專利名稱：檢測腎綜合征出血熱抗體的方法
技術領域：
本發明涉及腎綜合征出血熱(HFRS)病原——漢坦病毒(HV)S基因重組蛋白的制備和標記及免疫磁性微球的制備，利用免疫磁球捕獲技術，建立新型、快速、靈敏的免疫磁性微球-ELISA法，檢測腎綜合征出血熱病人血清標本中特異性IgM/IgG抗體。屬于生物技術領域。
背景技術：
我國是受腎綜合征出血熱危害最為嚴重的國家，每年發病人數占世界報道總數的90％以上，病死率極高，為我國法定報告傳染病病死率居前五位的傳染病之一，引起國內外的關注。該病的診斷和防治工作的研究大多由我國學者進行。該病起病急，臨床表現錯綜復雜，腎臟損害突出，尚無特效的藥物，危害嚴重，因此早期診斷和早期治療是改善病人預后降低病死率的關鍵。為此，該病的實驗室輔助診斷的研究就顯得極為重要。
對腎綜合征出血熱的早期采用RT-PCR方法進行病毒核酸的檢測僅限于發病后3～5天的病人，而病人血清抗體則隨著病程的延長逐漸升高并持續較長時間，故檢測病人血清中的特異性IgM/IgG抗體的方法輔助臨床診斷占有很重要的地位，并可用于疾病監測。現臨床上大多采用間接免疫熒光法(IFA)或ELISA檢測特異性IgM/IgG抗體。從方法學上講，IFA方法特異性強，相對靈敏度稍差，常用來做確證實驗；ELISA方法采用酶學級聯放大效應，靈敏度有所提高，但是在檢測IgM抗體時需用捕獲法以排除血中其它成分(如類風濕因子等)的干擾，否則容易出現假陽性。并且兩者都需要一定的儀器設備，難以推廣，而且現有的ELISA方法使用進口的酶標板體積較大不便于攜帶，且成本較高，這無疑就影響了基層醫療單位使用該方法進行早期診斷，所以研究一種提高試驗的靈敏度、而且操作簡單、便于攜帶、快速、靈敏、特異、利于推廣的檢測方法，以適合基層開展HFRS的診斷和疾病監測工作，是當務之急。

發明內容
針對上述問題，本發明的目的是為腎綜合征出血熱的早期診斷和疾病監測提供一種便于攜帶、簡便、快速、靈敏、特異的檢測方法，涉及漢坦病毒S基因重組蛋白的制備和標記、免疫磁性微球的制備，免疫磁性微球-ELISA方法的建立。
本發明采用基因工程技術將國內優勢流行型漢坦病毒標準株SEO型(漢城型)L99株及HTN型(漢灘型)Z10株的S基因定向克隆入pET32a載體，轉入E.coliBL21感受態，經IPTG誘導表達，用鎳離子親和層析(Ni-NTA)純化，獲得高純度的蛋白抗原，標記辣根過氧化物酶(HRP)或生物素，作為標記抗原；并對瓊脂糖、聚乙烯醇、纖維素等不同材質的磁性微球進行活化，連接羊抗人IgM(μ鏈)或羊抗人IgG抗體，得到可以用于檢測特異性IgM/IgG抗體的免疫磁性微球。用上述的免疫磁性微球代替傳統ELISA的酶標板作為固相吸附載體建立ELISA檢測方法，用于腎綜合征出血熱診斷或疾病監測。
檢測腎綜合征出血熱抗體的方法，其具體方案是采用羊抗人IgM(μ鏈)或羊抗人IgG抗體與磁性微球相連制備免疫磁性微球作為固相吸附載體，建立檢測腎綜合征出血熱病人血清IgM/IgG抗體的新型免疫磁性微球-ELISA方法，其主要步驟如下1)生物素或HRP標記的漢坦病毒S基因重組蛋白的制備；2)用于捕獲人血清抗體IgM/IgG的免疫磁性微球的制備；3)檢測腎綜合征出血熱病人抗體。
需要說明的是制備的酶標記重組蛋白是漢坦病毒S基因表達的重組蛋白，其制備工藝包括下述過程1)病毒的培養及RNA提取選取的漢坦病毒S基因來源于我國優勢流行型標準病毒株Z10和L99，保藏單位是中國疾病預防控制中心(CDC)病毒病預防與控制所，將Z10、L99病毒株按常規接種Vero-E6細胞，間接免疫熒光法(IFA)檢查細胞感染程度。在75％～100％細胞已感染時，收取細胞。細胞總RNA的提取使用Qiagen公司的RNeasy Mini Kit，按說明書的步驟提取。
