一株高乙醇耐受性基因工程菌及其構建方法與應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及一株高乙醇耐受性的基因工程酵母菌及 其構建方法與應用。
【背景技術】
[0002] 能源是現代經濟發展的血液，而目前能源的主體是不可再生的化石資源。隨著現 在經濟的飛速發展，能源消耗越來越大，進而促進經濟發展的化石資源被大量的開采和利 用。然而全球化石資源儲量日益減少，此外，化石資源的開發利用的負面影響非常大，如環 境污染嚴重，全球氣候變暖等。因此，新能源的開發迫在眉睫。用生物質能源替代化石能源 不失為解決能源危機和環境壓力的一種很好的途徑。使用廉價的生物質作為能源，可以有 效的降低石油資源對世界經濟發展的制約和化石能源消耗所造成的環境污染問題，從長遠 戰略上看，生物質能源將成為可再生資源的重要組成部分，是化石能源與新能源之間的過 度。生物燃料是可替代汽油的可再生清潔能源，主要有生物柴油，生物乙醇和生物丁醇。
[0003] 酵母發酵產乙醇是工業發酵生產乙醇的主要途徑之一，而利用細胞表面固定化技 術的生物膜反應器生產乙醇是當前工業上乙醇生產的一種優秀形式。生物膜反應器相比于 傳統的游離發酵的優勢在于其優秀的抗逆性，不僅能夠耐受較高的初糖濃度，并且能在較 高的乙醇產物濃度中生長。這在工業發酵應用上有著重大的意義。傳統游離發酵中，適合發 酵的乙醇濃度一般在10 % (v/v)左右，而在固定化發酵中，酵母菌能在超過15 % (v/v)的乙 醇濃度下生長。生物膜反應器是基于生物膜的應用，研究表明，生物膜的形成能力與乙醇耐 受性有很大的聯系。因此，對生物膜形成的機制研究，及通過基因工程技術構建高乙醇耐受 性的酵母菌株，對于工業乙醇的發酵生產有著重大的意義。

【發明內容】

[0004] 本發明要解決的技術問題是，提供一株高乙醇耐受性的酵母基因工程菌。
[0005] 本發明還要解決的技術問題是，提供上述高乙醇耐受性的酵母基因工程菌的構建 方法。
[0006] 本發明最后要解決的技術問題是，提供上述高乙醇耐受性的酵母基因工程菌在乙 醇發酵中的應用。
[0007] 為解決上述技術問題，提供如下技術方案：
[0008] -株高乙醇耐受性基因工程菌，它是過表達轉錄調控因子鋅指蛋白（Migl)基因的 釀酒酵母菌。鋅指蛋白通過結合粘附素蛋白Floll的啟動子，來調控此粘附素蛋白的轉錄。 粘附素蛋白在生物膜形成中起決定性作用。因此調控鋅指蛋白能夠調控生物膜形成，從而 影響菌株乙醇耐受性。
[0009] 所述的鋅指蛋白Migl基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1中所示，其氨基酸序列如 SEQIDN0:2**。
[0010] 所述的釀酒酵母菌為Saccharomyces cerevisiae S288c〇
[0011] 上述高乙醇耐受性基因工程菌的構建方法，包括如下步驟：
[0012] (1)提取釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae S288c的基因組DNA;
[0013] (2)以步驟（1)得到的該基因組DNA為模板，SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4所示的核 苷酸序列為引物，PCR得Migl基因；
[0014] (3)將SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列克隆到表達質粒pYX-AurR中，得到重組質 粒；
[0015] (4)將步驟（3)得到的重組質粒轉化宿主菌，所述的宿主菌為Saccharomyces cerevisiae S288c，即得到表達轉錄調控因子Migl的基因工程菌。
[0016] 上述高乙醇耐受性基因工程菌在乙醇發酵生產中的應用在本發明的保護范圍之 中。
[0017] 利用上述高乙醇耐受性基因工程菌發酵生產乙醇的方法，包括如下步驟：
