一種丁酸產量低且丁醇產量高的工程菌及其構建方法與應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種丁酸產量低且丁醇產量高的工程菌及其 構建方法與應用。
【背景技術】
[0002] 能源與環境是當今社會關注的焦點。隨著化石能源的日漸枯竭和自然環境的污 染，人類對可再生能源的需求越來越強烈。利用微生物轉化或發酵可再生資源高效生產可 再生能源是今后的能源發展趨勢，這種通過生物法生產化學品的方式是可持續的且環境友 好的。
[0003] 丁醇是一種重要的化工品和原料，可直接用作有機溶劑，是合成多種酯類化合物 的前體，廣泛應用于各種塑料和橡膠制品中。同時，丁醇也是優良的可替代汽油的生物燃 料。它具有和汽油相當的熱值與辛烷值，可與汽油以任意比例混合;在運輸過程中，不易腐 蝕管道;與乙醇相比，其蒸汽壓低，安全性高，因此是一種極具潛力的新型生物燃料。目前， 丁醇的年市場需求大約在百萬噸級別。
[0004] 丁醇可由生物合成是巴斯德于1861年首次發現的，1912年，魏茲曼(Weizmann)發 現了一種梭菌Clostridium acetobutylicum(丙酮丁醇梭菌)能夠將淀粉轉化為丙酮、丁醇 及乙醇。之后，很多研究便集中于改造丙酮丁醇梭菌，以期得到可用于工業化生產丁醇的工 程菌株。但是，丙酮丁醇梭菌是一種嚴格厭氧生長的革蘭氏陽性細菌，其遺傳操作系統復 雜，不利于進行實驗室的研究和工業的生產。2008年，Shota Atsumi,James C.Liao等首先 在大腸桿菌中實現了丁醇的合成（Atsumi S，Cann A F，Connor M R，et al .Metabolic engineering of Escherichia coli for 1-butanol production.Metabolic engineering ,2008,10(6) :305-311 ·)，該研究組將丙酮丁醇梭菌體內的丁醇合成途徑轉移 至大腸桿菌內，致使其可產生少量丁醇。隨后，該研究組對整條途徑進行了優化，將以NADH 為還原力，催化可逆反應巴豆酰輔酶A生成丁酰輔酶A的丁酰輔酶A脫氫酶復合物（Bcd-EtfAB complex)替換為來自齒垢密螺旋體(Treponema denticola)的催化不可逆反應的反 式烯酰輔酶A還原酶(Ter);催化乙酰輔酶A生成乙酰乙酰輔酶A的酶，由乙酰乙酰輔酶A硫解 酶(Th 1)換為大腸桿菌中活性更強的乙酰輔酶A乙酰轉移酶(AtoB)，由此形成了NADH和乙酰 輔酶A的驅動力，丁醇產量大幅度提高。
[0005] 雖然，大腸桿菌可以通過梭菌的丁醇途徑生產丁醇，但是，該過程往往伴隨著一系 列副產物的產生，丁酸是其中占比例較大的副產物之一。

【發明內容】

[0006] 本發明的一個目的是提供一種構建重組菌的方法。
[0007] 本發明提供的方法，為抑制或沉默生產丁醇的出發菌基因組上的硫酯酶基因 yciA 表達，得到重組菌。
[0008] 上述方法中，所述抑制或沉默生產丁醇的出發菌基因組上的硫酯酶基因 yciA表達 為敲除生產丁醇的出發菌基因組上的硫酯酶基因 yciA。
[0009] 上述方法中，所述敲除生產丁醇的出發菌基因組上的硫酯酶基因 yciA基因采用λ-r ed同源重組系統、sacB基因介導篩選的同源重組系統或CRI SPR/Cas系統。
[0010] 上述方法中，所述敲除生產丁醇的出發菌基因組上的硫酯酶基因 yciA基因為采用 λ-red同源重組系統將生產丁醇的出發菌基因組上的硫酯酶基因 yciA基因替換為FRT;
[0011]或所述敲除生產丁醇的出發菌基因組上的硫酯酶基因 yciA基因為采用λ-red同源 重組系統將生產丁醇的出發菌基因組上的硫酯酶基因 yciA基因替換為兩端帶有FRT的標記 基因；
[0012] 所述FRT的核苷酸序列為序列17第59-106位。
[0013] 上述方法中，所述標記基因為卡那霉素抗性基因；
[0014] 所述兩端帶有FRT的標記基因片段的核苷酸序列為序列表中序列17第4H534位。
[0015] 上述方法中，所述生產丁醇的出發菌為大腸桿菌，所述大腸桿菌為將丙酮丁醇梭 菌體內的丁醇合成途徑轉移至出發大腸桿菌得到的菌；
[0016] 所述大腸桿菌具體為EB228CGMCC No. 11986;
[0017] 所述出發大腸桿菌具體為大腸桿菌BW25113。
[0018] 上述方法中，所述硫酯酶的氨基酸序列為序列21;
[0019] 所述硫酯酶yciA基因的核苷酸序列具體為序列7。
[0020] 上述方法中，所述將生產丁醇的出發菌基因組上的硫酯酶基因 yciA基因替換為 FRT的方法包括如下步驟：
[0021] 1)將含有硫酯酶基因 yciA的上游同源臂、抗性基因和硫酯酶基因 yciA的下游同源 臂的同源DNA分子導入EB228(pKD46)，得到yciA替換為兩端帶有FRT的卡那霉素抗性基因片 段的中間菌；