2)利用RT-PCR技術獲取編碼目的蛋白的S基因將提取感染細胞的總RNA作為逆轉錄的模板合成cDNA，逆轉錄合成cDNA的引物序列為P14(TAGTAGTAGACTCC)，使用TaKaRa公司的RNA Kit(AMV)試劑盒按說明操作，逆轉錄產物直接用于PCR擴增，擴增Z10株S基因的引物序列P1和P2分別為GGGGTACCGCAACTATGGAGGAACTAC和CGCTCTAGAAGTTTTAAAGGCTCTTGG；PCR擴增L99株S基因的引物序列P3和P4分別為CGCATCGATGGCAACTATGGAAGAAATC和TCGGGTACCAATTTCATAGGTTCCTGG，上述引物序列均由英駿生物技術有限公司合成，反應條件為94℃ 2min預變性；94℃50sec，50℃～62℃50～75sec，72℃90sec，共30～35個循環；72℃延伸5～10min，上述PCR擴增產物經序列分析(由英駿生物技術有限公司提供測序服務)，其結果分別與GenBank登錄的Z10株序列(AF184987)和L99株序列(AF288299)相一致；3)基于大腸桿菌BL21菌株的漢坦病毒S基因pET-32a表達系統的構建用內切酶EcoRI和XhoI分別雙酶切L99病毒株的S基因PCR純化產物及pET-32a載體，用SacI和XhoI分別雙酶切Z10病毒株的S基因PCR純化產物及pET-32a載體，回收目的片段，T4連接酶連接后轉入E.coliBL21菌株的感受態細胞，重組質粒經PCR及雙酶切鑒定，獲得含有pET32a-L99S及pET32a-Z1OS重組質粒的E.coliBL21原核表達系統；4)漢坦病毒S基因重組蛋白的表達和鑒定將重組菌株接種于2～5mL含有氨芐青霉素100μg/mL的LB培養液中，37℃振蕩培養至OD600達0.6～0.8時，用終濃度為0.1～2mmol/L的IPTG誘導4小時，收集的菌體用2×凝膠上樣緩沖液重懸，100℃處理1～10min，使菌體裂解，裂解物進行SDS-PAGE分析；并采用全濕或半干轉印法將蛋白轉移到硝酸纖維素膜上，進行Western-blot鑒定，其中一抗和二抗分別為HFRS患者混合血清和1∶100～500PBS稀釋的辣根過氧化酶標記羊抗人IgG，其中PBS濃度為0.01mM，pH為7.4(以下PBS皆使用該濃度)，SDS-PAGE結果顯示構建的重組菌株pET32a-L99S/E.coliBL21及pET32a-Z10S/E.coliBL21均表達一個67.1kDa目的蛋白，Western-blot的結果為該重組蛋白與HV感染病人血清反應出現特異性條帶，表明其具有良好的抗原性；5)漢坦病毒S基因重組蛋白的提取和純化將誘導后的發酵菌液經5000r/min離心10min，收集菌體用pH7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗三遍，菌體沉淀用PBS重懸，超聲破碎菌體，12000r/min，4℃離心1小時，收集上清，最后用鎳離子親合層析柱(Ni-NTA)純化表達的蛋白，收集洗脫液，經過真空冷凍干燥，制備出漢坦病毒S基因重組蛋白純品，經SDS-PAGE或HPLC色譜法測定重組蛋白的純度為95～98％；6)漢坦病毒S基因重組蛋白的標記，它包括生物素和HRP標記兩種方法(A)標記生物素的實施步驟如下取純化后的表達蛋白10～30mg，溶于0.05～0.2M/L NaHCO3(pH8.5)緩沖液2～10mL中，加入活化生物素3～5mg，攪拌，室溫反應1～4小時，加入甘氨酸50～100mg，終止反應，生物素標記的重組蛋白經飽和硫酸銨沉淀2次后，沉淀物以2～5mLPBS溶解，透析后，真空冷凍干燥保存；(B)利用過碘酸鈉法標記HRP的實施步驟如下將1～5mg HRP溶于1～10mL蒸餾水中，加入新鮮配制的0.06M NaIO4溶液0.1～1mL，混勻，4℃放置30min，加入0.16M乙二醇-NaCl溶液0.5～1mL，預冷無水乙醇1～10mL室溫放置30min，離心，取沉淀物用蒸餾水使之完全溶解，即為醛化HRP，加入5～20mg表達蛋白的溶液1mL，混勻并裝透析袋，用0.05M碳酸鹽緩沖液pH9.5 4℃緩慢攪拌透析6～18小時，使之結合，然后吸出加入NaBH4或KBH4溶液(5mg/mL)0.05～0.2mL，4℃放置2小時，加入等體積飽和硫酸銨，沉淀物用PBS使之完全溶解，并透析過夜，次日再離心，除去不溶物即得酶標記物，用PBS加至1～5mL進行測定后，真空冷凍干燥保存。
