一種重組人角質細胞生長因子-2工程菌的發酵方法及發酵培養基的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種重組人角質細胞生長因子?2工程菌的發酵方法，其包括，根據接種重組工程菌后的基礎發酵培養液的OD600值，在發酵過程中依次添加包括葡萄糖和維生素液的第一補料，包括有葡萄糖、胰蛋白胨、酵母提取物和微量金屬元素液的第二補料以及包括有葡萄糖、胰蛋白胨和酵母提取物的第三補料，以滿足重組工程菌不同階段的營養需求，提高其表達人角質細胞生長因子?2的產量。此外，本發明還公開了一種可用于上述重組工程菌進行發酵培養的發酵培養基。CGMCC No.25
【專利說明】
-種重組人角質細胞生長因子-2工程菌的發酵方法及發酵培 養基
技術領域
[0001] 本發明設及工程菌發酵技術領域，具體而言，設及一種重組人角質細胞生長因子- 2工程菌的發酵方法及發酵培養基。
【背景技術】
[0002] 目前，現有的用于生產出人角質細胞生長因子-2化Uman keratino巧te growth factor-2，KGF-2)的大腸桿菌發酵方法主要是W包涵體形式進行生產，該方法雖然能夠形 成高產，但是在包涵體復性和后續純化方面會形成復雜繁瑣的工藝流程，限制了目標蛋白 的規模化生產。目前也有可溶性表達系統用于生產出可溶性的KGF-2,雖然，避開了包涵體 的問題。但是，目標產物KGF-2的產量很低，不足W進行規模化生產。

【發明內容】

[0003] 本發明的目的在于提供一種重組人角質細胞生長因子-2工程菌的發酵方法，該方 法能夠提高重組工程菌表達出更高產量的人角質細胞生長因子-2化GF-2)。
[0004] 本發明的另一目的在于提供一種發酵培養基，重組工程菌在該發酵培養基中進行 發酵培養，能夠表達出更高產量的人角質細胞生長因子-2。
[0005] 本發明解決其技術問題是采用W下技術方案來實現的。
[0006] -種重組人角質細胞生長因子-2工程菌的發酵方法，首先，將能夠表達出人角質 細胞生長因子-2的重組工程菌接種至基礎發酵培養液中，并加入第一補料，于發酵條件下， 進行發酵培養，所述第一補料包括葡萄糖和維生素液;然后，根據基礎發酵培養液的ODsoo值 往基礎發酵培養液中依次添加第二補料W及第=補料，第二補料包括葡萄糖、膜蛋白腺、酵 母提取物和微量金屬元素液，第=補料包括葡萄糖、膜蛋白腺和酵母提取物。
[0007] -種發酵培養基，其包括:基礎發酵培養液W及于發酵培養過程中依次添加在基 礎發酵培養液中的第一補料、第二補料W及第=補料，第一補料包括葡萄糖和維生素液，第 二補料包括葡萄糖、膜蛋白腺、酵母提取物和微量金屬元素液，第=補料包括葡萄糖、膜蛋 白腺和酵母提取物。
[000引本發明提供的重組人角質細胞生長因子-2工程菌的發酵方法及發酵培養基的有 益效果是:根據重組工程菌的生長特性，在發酵的過程中，采用對應基礎發酵培養液不同的 ODsoo值，依次往基礎發酵培養液中添加包括有葡萄糖和維生素液的第一補料，包括有葡萄 糖、膜蛋白腺、酵母提取物和微量金屬元素液的第二補料，W及包括有葡萄糖、膜蛋白腺和 酵母提取物的第=補料的發酵工藝手段，為重組工程菌提供給營養適宜的發酵環境，確保 重組工程菌能夠保持旺盛的活力，高產量地表達出人角質細胞生長因子-2。
【附圖說明】
[0009]為了更清楚地說明本發明實施例的技術方案，下面將對實施例中所需要使用的附 圖作簡單地介紹，應當理解，W下附圖僅示出了本發明的某些實施例，因此不應被看作是對 范圍的限定，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可W根據運 些附圖獲得其他相關的附圖。
