刺參itgb基因、編碼蛋白及其克隆方法和重組刺參itgb基因工程菌構建方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于分子生物學W及基因工程領域，尤其是設及一種刺參口GB基因、編碼 蛋白及其克隆方法和重組刺參ITGB基因工程菌構建方法。
【背景技術】
[0002] e-整合素(e-Integrin，ITGB)為親異性細胞粘附分子，主要介導細胞與細胞間的 相互作用及細胞與細胞外基質間的相互作用。幾乎存在于動植物細胞中。功能研究掲示脊 椎動物的整合素發揮著維持機體完整性的功能，并在細胞識別、信號傳導和傳遞，細胞增 殖、分化、成熟、運動、游走的調控，W及炎癥、創傷修復、腫瘤轉移等生理和病理過程中發揮 重要作用。目前，對無脊椎動物整合素（Integrin)的研究主要集中在Integrin在機體早期 發育過程的作用，有關無脊椎動物Integrin參與機體免疫的研究較少。已有的相關研究主 要多集中在Integrin的0-亞基（ITGB)參與的免疫防御反應。Integrin對無脊椎動物的細菌 性疾病有關，Integrin可能通過與細菌上帶有RGD結構域的配體結合，實現機體免疫細胞對 細菌的吞隧和包囊作用，運在某種海洋無脊椎動物中已經被驗證。例如虐蚊的Integrin具 有吞隧大腸桿菌的功能(Ying et al.，2012)，此外，在牡頗Integrin的研究中，病原相關 分子模式(PAMPs)結合分析表明Integrin重組蛋白對脂多糖化PS)有一定的結合活性，對膚 聚糖(PGN)、甘露聚糖(Mannan)結合活性卻明顯偏低。通過與之前牡頗的PAMPs結合實驗對 比，我們發現在相同濃度Integrin與3種內毒素解育的條件下，刺參整合素(AjITGB)對LPS 的結合活性是牡頗結合活性的2倍，顯示了更強的LPS結合活性，而刺參整合素對PGN， Mannan的結合活性也很低，表明了其也有對內毒素結合上的特異性。刺參整合素在PAMPs結 合上的優越性，在刺參病害的防治中更能發揮重要的作用。
[0003] 刺參（Apostichopus japanicus)，是屬于棘皮動物口（Echinodermata)、海參綱 (化Iothuridea)、循手目（AspidocMro化）的重要經濟種類，是一種高蛋白、低脂肪、低糖、 無膽固醇的重要經濟養殖水產動物。但由病原菌引發的疾病嚴重制約了該產業的健康持續 發展。目前對刺參病害的解決辦法主要是發病W后的救治，而無法做到病前的預防和發現， 此類做法的結果往往會對刺參養殖業造成很大的損失，因此，篩選特異性好，結合活性強 的革蘭氏陰性菌結合分子是在必行，同時，通過構建水產動物整合素基因表達工程菌，從而 產生工業化、高產量的刺參整合素，通過向患病刺參的生活環境中添加目的蛋白，在刺參自 身產生整合素的基礎上增加了整合素對陰性致病菌的結合能力，從而提升刺參機體的免疫 力，可W為刺參的發病提供一種解決手段。

【發明內容】

[0004] 本發明所要解決的技術問題是提供一種刺參口GB基因、編碼蛋白及其克隆方法和 重組刺參口 GB基因工程菌構建方法，表達的重組刺參0-整合素蛋白對脂多糖具有更強的結 合活性，對膚聚糖、甘露聚糖結合活性較低。
[0005] 本發明解決上述技術問題所采用的技術方案為： 1、一種刺參口GB基因，該基因具有SEQIDN0.1所示的cDNA序列。
[0006] 2、上述刺參口 GB基因的克隆方法，根據與口 GB基因同源的表達序列標簽EST序列 設計基因特異性引物，采用RACE技術擴增基因全長，具體的步驟如下： (1) 通過對燦爛弧菌誘導刺參血細胞CDNA文庫的表達序列標簽分析，發現了多條編碼 ITGB基因的表達序列標簽序列，選取編碼刺參ITGB部分片段的表達序列標簽克隆； (2) RACE引物設計:根據編碼刺參口 GB部分片段的表達序列標簽克隆設計RACE的巢式 引物：3 '上游特異性引物1 : GG T TCAT TG T CAAAT CGG AG，3 '上游特異性引物2 : GATTACGTCGCTCTGGTCCA，5 ' 下游特異性引物 1: CCAACAATTCTGCAACCTCCG， 5 '下游特異性引物2 : TGCAACAAGGGGCACTTGGAG，擴增3 '接頭引物Adaptors : TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT，擴增5 ' 接頭引物Adapto巧：CATGGCTACATGCTGACAGCCTA ; (3) RACE擴增獲取口 GB基因全長序列，具體步驟如下： a. 