制備用于捕獲人血清抗體IgM/IgG的免疫磁性微球，是將中國專利ZL03144274.9活化的磁性微球與羊抗人IgM(μ鏈)/羊抗人IgG的抗體連接，致敏為免疫磁性微球；具體作法為在2～8℃下，取活化好的磁性微球1～5mL，加入經pH9.6，0.1M碳酸鹽緩沖液稀釋過的羊抗人IgM(μ鏈)/羊抗人IgG5～10mL，充分反應后經PBS淋洗，加入10％兔血清(RSA)5～10mL于37℃封閉1小時后，用PBS洗凈即可得到用于IgM/IgG檢測的免疫磁性微球。
檢測腎綜合征出血熱病人抗體的方法，具體實驗步驟為分別在含有15μL已被羊抗人IgM(μ鏈)/羊抗人IgG致敏的免疫磁性微球的離心管中加入1∶50～100PBS稀釋的待測病人血清1mL，陰性和陽性對照各1mL，37℃振蕩反應1小時，在離心管壁外以磁鐵聚集固定微球，棄去反應液，用PBS反復清洗3次，然后進行酶標重組抗原顯色判定，方法是在實驗離心管中加入80～100倍PBS稀釋的HRP/生物素標記的表達蛋白1mL，37℃振蕩反應1小時，清洗后再加入新配制的顯色底物1mL，反應10min，肉眼觀察顏色變化，空白和陰性對照無色，陽性對照顯藍色，則結果成立，檢測管顯色深于或等于陽性對照顏色則表明實驗結果呈陽性，或者測定OD450值計算P/N≥2.1的判定為陽性，P/N＜2.1的判定為陰性，其中P/N＝(待測血清OD450值-空白對照OD450值)/(陰性對照OD450值-空白對照OD450值)。
傳統ELISA法與免疫磁球捕獲ELISA方法靈敏度的比較將HFRS病人血清用PBS按1∶10連續倍比稀釋至1∶10000，每個稀釋度作3份平行樣。利用傳統ELISA法(見全國臨床檢驗操作規程，南京東南大學出版社，1991，P345)和本發明的免疫磁球捕獲ELISA方法，分別對不同稀釋度的血清進行檢測，結果見表1。
表1 傳統ELISA法與免疫磁球捕獲ELISA法靈敏度比較

注+表示試驗結果為陽性，-表示試驗結果為陰性。
表1結果顯示免疫磁球捕獲ELISA方法同傳統ELISA法相比，當血清稀釋度低于1∶100時，兩種方法都可以檢測到陽性結果。當血清稀釋度達到1∶1000和1∶10000時，本發明的免疫磁球捕獲ELISA方法檢測陽性，而傳統ELISA法則為陰性，從而證明免疫磁球捕獲ELISA方法較傳統ELISA法靈敏度提高了100倍以上。
本發明的有益效果是利用本發明的免疫磁性微球技術建立的免疫磁球捕獲ELISA方法，代替傳統ELISA方法的酶標板作為固相吸附抗體/抗原的載體，不僅大大地增加了吸附的面積，而且以便于攜帶、有蓋的1.5mL離心管，替代體積較大的酶標板，從而使檢測操作簡便、快速，對傳統ELISA靈敏限以下無法檢測到的抗體有較高的檢出率。其靈敏度較傳統ELISA法提高了100倍以上。本發明適用于臨床實驗室檢測和疾病監測工作，尤其適用于基層單位的使用。本發明為臨床實驗檢測提供了一種新型、快速、簡便和易于推廣的檢測方法，對腎綜合征出血熱的早期診斷和防治工作，具有較大的經濟效益和社會效益。


圖1擴增漢坦病毒Z10和L99株S基因序列的電泳圖；圖2漢坦病毒S基因重組蛋白的Western-blot分析。
具體實施例方式實施例1一、漢坦病毒S基因重組表達蛋白的制備和標記1.病毒的培養及RNA提取將Z10、L99病毒株按常規接種Vero-E6細胞，間接免疫熒光法(IFA)檢查細胞感染程度。在75％以上細胞已感染時，收取細胞。細胞總RNA的提取，使用Qiagen公司的RNeasy Mini Kit，并按說明書的步驟進行提取。