[0022] 所述含有硫酯酶基因 yciA的上游同源臂、抗性基因和硫酯酶基因 yciA的下游同源 臂的同源DNA分子的核苷酸序列為序列17;
[0023] 所述EB228 (pKD46)為將質粒pKD46導入EB228中得到的菌；
[0024] 2)將質粒pCP20轉入所述中間菌，使所述pCP20質粒上的FRT替換了中間菌中的卡 那霉素抗性基因，得到去除卡那霉素抗性基因的中間菌；
[0025] 3)將所述去除卡那霉素抗性基因的中間菌先在37°C培養去除了溫敏質粒pCP20和 PKD46，得到去除溫敏質粒的中間菌；
[0026] 4)將所述去除溫敏質粒的中間菌分別在卡那霉素抗性培養基、氯霉素抗性培養 基、無卡那霉素且無氯霉素平板培養基中培養，選取只在所述無卡那霉素且無氯霉素平板 培養基上生長，且在所述卡那霉素抗性培養基和所述氯霉素抗性培養基均不生長的菌，為 重組菌；
[0027] 所述將生產丁醇的出發菌基因組上的硫酯酶基因 yciA基因替換為兩端帶有FRT的 標記基因的方法為所述將生產丁醇的出發菌基因組上的硫酯酶基因 yciA基因替換為FRT的 方法中的步驟1)。
[0028]由上述方法制備的重組菌也是本發明保護的范圍。
[0029]上述方法或上述重組菌在生產丁醇或提高丁醇產量中的應用也是本發明保護的 范圍；
[0030] 或上述方法或上述重組菌在生產丁酸或降低丁酸產量中的應用也是本發明保護 的范圍。
[0031] 或上述方法或上述重組菌在生產丁醇且降低副產物丁酸產量中的應用也是本發 明保護的范圍。
[0032] 本發明另一個目的是提供一種生產丁醇和/或丁酸的方法。
[0033] 本發明提供的方法，包括如下步驟:發酵上述重組菌，得到丁醇和/或丁酸。
[0034] EB228菌已于2016年1月11日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物 中心（簡稱CGMCC，地址:北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編 100101)，保藏號為CGMCC No. 11986,分類命名為大腸埃希氏菌Escherichia coli。
[0035]本發明的實驗證明，本發明中可促進大腸桿菌生產丁醇的改造靶點為硫酯酶基因 yciA，通過λ-red同源重組系統敲除技術，在一株產丁醇的大腸桿菌EB228CGMCC No.11986 中將基因組上的硫酯酶基因 yciA替換為FRT，得到重組菌，與EB228CGMCC No. 11986相比，該 重組菌發酵產生的丁酸產量明顯下降，丁醇產量有較明顯的上升，可以用于丁醇高產量生 產。
【附圖說明】
[0036]圖1為EB228體內的丁醇生產途徑。
[0037]圖2為基因敲除的過程示意圖。
[0038]圖3為出發菌株與突變體菌株在小管中發酵的丁酸產量和丁醇產量。
[0039]圖4為EB228 Δ yciA發酵液使用高效液相色譜(HPLC)分析的結果示意圖。
[0040]圖5為使用氣質聯用(GC-MS)鑒定丁酸標準品的總離子色譜圖。
[0041 ]圖6為中出發菌EB228(A)與工程菌EB228 Δ yciA(B)發酵液使用氣質聯用鑒定丁酸 的總離子色譜圖。
[0042]圖7為丁酸的質譜特征離子峰(A)和對應的標準譜庫檢索結果(B)。
【具體實施方式】
[0043] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0044] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0045] 下述實施例大腸桿菌為將丙酮丁醇梭菌體內的丁醇合成途徑轉移至BW25113得到 的菌，具體為EB228CGMCC No.11986。
[0046] EB228菌已于2016年1月11日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物 中心（簡稱CGMCC，地址:北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編 100101)，保藏號為CGMCC No. 11986,分類命名為大腸埃希氏菌Escherichia coli。
[0047] 實施例1、敲除大腸桿菌EB228中硫酯酶基因制備重組菌
[0048] 下面的實施例用的是λ-red同源重組系統進行敲除硫酯酶基因，其中涉及的質粒：
[0049] pKD4記載在如下文獻中：Datsenko，Kirill A·，and Barry L. Wanner · One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K_12using PCR products .Proceedings of the National Academy of Scien