一種轉移介質中重金屬離子的工程菌構建方法及其應用
【專利摘要】一種轉移介質中重金屬離子的工程菌構建方法及其應用，屬于生物化工技術領域。該方法包括以下工藝步驟：1）從銅綠微囊藻提取總DNA；2）以銅綠微囊藻總DNA為模版通過PCR擴增出vWA基因，所述的vWA基因的核苷酸序列為SEQ ID NO.1所示；3）將擴增出的vWA基因與宿主質粒連接，構建重組載體；4）將重組載體轉化大腸桿菌菌株BL21（DE3），獲得基因工程菌。本發明得到的基因工程菌具有顯著吸收或轉移重金屬離子效果，本發明在構建時采用廉價的大腸桿菌，不僅為治理環境中重金屬污染提供了新的思路，而且為治理環境中重金屬污染大大降低了成本。
【專利說明】
一種轉移介質中重金屬離子的工程菌構建方法及其應用
技術領域
[0001]本發明屬于生物化工技術領域，具體涉及一種轉移介質中重金屬離子的工程菌構建方法及其應用。
【背景技術】
[0002]大腸桿菌作為第一個可用于工業化大量生產的菌株，憑借其結構簡單，遺傳學背景清晰，容易培養，生長速度快，目標基因水平高，培養周期短，抗污染能力強的優點，是目前最為常用的原核表達系統。隨著生物技術的發展和基因工程的完善，越累越多的領域利用大腸桿菌建造基因工程菌解決問題。
[0003]vWA蛋白，包括252個氨基酸殘基，分子量約為30.2kD，從銅綠微囊藻中克隆獲得，數據庫對蛋白結構進行分析也顯示某結構域中的MIDRS位點參與陽離子膜轉運。另外在動物細胞體內，vWA蛋白也被證實可通過刺激細胞中鈣離子通道來增強鈣離子的運輸。
[0004]重金屬污染指由重金屬及其化合物造成的環境污染。主要由采礦、廢氣排放、污水灌溉和使用重金屬超標制品等人為因素所致。因具有毒性、易通過食物鏈在植物，動物和人體內累積，對生態環境和人體健康構成嚴重威脅。特別是隨著我國工業和城市化的不斷發展，工業和生活廢水排放、污水灌溉、汽車廢氣排放等造成的土壤重金屬污染問題每況日下。
[0005]目前，重金屬污染的治理方法主要有化學治理法、工程治理法、生物治理法、農業治理法，治污效果參差不齊。另外，穩定固化法是相對更為有效且環保的措施，利用重金屬穩化劑中的粒子吸附部分重金屬離子，吸附后的重金屬離子與穩固劑發生離子交換反應被穩固劑所固定，進一步通過非結晶及低結晶礦物的高度結晶化，使重金屬成為礦物中的微量成分。產生的結晶物質可通過再結晶過程及粒子之間生成交錯的晶體，形成強結構的固化網，將固化的重金屬進一步封固在固化網內。此類方法治理范圍較廣泛，但相對治理費用較貴。對于我國大量的污染現狀可行性有待提高。
【發明內容】
[0006]針對現有技術存在的問題，本發明的目的在于設計提供一種轉移介質中重金屬離子的工程菌構建方法及其應用的技術方案。
[0007]所述的一種轉移介質中重金屬離子的工程菌構建方法，其特征在于包括以下工藝步驟:
1)從銅綠微囊藻提取總DNA;
2)以銅綠微囊藻總DNA為模版通過PCR擴增出vWA基因，所述的vWA基因的核苷酸序列為SEQ ID N0.1 所示；
3)將擴增出的vWA基因與宿主質粒連接，構建重組載體；
4)將重組載體轉化大腸桿菌菌株BL21(DE3)，獲得基因工程菌。
[0008]所述的一種轉移介質中重金屬離子的工程菌構建方法，其特征在于所述的步驟2)中利用特異性引物進行PCR擴增，特異性引物上游引物的核苷酸序列為SEQ ID N0.2所示，下游引物的核苷酸序列為SEQ ID N0.3所示。
[0009]所述的一種轉移介質中重金屬離子的工程菌構建方法，其特征在于所述的步驟2)宿主質粒為pET28a。
[0010]所述的基因工程菌在重金屬污染治理中的應用。
[0011]所述的基因工程菌在吸收或轉移重金屬離子中的應用。