2.利用RT-PCR技術獲取編碼目的蛋白的S基因將提取感染細胞的總RNA作為逆轉錄的模板合成cDNA，使用TaKaRa公司的RNAKit(AMV)試劑盒按說明操作。逆轉錄產物直接用于PCR擴增。反應條件為94℃ 2min預變性；94℃50sec，58℃50sec，72℃90sec，共30個循環；72℃延伸10min。PCR產物經1.0％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結果見圖1，圖中1為DL2000marker，2為Z10株S基因片段，3為L99株S基因片段。
3.基于大腸桿菌BL21菌株的pET-32a表達系統的構建利用EcoRI和XhoI分別雙酶切L99病毒株的PCR純化產物及pET-32a載體，利用SacI和XhoI分別雙酶切Z10病毒株的PCR純化產物及pET-32a載體，回收目的片段，T4連接酶相連后轉入E.coliBL21菌株的感受態細胞，重組質粒PCR及雙酶切鑒定，獲得含有ET32a-L99S及pET32a-Z1OS重組質粒的S基因的原核表達系統。
4.漢坦病毒S基因重組蛋白的表達和鑒定挑取陽性重組菌株接種5mL LB培養液(含氨芐青霉素100μg/mL)，37℃振蕩培養至OD600達0.8時，用終濃度為2mM/L的IPTG誘導4小時。收集的菌體用2×凝膠上樣緩沖液重懸，100℃處理10min，使菌體裂解，裂解物進行SDS-PAGE分析；并采用全濕轉印法將蛋白轉移到硝酸纖維素膜上，Western-blot鑒定(一抗和二抗分別為HFRS患者混合血清和1∶500稀釋的辣根過氧化酶標記羊抗人IgG)，結果見圖2。由圖中可見1為蛋白marker；2為pET32a-L99S/E.coliBL21表達目的蛋白的Western blot分析結果；3為pET32a-Z1OS/E.coliBL21表達目的蛋白的Western blot分析結果；表明其具有良好的抗原性。
5.漢坦病毒S基因重組蛋白的提取和純化將誘導后的發酵菌液經5000r/min離心10min，收集菌體用pH7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗三遍，菌體沉淀用PBS重懸，超聲破碎菌體，12000r/min，4℃離心1小時，收集上清，最后用鎳離子親合層析柱(Ni-NTA)純化表達的蛋白，收集洗脫液，經過真空冷凍干燥，制備出漢坦病毒S基因重組蛋白純品備用。
6.漢坦病毒S基因重組蛋白的生物素標記取純化后的重組蛋白10mg，溶于0.05M/L NaHCO3(pH8.5)緩沖液5mL中，加入活化生物素3mg，攪拌，室溫反應1小時，加入甘氨酸50mg，終止反應。生物素標記的重組蛋白經飽和硫酸銨沉淀2次后，沉淀物以2mLPBS溶解，透析后，真空冷凍干燥保存。
二、免疫磁性微球的制備采用1mL活化磁性微球(選自中國專利ZL03144274.9)，加入5mL經pH9.6，0.1M碳酸鹽緩沖液稀釋好的羊抗人IgM(μ鏈)，4℃反應過夜，經PBS洗滌后，加入10％兔血清(RSA)5mL于37℃封閉1小時后，用PBS洗凈即可得到用于IgM檢測的免疫磁性微球。
三、檢測腎綜合征出血熱病人特異性IgM抗體的方法分別在含有15μL已被羊抗人IgM(μ鏈)致敏的免疫磁性微球的離心管中加入1∶100PBS稀釋的待測病人血清1mL，陰性和陽性對照各1mL，37℃振蕩反應1小時，在離心管壁外以磁鐵的磁場聚集固定微球，棄去反應液，用PBS反復清洗3次。酶標重組蛋白抗原進行顯色判定，其方法是在實驗離心管中加入80倍PBS稀釋(其中PBS濃度在以下各實施例中皆為0.01mM，pH為7.4)的生物素標記的表達蛋白1mL，37℃振蕩反應1小時。清洗后再加入新配制的顯色底物1mL，反應10min。觀察顏色變化，空白和陰性對照無色，陽性對照顯藍色，則結果成立。檢測管顯色深于陽性對照顏色，表明實驗結果呈陽性。