[0010] 圖1為本發明實施例1提供的重組表達載體祀T2化的結構圖；
[0011] 圖2為本發明實施例1提供的重組工程菌的生長曲線圖；
[0012] 圖3為本發明實施例1提供的誘導不同時間點KGF-2的凝膠電泳圖；
[0013] 圖4為本發明實施例提供的重組工程菌的生物保藏信息。
【具體實施方式】
[0014] 為使本發明實施例的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將對本發明實施例中 的技術方案進行清楚、完整地描述。實施例中未注明具體條件者，按照常規條件或制造商建 議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可W通過市售購買獲得的常規產 品。
[0015] 下面對本發明實施例的重組人角質細胞生長因子-2工程菌的發酵方法及發酵培 養基進行具體說明。
[0016] 本發明實施例提供的重組人角質細胞生長因子-2工程菌的發酵方法，包括如下步 驟：
[0017] SI:活化菌種
[0018] 1.取冷凍保存的重組工程菌，融化后，將重組工程菌劃線接種至LB固體培養基(含 lOOiig/mL的Kana)，于30~37°C、生長24~48小時至單菌落直徑為2.8~3.2mm。
[0019] 其中，需要說明的是，本發明所用的重組工程菌是指能夠表達出人角質細胞生長 因子-2的重組工程菌，即可稱之為重組人角質細胞生長因子-2工程菌。該重組工程菌可通 過W大腸桿菌如化21、DH5a等細菌作為宿主菌，采用常規方法導入攜帶有KGF-2基因的表達 載體如祀T系列的載體后得到，KGF-2基因編碼人角質細胞生長因子-2。
[0020] 本發明所用重組工程菌（具有Kana抗性），分類命名為Escherichia COli，于2016 年4月25日在位于北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所的中國微生物 菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、保藏，保藏編CGMCC No. 12390。
[0021] 其中，IL的LB固體培養基的制作方法如下，取IOg細菌培養用膜化蛋白腺、5g細菌 培養用酵母提取物、IOg化Cl、15g細菌培養用瓊脂，加入到容器中，加入去離子水完全溶解 溶質定容至1L，于1.034X 105Pa、12^C下蒸汽滅菌20分鐘，待培養基溫度降至5(rC時方可 加入不耐熱的物質，如抗生素，該抗生素的類別對應于重組工程菌含有的重組表達載體的 抗性基因。
[0022] 2.挑取單菌落接種至LB液體培養基（含10化g/mL的Kana)中，于30~37°C、200~ 24化/min條件下，活化培養10~1地直至ODsqq值為0.8~1.2，得到活化培養液。
[0023] 其中，IL的LB液體培養基的制作方法如下，取IOg細菌培養用膜化蛋白腺、5g細菌 培養用酵母提取物、10NaCl、15g細菌培養用瓊脂，加入到容器中，加入去離子水完全溶解溶 質定容至1L，于1.034X 105Pa、12^C下蒸汽滅菌20分鐘，待培養基溫度降至5(rC時方可加 入不耐熱的物質。
[0024] 3.再按1:50的體積比，將活化培養液接種至新鮮的LB液體培養基(含10化g/mL的 Kana)中，于30~37°C、200~24化/min,擴大培養至生長對數期，得到重組工程菌種子液。