[0012]vWA蛋白在吸收或轉移重金屬離子中的應用，所述的vWA蛋白的氨基酸序列如SEQID N0.4 所示。
[0013]本發明得到的基因工程菌具有顯著吸收或轉移重金屬離子效果，本發明在構建時采用廉價的大腸桿菌，不僅為治理環境中重金屬污染提供了新的思路，而且為治理環境中重金屬污染大大降低了成本。
【附圖說明】
[0014]圖1為重組質粒pET-28b-W^的酶切結果分析;M:marker;l:重組質粒pET-28b-VWA\
圖2為親和層析后目的蛋白SDS-PAGE圖。
【具體實施方式】
[0015]下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護范圍并不僅限于此。
[0016]實施例1:
一、獲得vWA基因的編碼區DNA片段
銅綠微囊藻總DNA提取采用一管式植物DNA提取試劑盒(上海生工)進行:取OD68q為0.1的銅綠微囊藻150mL，7000rmp離心lOmin，棄上清，用液氮研磨后，加入提取液按照說明書提取總DNA。銅綠微囊藻vWA基因擴增的正向引物為:ggatccATGTATCAAGAACTACTGAGTA;反向引物為:gcggccgcGCGTAATGCTCCTTGAGAAC;PCR產物經電泳后進行凝膠回收，回收產物克隆至PMD18-T(上海生工)載體進行測序。
[0017]擴增得到的核苷酸序列如下(SEQID N0.1所示): ATGTATCAAGAACTACTGAGTAGCGCCAAGCCTGGATTTATCCTGATTATGATTGATCAGTCAGCTTCAATGT
CAGATAAATACGCTAATTCAAATAAAGCAGAGTTTGCCGCATTAGCCGTTAATCGAGTCATCGGAGAAATTATTACA
GCTTGTTCATCGGGTAATGAGATTAAAGACAGATGTTTTGTGGCGGTGGTTGGCTATGGAGCAAGTATTAGTATACT
ATTTCTAGACAAAGCCTCAGAGTTGGCTAAAAATCCCAATACAACAACCCTTAAGAGAAAAGTCTCTGATGGTGCAG
GTGGGTTGGTTGAAGTGGATGAAGTAATGCGAGTGTTTGTGAAACCGACTGCAAGTAATGGAACACCAATGGCTGAA
GCCTTTAAACAGGCTTATACTGGGGTAGAAAAATTTATTTCTAATCATCCCGATAGTTTTCCACCCGTTGTTATTAA
TATAACCGATGGAGAACCTAATGATTCTAGTGCTGCTACTACTGAAGCGAAAAAACTAGCACAACTTAAAACAAGTG
ACGGTAACGTGATTGTTTTGAATGCTCATATTTCTAACGCATCAGCAGGGAAAATAGAGTTACCTAGTGATAATGCT
GGTTTTAGCAATAATAAATTTGCTAACTTTTTGTTTGATATTTCCAGTGTGCTTCCTGATCCTCTTGCTGAGAGTGC
CAAAAATGCGGGTTTTAATGTTCAACCTAATGCCAGAGGTTTTATCTTTAATGCTGATGCTGAAGCACTGATTAAAC
TTCTTCAATTTGGTTCTCAAGGAGCATTACGCTAAo
[0018]其編碼的氨基酸序列如下(SEQ ID從).4所示): MYQELLSSAKPGFILIMIDQSASMSDKYANSNKAEFAALAVNRVIGEIITACSSGNEIKDRCFVAVVGYGASI