總RNA提取:參照上面刺參體腔液收集體腔細胞的方法制備RNA提取液； b. 3'-RACE擴增：將RNA提取液用3'-Full RACE Core Set with PrimeScript? R化Se試劑盒逆轉錄合成擴增3'的模板，W此為模板，使用3'上游特異性引物I和擴增3'接 頭引物進行PCR擴增，取PCR稀釋后的產物1 Ul作為模板，再用3'上游特異性引物2和擴增 3 '接頭引物進行PCR擴增得到3 '端目的條帶； C. 5 ' -RACE擴增:將上述RNA提取液用5 ' -Ful 1 RACE Kit試劑盒逆轉錄合成擴增5 '的模 板，具體合成方法依試劑盒說明書操作，W此為模板，使用5'下游特異性引物1和Adapto巧 進行PCR擴增，取PCR產物稀釋后1 Ul作為模板，再用5'下游特異性引物2和Adapto巧進行 PCR得到5'端目的條帶； d.將上述擴增產物的目的條帶用膠回收試劑盒回收，回收產物與載體PMD18-T連接， 轉化至大腸桿菌Escherichia COli D冊a后，在含有氨節濃度為50 yg/mL的LB(膜蛋白腺 10 g/L、酵母提取物5 g/L、NaCl 10 g/L)平板培養基中培養8-12 h，挑取陽性克隆菌落，進 行RCR驗證并送至上海生物工程有限公司測序，所得結果經DNAMAN軟件分析拼接得刺參 ITGB基因全長序列，其基因序列如SEQIDNO. 1所示。
[0007] 上述RACE擴增反應體系：模板1.0化，10 XPCR緩沖液2.5化，濃度25 mM的MgCl2 2.0化，濃度10 ml的dNTP 2.0化，濃度10測的特異性引物1.0化，濃度10咖的接頭引物 1.0化，濃度抓/化的0麻聚合酶0.2化，超純水：15.3化;擴增條件:94 1：3 111111、94 1： 30 s、60 °C 30 s、72 °C 1 min,共35個循環，最后72 °C延伸 10 min。
[000引3、上述刺參ITGB基因的編碼蛋白，該編碼蛋白具有SEQIDNO.2所示的氨基酸序列。 [0009] 4、利用上述刺參口 GB基因編碼蛋白構建重組刺參口 GB基因工程菌的方法，步驟如 下：（1)設計PCR引物，用分別含有BamH I位點和Not I位點的引物擴增刺參口GB蛋白編碼序 列；（2)將克隆得到的目的基因插入祀T28a(+)載體，獲得重組質粒祀T28a(+)-ITGB; (3)對 重組質粒祀T28a(+)-ITGB進行誘導表達，再進行純化復性即獲得基因工程菌。
[0010] 具體步驟如下： (1) 口 GB基因全長克隆及重組蛋白的構建與表達 a. 總RNA提取:取刺參體腔液制備得到RNA提取液； b. CDNA合成:將上述RNA提取液用CDNA合成試劑盒逆轉錄合成CDNA，然后W合成的CDNA 為模板，用分別含有BamH I位點和Not I位點的引物擴增刺參口GB編碼蛋白，其基因序列如 SEQIDN0.2所示，其中 含BmH I位點口GB上游擴增引物:GGATCCATGGCTGTGAGAACCCAGTT ； 含Not I位點口GB下游擴增引物:GCGGCCGCTCATGTCATGCTGTCAACTAATG ； c. PCR擴增：cDNA1.0化，10XPCR緩沖液2.5化，濃度25mM的MgCl2 2.0化，濃度10 mM的dNTP 2.0化，濃度10咖的上游引物1.0化，濃度10咖的下游引物1.0化，濃度抓Ai L的DNA聚合酶0.2化，超純水：15.3化；擴增條件:94 °C 3 min、94 °C 30 S、60 °C 30 s、72 °C I min,共35個循環，最后72 °C延伸10 min ; d. PC郎日性克隆質粒:擴增反應后，用膠回收試劑盒回收PCR產物，然后回收產物與載體 PMD18-T連接，轉化至大腸桿菌Escherichia COli D冊a后，在含有氨節濃度為50 ug/mL的 LB平板培養基中培養8-12 h，挑取陽性克隆菌落，進行RCR驗證和測序鑒定，得到正確的PCR 陽性克隆質粒； e. 重組質粒:將PCR陽性克隆質粒用B恤巧日Not I限制性內切酶雙酶切，瓊脂糖凝膠電 泳回收分子量在30KDa的目的條帶，與經同樣酶切的pET28a( + )原核表達載體酶切產物連 接，轉化Escherichia COli D冊a,PCR篩選陽性克隆，經測序鑒定獲得編碼框正確的表達載 體祀T28a(+)-ITGB重組質粒； f. 重組蛋白的表達:將陽性重組質粒祀T28a(+)-ITGB轉化到表達宿主化21(肥3)，再接 種到卡那霉素濃度為50 ug/mL的LB培養液中，37 °C、200r/min振蕩培養至菌液ODs日日的值為 0.4-0.6時，加入異丙基-P-D-硫代化喃半乳糖巧使其終濃度為1 mmol/L，37 °C誘導表達3-6 h，收集菌液，經1200化/min離屯、5 min,棄上清液，獲得細菌沉淀物； (2)重組蛋白