專利名稱：一種重組蛋白表達的快速檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種免疫膠體金偶聯單克隆抗體的方法及應用，提供了一種應用于基因重組蛋白表達的快速檢測方法，該方法利用針對重組表達蛋白中特定抗原表位(可以是標簽或非標簽成份)的特異抗體，可以簡便/快速地判別生物標本中是否存在所表達的靶標蛋白，整個檢測過程不超過30分鐘。
二
背景技術：
基因的重組表達，已經成為生命科學技術中的一種常用手段，被應用于生命科學研究和生產的各個領域，如蛋白質的功能研究、生物醫藥研究、藥物的生產等等。在基因的重組表達中為了方便外源基因表達的檢測，大多數蛋白是以融合蛋白的形式進行表達，也就是在欲表達蛋白的氨基端或羧基端加入一些具有抗原表位性質的多肽序列，即表達標簽，通過使用標簽特異性抗體對表達樣品進行檢測，即可確定外源基因是否表達。常用的表達標簽有GST標簽、His標簽、c-myc標簽、V5標簽、HA標簽、Trx標簽、GFP標簽及FLAG標簽等等。這些常用的標簽中有些還可以用來對表達蛋白進行純化如GST標簽和His標簽就可以分別用谷胱甘肽和鎳偶聯的凝膠對表達蛋白進行親和純化。在基因重組表達的研究和生產中，檢測目的基因是否在宿主(細菌、真菌、細胞、 組織、器官)中表達是至關重要的。常用的檢測方法有對于表達量較高的原核表達系統來說，可以使用常規的SDS-PAGE進行檢測，與未誘導或無插入片段的菌相比較，有明顯的新的條帶出現，即初步認為有目的基因的表達。對于表達量較低的原核表達載體和真核表達系統，SDS-PAGE染色后很難見到明顯的表達條帶，因此需要對樣品通過靈敏度更高的免疫印跡(Western Blot)方法進行檢測，以確定目的基因是否表達。免疫膠體金技術自上個世紀70年代發明以來，已經廣泛應用于生物醫學領域。與傳統的免疫臨床診斷試劑相比，免疫膠體金試劑具有簡便、快速、不依賴任何儀器的特點。 免疫膠體金試劑的原理是通過將納米金顆粒標記在特定的抗原和抗體上，當被標記的抗體或抗原與固相化的相應的抗原或抗體發生反應后，造成被標記的抗體或抗原在局部區域的聚集，從而產生肉眼可見的紅色條帶。與傳統的SDS-PAGE和Wfestern Blot相比較，免疫膠體金技術具有簡便、快速、不依賴任何儀器等特點簡便，樣品處理方案簡便，不需要電泳等過程；快速，Western Blot需要2天時間才能檢測完成，SDS-PAGE也需要4——5小時，而本發明采用的免疫膠體金技術全過程不超過30分鐘；不依賴任何儀器，SDS-PAGE需要電泳儀及相應的緩沖體系，Western Blot則需要的儀器試劑更多，免疫膠體金技術則不需要任何儀器，僅需要的簡單緩沖體系即可。因此，本發明非常適合重組融合蛋白的快速檢測，為科研研究、蛋白表達生產等節省了大量時間。
三

發明內容
本發明的目的是要提供一種利用特異性抗體和膠體金技術，簡便快速地檢測基因重組蛋白表達的方法以及由此方法所產生的用于實現這一目的的相關試劑。基因的重組表
3達可以是天然蛋白表達，也可以是帶有標簽的融合蛋白。當使用針對重組表達蛋白自身成份的特異性抗體時，本發明所用的方法與根據這些方法制備的試劑可以且只可以用于該種重組蛋白表達的檢測。當使用針對重組融合表達蛋白中標簽成份的特異性抗體時，本發明所用的方法與根據這些方法制備的試劑可以作為一種普適性的檢測產品，用于檢測帶有該標簽的任意融合蛋白的表達。在本發明方法中所適用的重組融合蛋白標簽包括但不限于1) 在原核系統和真核系統中表達的帶有His標簽的融合表達蛋白；2)在原核系統和真核系統中表達的帶有GST標簽的融合表達蛋白；3)在原核系統和真核系統中表達的帶有TRX標簽的融合表達蛋白；4)在原核系統和真核系統中表達的帶有V5標簽的融合表達蛋白；5)在原核系統和真核系統中表達的帶有c-myc標簽的融合表達蛋白；6)在原核系統和真核系統中表達的帶有HA標簽的融合表達蛋白，7)在原核系統和真核系統中表達的帶有GFP標簽的融合表達蛋白8)在原核系統和真核系統中表達的帶有FLAG標簽的融合表達蛋白。