SILFLDKASELAKNPNTTTLKRKVSDGAGGLVEVDEVMRVFVKPTASNGTPMAEAFKQAYTGVEKFISNHPDSFPPV
VINITDGEPNDSSAATTEAKKLAQLKTSDGNVIVLNAHISNASAGKIELPSDNAGFSNNKFANFLFDISSVLPDPLA
ESAKNAGFNVQPNARGFIFNADAEALIKLLQFGSQGALR。
[0019]二、構建含有目的基因的大腸桿菌重組表達載體pET-28a_
測序正確的PMD18-T-載體和pET28b(Novagen)分別經限制性內切酶頂每切后，連接，將目的基因片段(vWA)插入pET28b，構建pET28b- Wfd載體，獲得目標基因融合有His-tag的重組表達載體。pET28b-W^經過測序驗證后轉入大腸桿菌菌株BL2UDE3)進行重組蛋白(vWA)的功能研究。
[0020]三、重組質粒轉化大腸桿菌菌株BL2UDE3)，獲得基因工程菌
(1)菌株的活化及擴大培養
LB液體培養基配制:胰蛋白胨1g，酵母提取物5g，氯化鈉1g，蒸饋水1000 mL。
[0021 ] LB平板即LB固體培養基為LB液體培養基添加15g/L瓊脂。
[0022]取于-70°C保存的大腸桿菌BL2UDE3)菌種，用滅菌牙簽沾取冰渣，劃線于LB平板(LB液體培養基+15g/L瓊脂)上，于37°C培養箱培養16小時。用滅菌牙簽挑取單菌落放入含5 mL LB液體培養基的試管中，于30°C搖床(轉速200 r/min)培養12小時。取500yL試管中菌液，轉入含50 mL LB液體培養基的錐形瓶中，37°C搖床(轉速200 r/min)培養3小時，此時OD60Q=0.4 左右。
(2)感受態細胞的制備
培養液冰浴10分鐘，將90 mL培養液轉入2支50ml離心管中，4°C ,4500 r/min下離心5分鐘，棄上清液。用30 mL 0.1 mol/L CaCl2溶液溫和吸打懸浮沉淀，4°C，4500 r/min下離心3分鐘，棄上清液。用10 mL 0.1 mol/L CaCl2溶液溫和吸打懸浮沉淀，冰浴30分鐘，4°C，4000r/min下離心3分鐘，棄上清液。用2 mL 0.1 mol/L CaCb溶液溫和吸打懸浮沉淀，即制成感受態細胞。
(3)感受態細胞的轉化
取感受態細胞菌液50yL，加入IyL含有目的基因的質粒pET28b- vWA，輕輕吸打混勻，冰浴20分鐘。42 °C熱擊60秒，迅速置于冰上2分鐘。加入LB液體培養基200yL，37 °C培養箱培養I小時。取培養后的菌液200yL，涂布于含卡那霉素的LB平板(卡那霉素含量50yg/mL)，37°C培養箱培養12小時。
[0023]
四、重組蛋白分離純化
2XYT培養基配制:蛋白胨16 g，酵母提取物10 g，NaCl 5 g，蒸餾水100mL，pH 7.0。
[0024]含重組質粒以及空質粒的表達菌株BL2UDE3)在37°C活化培養后，挑取單菌落轉入含5 mL 2XYT培養基(含卡那霉素50yg/mL)中37 °(:振蕩培養12 h，取菌液500 yL加入到含50 mL 2 XYT培養基(含卡那霉素50 yg/mL)中，37 °C搖床(轉速200 r/min)培養0D600至0.4，加入IPTG(0.50 mmol/L)誘導，20 °(:誘導培養0D600至1.0。離心收集菌體，保留上清液用于檢測。菌體沉淀加入BugBuster protein extract1n reagent(Merck公司)進行溫和吸打懸浮，室溫孵育20 min后于4°C、14 000 r/min離心20 min，上清液和沉淀分別保存備用。
