γ-聚谷氨酸產生菌及生產γ-聚谷氨酸有機肥的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一株γ-聚谷氨酸產生菌，具體涉及一種γ-聚谷氨酸產生菌和一種 纖維素降解菌及利用該菌株混合發酵生產保水保肥有機肥的方法，屬于微生物發酵工程領 域。
【背景技術】
[0002] 我國是農業大國，又是水資源缺乏的國家，干旱、半干旱地區約占國土面積的一半 以上，干旱是限制我國農業增收的重要因子，由此造成的損失位于各種自然災害之首。為保 證我國農業豐收，需要進行適當地灌溉，但是我國水資源嚴重不足，而且分布不均，南多北 少，夏多冬少。目前多采用漫灌的方式，浪費嚴重；灌溉之后，大部分水及肥料蒸發或流失， 不能起到預期的作用；同時大量肥料流失必然導致施肥過量問題，既加劇了農業面源污染， 又浪費了大量資源；過度施肥還導致了農田生態系統遭到破壞，土壤有機質下降，團粒結構 性能降低，土壤板結現象加劇，保肥保水能力降低，大量微生物死亡，土壤微生物群落結構 發生變化，許多有益微生物從優勢種群變為次要種群，作物易發生各類病害，同時肥料的利 用率較低，農產品品質下降，生產成本增加。
[0003] 多年來，為了提高肥料和水分的利用效率，人們對肥料和水分的增效因子進行了 大量的研究。其中具有水溶性高、吸附性強、生物相容性好，無毒、無害、無殘留，能促進作 物養分吸收的保水保肥劑受到國內外學者的重視，已研制出上百種保水保肥劑。在土壤中 添加一定量的保水保肥劑，不僅可以改善土壤的保水性能，節約灌溉用水，同時保水保肥劑 與土壤混合可以改善土壤的團粒結構，使土壤變得松軟透氣，并能與土壤中的氮、磷、鉀等 營養元素和各種微量元素結合，減少養分流失，減少化肥使用量，增強農作物的抗病能力。 γ-聚谷氨酸（γ-polyglutamicacid，γ-PGA)是由D-谷氨酸或L-谷氨酸通過α-氨基 和γ-羧基間的酰胺鍵結合而成的，是某些桿菌（Bacillus)合成的一種胞外水溶性的高分 子氨基酸聚合物。γ-PGA具有優良的水溶性、超強的吸附性和生物可降解性，降解產物為天 然無公害的谷氨酸，是一種優良的環保型高分子材料，γ-聚谷氨酸既可以進一步增加作物 的產量，還可以對肥料和水分起到很好的緩釋作用，具有顯著的保水保肥、增產節肥效果。
[0004] 目前γ-PGA的制備主要是生物發酵法，即通過培養生產聚谷氨酸的菌種 得到產品。目前國內外用于研究γ-聚谷氨酸生產的典型菌株主要是Bacillus licheniformisATCC9945a和BacillussubtilisIF03335 等，發酵生產工藝通常有液體發 酵和固體發酵兩種。目前，γ-聚谷氨酸發酵工藝以液體深層發酵為主，但是仍然存在生產 周期較長，生產效率低下，生產成本較高的等問題。如李培培等（公開號CN104017760Α) 分離得到一株地衣芽孢桿菌BacilluslicheniformisDou-6,其底物谷氨酸轉化率僅為 60%。相比較于液體發酵而言，固體發酵擁有耗能低、設備簡易、成本低、產生廢棄物少、原 料來源廣泛等優勢，故常用于有機肥、飼料、釀酒等微生物發酵工業生產當中。另一方面， 規模化養殖產生畜禽糞便以及農業種植產生的秸桿等農業廢棄物隨地棄置，不僅引起了嚴 重的面源污染，也極大浪費了大量的養分資源（C、N、P、K、S及微量元素）。目前，以農業 廢棄物固態發酵生產γ-聚谷氨酸有機肥的研究也有陸續報道，如CN102674986公開了 一種"具有保水保肥作用的生物有機肥及其制備方法"，該方法是利用單一芽孢桿菌菌株 以人畜糞便、生活垃圾或植物秸桿中進行γ-聚谷氨酸有機肥生產。CN101417894公開了 "一種含γ-聚谷氨酸的肥料添加劑的生產方法"，該方法用單一枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)PGA-7CCTCCΜ206102為發酵菌株，以氨基酸發酵廢液、豆柏、花生餅粉、麩皮、稻 草粉等為主要發酵基料進行固體發酵生產含γ-聚谷氨酸的肥料添加劑。
[0005] 綜上所述，γ-聚谷氨酸有機肥生產大都停留在以γ-聚谷氨酸單菌株發酵為主， 且γ-聚谷氨酸的產率較低，因此亟需開發一種γ-聚谷氨酸的產率高的新菌株和利用此 菌株高產生產γ-聚谷氨酸有機肥的方法。

【發明內容】

[0006] 本發明的目的是提供一株γ-聚谷氨酸產生菌，經鑒定為芽孢桿菌（Bacillus sp.)J3CGMCCNo. 11582,該菌株能夠在谷氨酸底物濃度較低條件下單獨或與一株纖維素降 解菌混合發酵高產γ-PGA。
[0007] 為實現上述目的，本發明采用以下技術方案：