[0025] S2:發酵培養，將上述得到的重組工程菌種子液接種至發酵培養基中，其中，發酵 培養基包括基礎發酵培養液W及在發酵過程中依次添加在該基礎發酵培養液中的第一補 料、第二補料W及第=補料。W下結合發酵方法對發酵培養液的成分含量進行說明。
[00%] 1.將上述得到的重組工程菌種子液按1:9~11的體積比接種至基礎發酵培養液 中，并加入包括有葡萄糖和維生素液的第一補料。
[0027]其中，較佳地，上述基礎發酵培養液按每升計包括:膜蛋白腺18~22g、酵母提取物 9~11邑、船(：19~11邑、1(2冊〇4 3.2~3.7邑、皿2口0巧.8~6.2邑^及1邑5〇4 3.2~3.7邑。
[00%]進一步地，上述基礎發酵培養液按每升計包括：膜蛋白腺20g、酵母提取物lOg、 NaCl 10g、K抽P〇4 3.5g、K出P〇4 6.0gW及MgS043.5邑。
[0029] 其中，上述第一補料按每升計包括:葡萄糖48~5?和維生素液9~llmL。較佳地， 第一補料按每升計包括:葡萄糖50g和維生素液lOmL。
[0030] 其中，維生素液按每升計包括:煙酸5.8~6.2g、核黃素 0.40~0.44g、鹽酸化唉醇 1.2~1.6mg、D-泛酸0.28~0.32mg、生物素 0.058 ~0.062mg W 及葉酸0.038 ~0.042mg。進一 步地，維生素液按每升計包括:硫酸銅1.9g、銅酸鋼0.012g、棚酸0.5g，氯化侶0.012g，氯化 鋒0.0144g，氯化鐵0.162g，氯化巧0.006g。
[0031 ] 2.將接種后的基礎發酵培養液于發酵條件下，進行發酵培養。
[0032] 發酵條件具體為:控制發酵溫度30~37°C，優選為32°C;控制基礎發酵培養液的抑 為6.8~7.2，優選地，采用7mol/L氨水或6mol/L肥1調芐基礎發酵培養液抑至6.8~7.2，優 選為抑為7.0;控制基礎發酵培養液中的溶解氧為20~60 %，優選地，控制基礎發酵培養液 中的溶解氧為40%; W及控制通氣量（無菌空氣或空氣與純氧混合的無菌氣體）為0.9~ 1.1VVM，優選為 1.0VVM。
[0033] 3.根據基礎發酵培養液的ODsoo值往基礎發酵培養液中依次添加第二補料W及第 =補料。
[0034] 首先，較佳地，在發酵的過程中，在基礎發酵培養液的ODsoo值為2~6時，往發酵培 養液中添加第二補料。其中，第二補料包括葡萄糖、膜蛋白腺、酵母提取物和微量金屬元素 液。
[0035] 較佳地，第二補料按每升計包括:葡萄糖48~52g、膜蛋白腺38~42g、酵母提取物 18~22g、微量金屬元素液9~llmL。進一步地，第二補料按每升計包括:葡萄糖50g、膜蛋白 腺40g、酵母提取物20g、微量金屬元素液1 OmL。
[0036] 其中，較佳地，微量金屬元素液按每升計包括:硫酸銅1.7~2. Ig、銅酸鋼0.01~ 0.014旨、棚酸0.48~0.52旨，氯化侶0.01~0.014旨，氯化鋒0.0142~0.0146旨，氯化鐵0.16~ 0.164g，氯化巧0.004~0.008g。進一步地，微量金屬元素液按每升計包括:硫酸銅1.9g、銅 酸鋼0.012g、棚酸0.5g，氯化侶0.012g，氯化鋒0.0144g，氯化鐵0.162g，氯化巧0.006g。
[0037] 其次，在發酵的過程中，在基礎發酵培養液的ODsoo值為15~25時，往發酵培養液中 添加第=補料。其中，第=補料包括葡萄糖、膜蛋白腺和酵母提取物。
[0038] 較佳地，第=補料按每升計包括:葡萄糖48~52g、膜蛋白腺48~52g、酵母提取物 18~2地。