[0025]經SDS-PAGE電泳檢測確定目標蛋白所在的組分后，上清液采用His bindpurificat1n kit(Merck公司)進行N1-NTA Resin親和柱層析，方法按照說明書進行。重組蛋白由唑洗脫后在4 °(:條件下，10 mmol/L磷酸緩沖液PBS(pH 7.0)中進行透析，更換磷酸緩沖液4次，共透析16 h以除去咪唑和NaCl等成分，透析后的蛋白經Bradford法定量后進行電泳分析，電泳圖中可以觀察到重組蛋白目的條帶(圖2)。上清液中蛋白來自于細胞內部，同時表明了目標蛋白主要是胞內的可溶性表達。可以看出利用N1-NTA Resin能成功純化出重組目標蛋白，目標帶相對較純，這說明his-tag能有效的與鎳柱結合，達到高效分離純化轉移重金屬離子蛋白的目的。
[0026]結果顯示，0.1 mmol/L IPTG能顯著誘導重組蛋白的產生，大于此濃度后，對蛋白表達量的誘導效果不大，因此采取濃度為0.1 mmol/L的IPTG進行重組蛋白誘導。而在溫度37°C條件下培養，誘導的蛋白可溶性明顯增大，包涵體含量降低。
[0027]
實施例2:
一:感受態大腸桿菌重金屬暴露
感受態大腸桿菌菌株及對照組大腸桿菌，分別暴露在重金屬環境中(460 nM AgNPs/460 nM CuS04)，4小時后取樣，利用ICP-MS(Agilent 7500a, USA)檢測環境中以及大腸桿菌體內的金屬含量。
[0028]二:環境內金屬離子的檢測
AgNPs暴露下，對照組中AgNPs濃度約是感受態大腸桿菌培環境的1.23倍；同樣，CuSO4暴露下，對照組中AgNPs濃度約是感受態大腸桿菌環境的3.93倍。
[0029]三:大腸桿菌體內金屬離子的檢測
AgNPs 暴露下，對照組 BL-21 (VWAQH)的體內 AgNPs 濃度為 0.46 ± 0.06 ng/(109 cells),感受態大腸桿菌BL-21 (VWAQH-1PTG)體內AgNPs濃度為0.56±0.06ng/(109 cells)，是對照組的1.12倍；同樣，CuSO4暴露下，對照組的體內CuSO4濃度為1.4±0.07ng/(19Cells)，感受態大腸桿菌體內CuSO4濃度為7.81 ±2.30ng/(19 cells),是對照組的5.58倍。
[0030]實施例2說明本發明得到的基因工程菌具有顯著吸收或轉移重金屬離子效果，能夠應用于重金屬污染治理。
【主權項】
1.一種轉移介質中重金屬離子的工程菌構建方法，其特征在于包括以下工藝步驟: I)從銅綠微囊藻提取總DNA; 2 )以銅綠微囊藻總DNA為模版通過PCR擴增出vWA基因，所述的vWA基因的核苷酸序列為SEQ ID N0.1 所示； 3)將擴增出的vWA基因與宿主質粒連接，構建重組載體； 4)將重組載體轉化大腸桿菌菌株BL21 (DE3 )，獲得基因工程菌。2.如權利要求1所述的一種轉移介質中重金屬離子的工程菌構建方法，其特征在于所述的步驟2)中利用特異性引物進行PCR擴增，特異性引物上游引物的核苷酸序列為SEQ IDN0.2所示，下游引物的核苷酸序列為SEQ ID N0.3所示。3.如權利要求1所述的一種轉移介質中重金屬離子的工程菌構建方法，其特征在于所述的步驟2)宿主質粒為pET28a。4.通過權利要求1構建的基因工程菌在重金屬污染治理中的應用。5.通過權利要求1構建的基因工程菌在吸收或轉移重金屬離子中的應用。6.vWA蛋白在吸收或轉移重金屬離子中的應用，所述的vWA蛋白的氨基酸序列如SEQIDN0.4所示。
【文檔編號】C12N15/31GK105907767SQ201610291594
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年5月5日
【發明人】錢海豐, 陳思, 朱錕
【申請人】浙江工業大學