[0008] 從土壤樣品中篩選得到一株芽孢桿菌（Bacillussp. )J3,該菌株保藏于中國微生 物菌種保藏委員會普通微生物中心（CGMCC)，保藏單位地址：北京市朝陽區北辰西路1號院 3號，中國科學院微生物研究所，郵編：100101，保藏編號為：CGMCCNo. 11582,保藏日期為： 2015年11月5日。該菌性狀特征如下：
[0009] (1)形態特征
[0010] 在蛋白胨瓊脂培養基上營養細胞為0. 6~1.OX1. 2~2. 5μπι大小的桿菌，37°C培養3~5天形成芽孢，芽孢大小0. 6~0. 9X1. 0~1. 5μm，為長圓形或圓柱形。
[0011] ⑵培養性質
[0012] 牛肉膏、葡萄糖、瓊脂培養基平板培養：30~40°C培養1天可大量生長，菌落表面 凸起，光滑無褶皺，菌落透明，邊緣呈規則圓形，菌落粘性大，挑起有絲狀。
[0013] -株纖維素降解菌--高溫單孢菌屬（Thermomonosporasp. )GC，從猜桿堆肥樣 品中分離篩選得到，該菌株保藏于中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心，保藏單位 地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編：100101，保藏編 號為：CGMCCNo. 1364,保藏日期為：2005年4月28日。
[0014] 本發明的另一個目的是提供一種生產γ-聚谷氨酸的方法以及利用農業廢棄物 進行固態混合發酵生產γ-聚谷氨酸保水保肥有機肥的方法，即以農業廢棄物為基質，利 用γ-聚谷氨酸產生菌和纖維素降解菌混合發酵生產保水保肥有機肥的方法，利用該有機 肥可提高土壤對水分和肥料的吸附性能，提升土壤持水能力及水肥利用率，減少施肥量和 灌溉量，減輕農業面源污染，降低農業生產成本，以達到農業的可持續發展。制備方法如 下：
[0015] (1)所用菌株為芽孢桿菌J3和高溫單孢菌GC，高溫單孢菌GC從中國微生物菌種 保藏委員會普通微生物中心購買獲得；
[0016] ⑵培養基
[0017] 1)活化培養基
[0018] 芽孢桿菌J3活化培養基（牛肉膏蛋白胨培養基）：牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g，瓊脂 18 ~20g，補水至 1000mL，pH7· 0 ~7· 4;
[0019] 高溫單孢菌GC活化培養基（高氏一號培養基）：可溶性淀粉20g、酵母粉2g、葡萄 糖 5g、KN03lg、Κ2ΗΡ040· 5g、MgS04 · 7H20 0· 5g、NaCl0· 5g、FeS04 · 7H20 0·Olg、瓊脂 18 ~ 2〇g、補水至l〇〇〇mL，ρΗ7· 2 ~7· 6 ;
[0020] 將芽孢桿菌J3和高溫單孢菌GC分別接入滅菌（121°C，30min)處理的牛肉膏蛋白 胨和高氏一號斜面培養基中活化備用；
[0021] 2)液體培養
[0022] 將牛肉膏蛋白胨液體培養基和高氏一號液體培養基高溫滅菌（121°C，30min)處 理后，將步驟1)活化好的芽孢桿菌J3和高溫單孢菌GC分別接入牛肉膏蛋白胨液體培養基 和高氏一號液體培養基中，35°C、150r/min振蕩培養28h和50h;
[0023] 3)固體混合發酵培養基：向農業廢棄物發酵基質中添加尿素或者調整基質中秸 桿與糞便比例，使基質中碳氮的摩爾比為15~35 :1;再按質量比添加谷氨酸鈉0.5~ 2. 0%，葡萄糖或蔗糖1~3%，Κ2ΗΡ040· 1~1%，MgS04 · 7H20 0· 01~0· 1%，將谷氨酸鈉、 葡萄糖或蔗糖、K2HP04、MgS04 · 7H20混合溶于水中噴灑于上述基質中，調節發酵基質含水率 為50~65%，pH值7. 0~8. 0,并攪拌均勻配成固體混合發酵培養基；
[0024] (3)混合菌接種體積比
[0025] 芽孢桿菌J3 :高溫單孢菌GC= 1~3 :5~10;
[0026] (4)將步驟（3)得到的混合菌種子液按照固體培養基總質量的0.1~2%的接 種量接入滅菌固體混合發酵培養基中，30~37 °C通氣培養20~40d，停止發酵，即得含 γ-PGA保水保肥有機肥。
[0027] 本發明對液體培養基進行了改進，改進后的牛肉膏蛋白胨液體培養基和高氏 一號液體培養基的配方分別為：改進后的牛肉膏蛋白胨液體培養基配方：牛肉膏5g、蛋 白胨10g、葡萄糖5g、NaCl5g，補水至1000mL，pH7. 0~7. 4;改進后的高氏一號液體 培養基配方：可溶性淀粉15g、酵母粉2g、葡萄糖10g、KN03lg、KH2P040 . 5g、K2HP040 . 5g、 MgS04 · 7H200. 5g、NaCl0· 5g、FeS0