[0039] 由于重組工程菌在發酵的過程中，隨著其繁殖的過程中，不斷地消化基礎發酵培 養液的養分。因此，需要不斷地往基礎發酵培養液添加適宜的營養物質。在本發明中，針對 重組工程菌的生長特性，在其不同的生長階段，有差異性地針對性地往基礎發酵培養液中 依次加入第一補料(接種初期加入）、第二補料(基礎發酵培養液的ODsoo值為2~即寸加入）W 及第S補料(基礎發酵培養液的ODsoo值為15~25時加入），去針對性地滿足重組工程菌的各 生長階段的營養需求，確保重組工程菌能夠保持旺盛的生長活力，高產量地表達出人角質 細胞生長因子-2。
[0040] 4.誘導培養，在發酵過程中，往基礎發酵培養液中加入誘導劑，誘導重組工程菌高 產量地表達出KGF-2。
[0041] 優選地，在重組工程菌的生長對數期加入誘導劑，該生長對數期對應的基礎發酵 培養液的ODso日值為2~6,也就是說，在基礎發酵培養液的ODso日值為2~即寸，往基礎發酵培養 液中加入誘導劑。其中，誘導劑為IPTG(異丙基-P-D-硫代半乳糖巧，Isopropyie-D- thiogalactoside)。
[0042] 5.采用現有純化方法，從誘導培養后的基礎發酵培養液提純出KGF-2。
[0043] W下結合實施例對本發明的特征和性能作進一步的詳細描述。
[0044] 實施例1
[0045] 首先，活化菌種
[0046] 1.取冷凍保存的重組工程菌，融化后，將重組工程菌劃線接種至LB固體培養基(含 lOOiig/mL的Kana),于32°C、生長24~48小時至單菌落的大小為3mm左右。該重組工程菌是W 重組表達載體祀T26b(結構如圖1所示)轉化大腸桿菌后得到，其中，pET26b攜帶有編碼人角 質細胞生長因子-2化GF-2)的KGF-2基因。該重組工程菌，分類命名為Escherichia COli，于 2016年4月25日在位于北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所的中國微 生物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、保藏，保藏編CGMCC No. 12390。本實施例所用重 組工程菌的生物保藏信息見圖4。
[0047] 2.挑取單菌落接種至LB液體培養基(含10化g/mL的Kana)中，于32°C、220r/min條 件下，活化培養1化直至ODsqq值為1.0左右，得到活化培養液。
[004引3.再按1:50的體積比，將活化培養液接種至新鮮的LB液體培養基(含10化g/mL的 Kana)中，于32°C、220r/min，擴大培養至生長對數期，得到重組工程菌種子液。
[0049] 需要說明的是，活化菌種的步驟可選擇性地進行，在其他的實施例中，也可W不用 活化菌種，可直接將含有重組工程菌接種發酵培養。
[0050] 接著，發酵培養
[0051 ] 1.將上述得到的重組工程菌種子液W1:10的體積比接種至60L礎發酵培養液的發 酵罐(上海百倫，型號:化BI0-100STA-UIP)中，并加入4.化第一補料。該發酵罐可顯示溶氧、 pH、溫度、攬拌轉速等參數，并帶有蠕動累可進行pH控制和自動補料。
[0052] 其中，較佳地，在本實施例中基礎發酵培養液按每升計包括:膜蛋白腺20g、酵母提 取物 10g、NaCl 10g、K2HP〇4 3.5g、KH2P〇4 6gW及MgS〇4 3.5邑。
[0053] 其中，較佳地，在本實施例中，第一補料按每升計包括：葡萄糖50g和維生素液 lOmL。
[0054] 其中，較佳地，在本實施例中，維生素液每升計包括:硫酸銅1.9g、銅酸鋼0.012g、 棚酸0.5g，氯化侶0.0 l 2g，氯化鋒0.0144g，氯化鐵0.162g，氯化巧0.006g。
[0055] 2.調節發酵條件，進行發酵培養。