本發明提供了實現上述目標的具體方法，包括1)特異性重組蛋白抗體(針對重組蛋白中的標簽或非標簽成份)的選擇及純化；幻納米金顆粒的制備方法；3)以納米金顆粒標記抗體的方法；4)免疫膠體金快速檢測試紙條的制備及組裝方法力)使用免疫膠體金快速檢測試紙條檢測重組蛋白的方法；6)發明相關參數的檢測方法本發明所涉及的旨在簡化重組標簽融合蛋白表達檢測步驟，縮短測時間，提高檢測效率的方法，主要包括以下步驟1)特異性重組蛋白抗體(針對重組蛋白中的標簽或非標簽成份)的選擇與純化，根據欲檢測的重組蛋白的不同選用特異性識別所需檢測的重組蛋白的抗體，該抗體可以是多克隆抗體，也可以是單克隆抗體。所選擇的抗體需進行純化， 純化的方法可以選擇目前使用的常規的抗體純化方法，包括但不限于辛酸-硫酸銨沉淀法、Protein A或ftOtein G親和純化法，以及抗原親和純化法等。2~)納米金標記的抗體的制備，通過還原法制備一定直徑的納米金膠體溶液。本發明中所用的膠體金顆粒的直徑為 20nm，在現有的方法的基礎上稍加改動可以制備直徑范圍在10-200nm之間的膠體金顆粒。 然后用此膠體金溶液對純化后的抗體進行標記，標記后的抗體經過純化后用于免疫膠體金試紙條的制備。幻免疫膠體金快速檢測試紙條的制備及組裝方法。4)使用免疫膠體金快速檢測試紙條檢測重組蛋白的方法。重組蛋白的表達是當前生物與醫藥科研相關領域廣泛應用的實驗技術。本發明利用免疫膠體金技術對包括但不限于原核和真核生物中表達的重組蛋白進行簡便快速地檢測，部分取代常規的SDS凝膠電泳和免疫印記檢測，顯著地提高了工作效率。在生物制藥領域，在重組蛋白藥物的發酵生產過程中需頻繁檢測重組蛋白的表達水平以相應地調節技術參數、確定發酵終點。本發明方法可以半定量方式對重組蛋白的表達水平進行快速評估，簡化了檢測程序，縮短了檢測時間并降低了檢測成本。
四.


附圖1膠體金溶液質量檢測附圖2膠體金最適pH條件摸索附圖3膠體金最適pH條件確認附圖4膠體金最佳抗體標記濃度確認附圖5膠體金交叉反應檢測。只有當樣品中含有His標簽融合蛋白時T線消失。當樣品中無重組蛋白，或重組蛋白不含有His標簽時T線出現。C線在各樣本檢測中均出現，提示檢測試劑工作正常，檢測結果有效。附圖6膠體金靈敏度檢測。當樣品中His標簽融合蛋白含量大于或等于1 μ g/ml 時T線消失。當樣品中His標簽融合蛋白含量小于或等于lOOng/ml時T線出現。C線在各樣本檢測中均出現，提示檢測試劑工作正常，檢測結果有效。
五.
具體實施例方式以下以重組His標簽融合蛋白快速檢測試紙的制備與檢測實驗為例，描述本發明方法的實施過程和實際可應用性。這些實施例并不以任何方式限制本發明待批權利要求的范圍。實施例1.抗His標簽單克隆抗體的純化單克隆抗體純化所需試劑a) Protein G偶聯的kpharose凝膠(GE公司產品)，b)磷酸鹽緩沖液(PBS) :20mM sodium phosphate,0. 15M NaCl, pH 7. 2，c)洗脫液 Glycin-HCl (pH 2. 7)小鼠抗His標簽的單克隆抗體由北京康為試劑生物科技有限公司通過常規細胞融合技術制備完成，抗His標簽的單克隆抗體經ftOtein G親和純化的方法從小鼠腹水中獲得。取IOml腹水，用PBS (pH7. 2)稀釋1倍后，加入裝有^il Protein G偶聯的kpharose 凝膠，控制流速0. 2ml/min，上樣完成后用平衡緩沖液PBS沖洗親和柱至流出液的OD 280監測值回到基線水平后，用PH2. 7的Glycin-HCL洗脫抗體，洗脫后的溶液立即用IM Tris中和。提純后的抗體經SDS-PAGE檢測其純度，并用ELISA法測定其抗體活性。實施例2.納米金膠體溶液的制備采用檸檬酸三鈉還原法并簡述如下取硅化過的三角瓶，加入IOOmL去離子水及 ImLl %氯金酸，加熱沸騰；迅速加入的1 %檸檬酸三鈉，此時可觀察到淡黃色的氯金酸水溶液很快變成灰色，續而轉成黑色，隨后逐漸穩定成紅色。全過程約3min，繼續煮沸 15min，冷卻后用去離子水補足體積至100mL。