgagatcctgcatct gccgaacctg aacgaagaac960
cttcatccagtctctgaaagatgacccatc tcaaagcgct aaccttctgg1020
g皿gctg皿tgatgctc郷cgccg皿ggt ggatteagga tcc1073
cgccg皿ggt atctgccgaa catctcaaag 3ggtegac皿 cg皿cctg皿 3皿gcgctea
tg皿cg皿ga cteaccttct
ttctggcaga
agcgteacgc C3g皿gctea 〈212〉Type :DNA 〈211〉Length :1073 SequenceName :protein SequenceDescription :無 3. SEQ ID No2的信息 Organization Applicant
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A gene
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LYS LYS LEU ASN ASP ALA GLN 〈212>Type:PRT 〈211〉Length :352 SequenceName :protein A
ALA PRO LYS VAL ASP
權利要求
一種人工重組蛋白A的基因表達序列，其特征是1)其序列根據宿主菌大腸桿菌密碼子的特點進行了優化；2)包含6個人工重組蛋白A的基因單體重復序列；3)包含his標簽序列。
2. 根據權利要求1，所述的基因序列為SEQ Nol。
3. 根據權利要求l，所述的重組蛋白A的氨基酸序列為SEQ No2。
4. 根據權利要求l，所述的重組蛋白A基因表達載體為原核表達載體，其特征為所述表達載體優先為pBV220。
5. —種重組蛋白A瓊脂糖凝膠，其特征是以瓊脂糖凝膠為基質，采用N-羥基琥珀酰亞胺活性酯化法(NHS)活化載體，將所述的蛋白A以共價鍵的方式固定在載體表面，從而合成了蛋白A瓊脂糖凝膠。
6. 根據權利要求5，所述的瓊脂糖凝膠可以用于抗體分離純化。
全文摘要
本發明屬于生物工程技術領域。本發明是將蛋白A的B結構域基因單體根據大腸桿菌密碼子的偏愛性進行優化，構建六串體插入熱誘導型大腸桿菌載體pBV220，構建了含有該基因的大腸桿菌表達載體及其轉化的大腸桿菌DH5α重組株和利用此菌株生產重組蛋白A的方法。此菌株所產生的可溶性重組蛋白A達到細菌可溶性蛋白總量的80％以上，以后只經鎳離子螯合層析和分子篩柱層析即可將重組蛋白A純化到95％以上純度，且該蛋白具有表達量高、成本低、易純化等優點。用其制備的重組蛋白A親和填料具有人IgG吸附載量高、proA脫落少等優點。本發明為獲得質量高且價格便宜的抗體(藥物)純化介質重組蛋白A提供了一條切實可行的途徑。
文檔編號C07K1/00GK101760466SQ20081024055
公開日2010年6月30日 申請日期2008年12月24日 優先權日2008年12月24日
發明者何新舟, 宮照龍, 曹暉, 許允立 申請人:本元正陽基因技術有限公司