[0056] 調節發酵罐的參數，設置發酵條件具體為：
[0057] 通過發酵罐自帶的夾套水浴自動控制發酵溫度度為32°C ;
[005引采用7mol/L氨水調芐基礎發酵培養液pH至7.0，當然，在其他的實施例中，也可W 采用6mol/L的肥1進行調節；
[0059] 通過調節攬拌棒的轉速控制基礎發酵培養液中的溶解氧為40%，當然，在其他的 實施例中溶解氧可W不同；
[0060] 調節發酵罐中通氣量(無菌空氣與純氧混合的無菌氣體)為1VVM，當然，在其他的 實施例中通氣量可W不同。
[0061 ] 3.根據基礎發酵培養液的ODsoo值往基礎發酵培養液中依次添加第二補料W及第 =補料。第二補料和第=補料分兩個階段加入，具體如下。
[0062] (1)、在發酵的過程中，在基礎發酵培養液的ODsoo值為2~6時，往發酵培養液中添 加化第二補料。
[0063] 其中，第二補料包括葡萄糖、膜蛋白腺、酵母提取物和微量金屬元素液。
[0064] 在本實施例中，第二補料按每升計包括：葡萄糖50g、膜蛋白腺40g、酵母提取物 20g、微量金屬元素液1 OmL。
[0065] 在本實施例中，微量金屬元素液按每升計包括:硫酸銅1.9g、銅酸鋼0.012g、棚酸 0.5g，氯化侶0.012g，氯化鋒0.0144g，氯化鐵0.162g，氯化巧0.006g。
[0066] (2)、在加入第二補料后，在發酵的過程中，在基礎發酵培養液的ODsoo值為15~25 時，往發酵培養液中添加化第=補料。
[0067] 其中，第=補料包括葡萄糖、膜蛋白腺和酵母提取物。
[0068] 在本實施例中，第S補料按每升計包括：葡萄糖50g、膜蛋白腺50g、酵母提取物 20邑。
[0069] 需要說明的是，第一補料、第二補料W及第=補料的加入方式均采用緩慢勻速的 流加方式，加入的量可根據實際情況確定。
[0070] 在第一補料加入后，間隔地取基礎發酵培養液，采用紫外分光光度法檢測基礎發 酵培養液ODsoo值，W反映菌體的生長情況，結果如圖2所示。由圖2可知，隨著發酵時間的增 加，基礎發酵培養液的ODsoo值呈幾何指數增加，由此表明菌體的濃度在增加，菌體生長情況 良好。
[0071] 4.誘導培養，在發酵過程中，往基礎發酵培養液中加入誘導劑，誘導重組工程菌高 產量地表達出KGF-2。
[0072] 在重組工程菌的生長對數期加入誘導劑例如IPTG，該生長對數期對應的基礎發酵 培養液的ODso日值為2~6,也就是說，在基礎發酵培養液的ODso日值為2~即寸，往基礎發酵培養 液中加入誘導劑，至基礎發酵培養液的ODsoo值為30~50時，終止發酵。
[0073] 在此步驟中，分別在加誘導劑前、加誘導劑后化、加誘導劑后化、誘導劑化、W及加 誘導劑后地的時間點，取發酵罐中的正在進行發酵的基礎發酵培養液（W下簡稱發酵液）W 提取KGF-2蛋白樣品，進行蛋白凝膠電泳，檢測KGF-2的表達量情況W及其他相關指標如濕 菌量、KGF-2表達量等，結果如圖3所示。
[0074] 由圖3可知（圖中1為蛋白Maker, 2為加誘導劑前、3為加誘導劑后化、4為加誘導劑 后化、5為加誘導劑后化、6為加誘導劑后4h)，在加入誘導劑前，其條帶的顏色較淺，表面單 位發酵液中的KGF-2表達量低，加入誘導劑后，隨著發酵時間的增加，各時間點的條帶顏色 越來越深，表面KGF-2表達量在增加，且在加入誘導劑4h的條帶顏色較深，表明在加入誘導 劑4h后，KGF-2表達量最高，單位發酵液中的KGF-2含量也最多;此外，KGF-2分子量在22KD左 右，與預期的KGF-2分子量大小一致。
[0075] 5.停止發酵后，采用現有提取工藝例如固液分離法、離子交換法等，可從發酵液中 提純出KGF-2。