[0018] (la)將釀酒酵母接種到培養基中，培養，得到種子液；
[0019] (2a)將步驟(la)中得到的種子液接種到含固定化載體的搖瓶中，固定化長膜；
[0020] (3a)將步驟(2a)中得到的已成膜完全的固定化載體，添加到培養基中，發酵，得乙 醇。
[0021 ]步驟（la)中，所述的培養基，其組成如下：150~200g/L葡萄糖，15-20g/L多聚蛋白 胨，15-20g/L(NH4)2S〇4，10_15g/L酵母提取物，2-3g/L KH2P〇4,2~3g/LMgS〇4.7H20,3〇-50mg/L FeS〇4 · 7H20,30~50mg/L ZnS〇4 · 7H20,溶劑為水。
[0022] 步驟（la)中，所述的培養，其培養溫度為30°C，培養時間為12~18h，轉速為200~ 250rpm〇
[0023] 步驟(2a)中，所述的固定化長膜，其培養溫度為35°C，培養時間為60~72h，轉速為 200~250rpm，每20~24h換一次培養基。
[0024] 步驟(2a)中，所述的固定化載體為棉纖維。
[0025] 步驟(3a)中，所述的發酵，其培養溫度為35°C，培養時間為20~24h，轉速為200~ 250rpm〇
[0026] 有益效果：
[0027]本發明具有如下突出的效果：
[0028] 本發明通過構建重組表達質粒載體pYXAurR-Migl，，獲得釀酒酵母工程菌，與原始 菌株相比提高了乙醇耐受性。在15%濃度的乙醇下固定化發酵過程中，耗糖速率是原始菌 株的1.30倍，提高了生物膜反應器中菌體的乙醇耐受性，能夠更好的用于工業乙醇生產。
【附圖說明】
[0029] 圖 1 pYXAurR-Migl 質粒圖。
【具體實施方式】
[0030] 根據下述實施例，可以更好地理解本發明。然而，本領域的技術人員容易理解，實 施例所描述的內容僅用于說明本發明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本 發明。
[0031] 除非另外指明，以下各實施例中所使用的生物材料、載體、菌株、試劑、試劑盒等均 可通過常規商購途徑獲得，其中涉及的生物基因工程操作技術，如質粒提取、酶切消化、片 段回收、核酸片段與質粒載體連接反應及克隆和篩選等，均為本領域內的常規操作或參照 相應產品的說明書進行操作。
[0032]實施例l:Migl基因表達載體的構建 [0033] (1)釀酒酵母基因組提取：
[0034] 將釀酒酵母接種于YH)液體培養基(YH)培養基組成如下：20g/L蛋白胨，10g/L酵母 提取物和20g/L葡萄糖），30°C培養至對數生長期，使用酵母基因組提取試劑盒(購自北京索 萊寶科技有限公司）提取基因組。
[0035] (2)Migl基因表達載體構建：
[0036] 根據NCBI數據庫中己有釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae S288c中Migl編碼 基因，設計合成了引物Migl-pYX-F和Migl-pYX-R(如SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4所示），以 基因組總DNA為模板進行PCR擴增。
[0037] PCR反應參數為：95°C變性5min;然后95°C變性30sec，65°C退火30sec，72°C延伸 lmin，30個循環后；72°C保溫lOmin。
[0038]得到長度約為1500bp片段，凝膠電泳分離純化此片段并進行膠回收。將膠回收產 物連接到pYX_AurR(SEQ ID N0:7)，連接產物轉化采用氯化鈣法制備的大腸桿菌DH5a感受 態細胞，涂布于氨芐抗性平板。
[0039]挑取LB平板上的單菌落，接種到裝有5mLLB液體培養基的2 OmL試管中，3 0 °C， 220rpm下培養12小時。利用質粒提取試劑盒(購自上海申能博彩生物科技有限公司）提取質 粒，并委托金唯智科技(南京)有限公司測序，測得序列長度為2550bp，其核酸序列見SEQ ID