用可見光光譜掃描檢測膠體金的制備效果，在 522nm處有單一吸收峰(附圖1)。實施例3. His標簽抗體標記納米金顆粒的方法3. 1抗體與膠體金結合的最適pH值確定取1. 5mL離心管，分別加入ImL膠體金溶液，用0. lmol/L K2C03將pH值分別調至 6. 0,6. 5,7. 0,7. 5,8. 0,8. 5,9. 0 和 9. 5。將單抗溶液以 3000r/min 4°C離心 20min，去除不溶性殘渣。取50 μ L lmg/mL的單抗加入上述膠體金管中，震蕩20min后室溫放置IOmin ； 然后每管分別加入100 UL 10% NaCl溶液，震蕩混合后室溫放置lOmin，進行可見光光譜掃描檢測，記下偶聯率最高的PH值X (在相同條件下，吸收峰最高時的pH值)。再將pH值調至X-0. 6、X-0. 4、X-0. 2、X、X+0. 2、X+0. 4和X+0. 6，重復上述試驗，偶聯率最高的pH值，即為最適PH值。pH條件的優化實驗結果顯示，適宜的pH范圍在6. 4與10. 0之間，更適宜的 PH范圍在7. 0與8. 0之間，最適宜的pH條件為pH7. 4。可見光譜掃描檢測結果見附圖2和 3。3. 2抗體與膠體金結合的最佳濃度的確定分別取0. 5mL pH7. 4的膠體金加入到1. 5mL離心管中，加入His單抗溶液，使其終濃度分別為0、15、20、25、30、35、40、45μ g/mL，震蕩混合20min，室溫放置IOmin0然后每管加入100 μ LlOO % NaCl，震蕩混合后室溫放置后lOmin，進行可見光光譜掃描檢測，結果顯示，適宜的抗體終濃度范圍為15-45 μ g/mL之間，更適宜的抗體終濃度范圍為35-45 μ g/mL 之間，最適宜的抗體濃度為35μ g/mL(附圖4)。3. 3膠體金探針的制備及純化取1. 5mL離心管，加入ImL膠體金；用0. lmol/L K2C03調pH值最適pH ；逐滴加入 His單抗，整個過程大約5min加完。搖勻15 20min，室溫放置10 15min ；加入10% BSA 至終濃度為1.5% (標記體積可增加，所需要的相應試劑也增加)標記的膠體金抗體溶液應用差速離心法進行純化將標記的膠體金溶液以 10000r/min離心45s，棄去沉淀。12000r/min離心30min，吸棄上清液；加入1/10體積的硼酸緩沖液，充分溶解沉淀，重復離心2 3次，轉到1. 5mL離心管中。將純化好的膠體金探針用等量的硼酸緩沖液溶解。實施例4.免疫膠體金試紙條的制備及組裝4. 1玻璃纖維膜探針的制備按0. 5mL/條(0. 5 X 5cm/條)的量將膠體金探針均勻涂布在玻璃纖維上，置于超凈工作臺中通風干燥過夜，37 °C放置備用。4.2NC膜的預處理將NC膜，用 0. Olmol/L PBS+1 % BSA+0. 2% Tween-20+0. 05mol/LNaCl 溶液 37°C封閉30 60min，去離子水洗2次，4°C過夜干燥備用。4. 3T線及C線條件的優化設置幾組不同的抗原濃度對NC膜的T線(檢測線)和C線(質控線)進行優化， 優選出一組作為T線和C線的包被濃度，分別為1. 0-20. 0mg/mL和1. 0mg/mL。T線的包被濃度將決定試紙條產品的檢測靈敏度。制備一系列T線包被濃度不同，因而檢測靈敏度不同的試紙條即可形成具半定量檢測功能的檢測試紙條套裝。T線與C線寬度均為0. 5mm。4. 4T線及C線的劃膜方法根據T線與C線抗原濃度的優化的結果，分別將純化好的抗原和羊抗鼠IgG抗體用緩沖液稀釋至最佳濃度；NC膜4°C放置過夜后備用。4. 5試紙的組裝戴上手套，將包被好的NC膜粘到PVC底板上，注意膜的下緣與模具上的標記線對齊，小心抹平膜面。將噴涂好金標抗體的玻璃纖維緊靠標尺下邊緣粘到PVC底板上，并小心抹平。將樣品墊緊靠模具下邊緣粘到PVC底板上，并小心抹平。將吸水紙緊靠模具上邊緣粘到PVC底板上，并小心抹平。用切條機切成3. 5mm寬的試紙，在裝配區將切好的試紙放入適當尺寸的商品塑料外殼并置于裝有干燥劑的包裝袋內保存。實施例5.免疫膠體金試紙條快速檢測重組His標簽融合蛋白的使用方法及結果判定將試紙條加樣孔向上置于平整表面，向加樣孔內滴入約100微升待測樣本。室溫下靜置5 IOmin后觀察檢測結果。陰性反應出現兩條紅線(C線和T線)，提示樣本中不含有重組His標簽融合蛋白。陽性反應只出現一條紅線(C線)，提示樣本中含有重組His 標簽融合蛋白且檢測有效。質控線(C線)必須出現，否則該試紙無效(附圖5)。實施例6.發明相關參數實驗檢測