[0076] 本實施例通過在重組工程菌接種初期加入第一補料、在0D600值為2~6時加入第 二補料，W及在0D600值為15~25時加入第=補料，使得在發酵的過程中基礎發酵培養液中 的菌體濃度得到了大幅度提高(濕菌量達到lOOg/L)，配合對發酵工藝參數(如培養溫度32 °C、溶解氧為40%、pH7.0、誘導4h)的優化，使得表達出的可溶性的人角質細胞生長因子-2 產量也高(5mg/g)，單位發酵液的KGF-2產量達到了 500mg/L。
[0077] 實施例2-實施例6
[0078] 需要說明的是，在實施例2-6中，所采用的發酵方法的原理和步驟與本實施例大致 相同，主要不同的是所用的基礎發酵液W及第一補料、第二補料、第=補料的成分及含量， W及發酵條件，實施例2~6中所用的基礎發酵液W及第一補料、第二補料、第=補料的成分 及含量，W及發酵條件參數如表1和表2所示。此外，還有如下不同點，實施例2沒有沒有采用 誘導劑IPTG進行誘導培養，實施例3~4均采用了誘導劑IPTG進行誘導;實施例2、3、4、5是分 別按體積比1:11、1:9、1:10、1:9的比例將重組工程菌種子液接種至基礎發酵培養液中，實 施例6是直接將重組工程菌直接接種至基礎發酵培養液中，沒有經過菌種活化的步驟。
[0079] 表1.本發明實施例2-6所用發酵培養基的成分含量W及發酵條件參數表
[0080]
[0081] 表2.本發明實施例2-6所用的維生素液和微量金屬元素液的成分含量
[0082]
[0083] 采用實施例2~6的發酵方法，重組工程菌在發酵的過程中，同樣具有較高的菌體 濃度，W及高產量地表達出了KGF-2,其產生的效果與實施例1大致相同。
[0084] 綜上，針對重組工程菌的生長特性，本發明通過在其不同的生長階段，有差異性地 針對性地往基礎發酵培養液中依次在接種初期加入第一補料、在ODsoo值為2~6時加入第二 補料，W及在ODsgg值為15~25時加入第=補料，通過優化基礎發酵培養液的營養成分，針對 性地滿足重組工程菌的各生長階段的營養需求，確保重組工程菌能夠保持旺盛的生長活 力，使得菌體濃度得到大幅度提高(濕菌量達到lOOg/L)，配合對發酵工藝參數(如培養溫度 32°C、溶解氧為40%、pH7.0、誘導4h)的優化，使得表達出的可溶性的人角質細胞生長因子- 2產量也高（5mg/g)，單位發酵液的KGF-2產量達到了 500mg/L，有效地解決了現有發酵工藝 中存在的KGF-2表達產量低無法規模化生產的問題。
[0085] W上所述僅為本發明的優選實施例而已，并不用于限制本發明，對于本領域的技 術人員來說，本發明可W有各種更改和變化。凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修 改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。
【主權項】
1. 一種重組人角質細胞生長因子-2工程菌的發酵方法，其特征在于，其包括： 將能夠表達出人角質細胞生長因子-2的重組工程菌接種至基礎發酵培養液中，并加入 第一補料，于發酵條件下，進行發酵培養，所述第一補料包括葡萄糖和維生素液； 根據所述基礎發酵培養液的〇D_值往所述基礎發酵培養液中依次添加第二補料以及 第三補料，所述第二補料包括葡萄糖、胰蛋白胨、酵母提取物和微量金屬元素液，所述第三 補料包括葡萄糖、胰蛋白胨和酵母提取物。2. 根據權利要求1所述的重組人角質細胞生長因子_2工程菌的發酵方法，其特征在于， 根據所述基礎發酵培養液的〇D_值往所述基礎發酵培養液中依次添加所述第二補料以及 所述第三補料包括： 在所述基礎發酵培養液的〇D_值為2~6時，往所述發酵培養液中添加所述第二補料； 以及 在所述基礎發酵培養液的〇D_值為15~25時，往所述發酵培養液中再添加所述第三補 料。3. 根據權利要求1所述的重組人角質細胞生長因子_2工程菌的發酵方法，其特征在于， 所述發酵條件為:發酵溫度30~35°C、所述基礎發酵培養液的pH為6.8~7.2以及溶解氧為 20~60% 〇4. 根據權利要求1所述的重組人角質細胞生長因子_2工程菌的發酵方法，其特征在于， 所述發酵方法還包括誘導培養，所述誘導培養為:在所述重組工程菌發酵的過程中，在所述 重組工程菌的生長對數期往所述基礎發酵培養液中加入誘導劑，所述誘導劑為IPTG。5. 根據權利要求1所述的重組人角質細胞生長因子_2工程菌的發酵方法，其特征在于， 將所述重組工程菌接種至所述基礎發酵培養液中是將重組工程菌種子液按1:9~11的體積 比接種至所述基礎發酵培養液中。6. 根據權利要求5所述的重組人角質細胞生長因子-2工程菌的發酵方法，其特征在于， 在將所述重組工程菌種子液接種至所述基礎發酵培養液中進行發酵培養之前，所述發酵方 法還包括： 將所述重組工程菌接種至LB固體培養基，于30~37 °C、生長24~48小時至單菌落的直 徑為2.8~3.2mm; 再挑取所述單菌落接種至LB液體培養基中，于30~37°C、200~240r/min條件下，活化 培養10~14h至OD6qq值為0.8~1.2，得到活化培養液;以及 按1:50的體積比，將所述活化培養液接種至LB液體培養基中，于30~37°C、200~240r/ min條件下，擴大培養至生長對數期，得到所述重組工程菌種子液。7. -種發酵培養基，其特征在于，其包括:基礎發酵培養液以及于發酵培養過程中依次 添加在所述基礎發酵培養液中的第一補料、第二補料以及第三補料，所述第一補料包括葡 萄糖和維生素液，所述第二補料包括葡萄糖、胰蛋白胨、酵母提取物和微量金屬元素液，所 述第三補料包括葡萄糖、胰蛋白胨和酵母提取物。8. 根據權利要求7所述的發酵培養基，其特征在于，所述基礎發酵培養液按每升計包 括:胰蛋白胨18~22g、酵母提取物9~llg、NaCl 9~llg、K2HP〇4 3.2~3.7g、KH2P〇4 5.8~ 6.2g&&MgS〇4 3.2~3.7g。9. 根據權利要求7所述的發酵培養基，其特征在于，所述第一補料按每升計包括:葡萄 糖48~52g和所述維生素液9~I ImL，優選地，所述維生素液按每升計包括:煙酸5.8~6.2g、 核黃素〇 · 40~O · 44g、鹽酸吡咳醇1 · 2~1 · 6mg、D_泛酸O · 28~O · 32mg、生物素 O · 058~ 0 · 062mg 以及葉酸 0 · 038 ~0 · 042mg。10.根據權利要求7所述的發酵培養基，其特征在于，所述第二補料按每升計包括:葡萄 糖48~52g、胰蛋白胨38~42g、酵母提取物18~22g和所述微量金屬元素液9~llmL，優選 地，所述微量金屬元素液按每升計包括:硫酸銅1.7~2. Ig、銅酸鈉0.01~0.014g、硼酸0.48 ~0 · 52g，氯化鋁0 · 01~0 · 014g、氯化鋅0 · 0142~0 · 0146g、氯化鐵0 · 16~0 · 164g、氯化鈣 0 · 004~0 · 008g〇
【文檔編號】C12R1/19GK105925647SQ201610481209
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年6月24日
【發明人】賈芳苗
【申請人】成都遠睿生物技術有限公司