6.1特異性實驗分別收集含有重組His標簽融合蛋白的大腸桿菌菌液和含有非His標簽重組蛋白的大腸桿菌菌液，另以不含有任何重組蛋白的大腸桿菌菌液作對照，用商品細菌裂解液 (北京康為世紀生物科技有限公司產品)按說明書操作，將細菌裂解后以實施例5.的方法進行檢測。實驗結果顯示只有當樣品中含有His標簽融合蛋白時T線消失。當樣品中無重組蛋白，或重組蛋白不含有His標簽時T線出現。C線在各樣本檢測中均出現，提示檢測試劑工作正常，檢測結果有效(附圖5)。檢測結果說明制備的試紙可有效檢測含有His標簽的重組融合蛋白，而不與非His標簽菌液發生交叉反應。6. 2靈敏度實驗如實施例4. 3中所述，T線的包被濃度將決定試紙條產品的檢測靈敏度。制備一系列T線包被濃度不同，因而檢測靈敏度不同的試紙條即可形成具半定量檢測功能的檢測試紙條套裝。本實驗以T線包被量為1. Omg/mL的試紙條顯示產品的靈敏度。將重組His 標簽融合蛋白稀釋至 ΙΟΟμ g/ml、10y g/ml、ly g/ml、100ng/ml、10ng/ mlUng/ml后用本發明產品檢測。結果顯示，當樣品中His標簽融合蛋白含量大于或等于 1 μ g/ml時T線消失。當樣品中His標簽融合蛋白含量小于或等于lOOng/ml時T線出現。C 線在各樣本檢測中均出現，提示檢測試劑工作正常，檢測結果有效。檢測靈敏度約為iyg/ ml。(附圖 6)。6. 3準確率檢測對隨機選取的42個帶有His標簽的大腸桿菌菌液(SDS電泳檢測結果顯示有8個陰性，34個陽性)用該發明成品檢測8個陰性菌液檢測結果均為陰性；32個陽性菌液檢測結果為陽性，2個陽性菌液的檢測結果為陰性，準確率為94%。
權利要求
1.一種利用免疫膠體金技術鑒定樣本中是否存在重組標簽融合蛋白，并可對重組標簽融合蛋白進行半定量檢測的方法。包括實現上述目標的具體方法標簽蛋白單克隆抗體的純化，膠體金試劑與試紙條的制備，具體的檢測方法及檢測結果的判定方法。
2.根據權利要求1的方法，可利用此方法檢測的融合蛋白標簽包括但不限于常用標簽，如，GST標簽、Hi s標簽、c-myc標簽、V5標簽、HA標簽、Trx標簽、GFP標簽，及FLAG標簽寸。
3.根據權利要求1的方法，當使用針對重組表達蛋白自身成份的特異性抗體時，可利用此方法檢測不含標簽的重組蛋白表達情況，包括但不限于在真核重組表達體系和原核表達體系中表達的重組蛋白。
4.根據權利要求1、2、3的方法，在生物醫藥相關研發中對重組蛋白表達進行檢測的應用。
5.根據權利要求1、2、3的方法，在重組蛋白藥物的發酵生產過程中對重組蛋白表達水平的檢測與半定量評估及其它應用。
6.根據權利要求1、2、3的方法在包括但不限于制藥、獸醫、獸藥、食品、飼料、生化與分子生物學試劑等行業的商業和生產領域的應用。
全文摘要
本發明涉及一種快速檢測重組蛋白表達的方法。該方法利用免疫膠體金技術可以方便快捷地檢測樣本中是否存在重組蛋白。本發明可應用于生物醫藥相關科研中重組蛋白的表達實驗，亦可應用于生物制藥企業在重組蛋白藥物的發酵生產過程中對重組蛋白表達水平的頻繁檢測與快速半定量評估。在這些應用中，本發明方法可部分取代常規的SDS凝膠電泳和免疫印記檢測，顯著簡化了檢測程序，縮短了檢測時間并降低了檢測成本。
文檔編號G01N33/531GK102364342SQ20111022345
公開日2012年2月29日 申請日期2011年8月5日 優先權日2011年8月5日
發明者奇日邁勵圖, 王春香, 高建恩 申請人:北京康為世紀生物科技有限公司