實施例2一、漢坦病毒S基因重組蛋白的制備和標記(同實施例1)
二、免疫磁性微球的制備(同實施例1)三、檢測腎綜合征出血熱病人特異性IgM抗體的方法分別在含有15μL已被羊抗人IgM(μ鏈)致敏的免疫磁性微球的離心管中加入1∶100PBS稀釋的待測病人血清1mL，陰性和陽性對照各1mL，37℃振蕩反應1小時，在離心管壁外以磁鐵的磁場聚集固定微球，棄去反應液，用PBS反復清洗3次。酶標重組蛋白抗原進行顯色判定是在實驗離心管中加入100倍PBS稀釋的生物素標記的表達蛋白1mL，37℃振蕩反應1小時。清洗后再加入新配制的顯色底物1mL，反應10min。觀察顏色變化，空白和陰性對照無色，陽性對照顯藍色，則結果成立。此時檢測管顯示無色，表明實驗結果呈陰性。
實施例3一、漢坦病毒S基因重組蛋白的制備和標記(同實施例1)二、免疫磁性微球的制備(同實施例1)三、檢測腎綜合征出血熱病人特異性IgM抗體的方法分別在含有15μL已被羊抗人IgM(μ鏈)致敏的免疫磁性微球的離心管中加入1∶100PBS稀釋的待測病人血清1mL，陰性和陽性對照各1mL，37℃振蕩反應1小時，在離心管壁外以磁鐵的磁場聚集固定微球，棄去反應液，用PBS反復清洗3次。酶標重組蛋白抗原進行顯色判定是在實驗離心管中加入100倍PBS稀釋的生物素標記的表達蛋白1mL，37℃振蕩反應1小時。清洗后再加入新配制的顯色底物1mL，反應10min。觀察顏色變化，空白和陰性對照無色，陽性對照顯藍色，則結果成立。此時檢測管顯示淺于陽性對照顏色，表明實驗結果為陰性。
實施例4一、漢坦病毒S基因重組蛋白的制備和標記1.病毒的培養及RNA提取(同實施例1)2.利用RT-PCR技術獲取編碼目的蛋白的S基因(同實施例1)3.基于大腸桿菌BL21菌株的pET-32a表達系統的構建(同實施例1)4.漢坦病毒S基因重組蛋白的表達和鑒定(同實施例1)5.漢坦病毒S基因重組蛋白的提取和純化(同實施例1)6.漢坦病毒S基因重組蛋白的辣根過氧化物酶(HRP)標記將2mg HRP溶于5mL蒸餾水中，加入新鮮配制的0.06M NaIO4溶液1mL，混勻，4℃放置30min，加入0.16M乙二醇-NaCl溶液1mL，預冷無水乙醇4mL，室溫放置30min，離心，取沉淀物用蒸餾水使之完全溶解，即為醛化HRP。加入15mg表達蛋白的溶液1mL，混勻并裝透析袋，用0.05M pH9.5碳酸鹽緩沖液4℃緩慢攪拌透析10小時，使之結合。然后吸出加入KBH4溶液(5mg/mL)0.2mL，4℃放置2小時，加入等體積飽和硫酸銨。沉淀物用PBS使之完全溶解，并透析過夜。次日再離心，除去不溶物即得酶標記物。用PBS加至5mL透析后，真空冷凍干燥保存。
二、免疫磁性微球的制備取1mL制備好的活化磁性微球(選自中國發明專利ZL03144274.9)，加入5mL經pH9.6，0.1M碳酸鹽緩沖液稀釋好的羊抗人IgG，4℃反應過夜，經PBS洗滌后，加入10％兔血清(RSA)8mL于37℃封閉1小時后，用PBS洗凈即可得到用于IgG檢測的免疫磁性微球。
三、檢測腎綜合征出血熱病人特異性IgG抗體的方法分別在含有15μL已被羊抗人IgG致敏的免疫磁性微球的離心管中加入1∶80PBS稀釋的待測病人血清1mL，陰性和陽性對照各1mL，37℃振蕩反應1小時，在離心管壁外以磁鐵的磁場聚集固定微球，棄去反應液，用PBS反復清洗3次。酶標重組抗原進行顯色判定是在實驗離心管中加入100倍PBS稀釋的HRP標記重組蛋白抗原1mL，37℃振蕩反應1小時。清洗后再加入新配制的顯色底物1mL，反應10min。該測定OD450值結果經計算P/N＞2.1故判定為陽性，其中P/N＝(待測血清OD450值-空白對照OD450值)/(陰性對照OD450值-空白對照OD450值)。
實施例5一、漢坦病毒S基因重組表達蛋白的制備和標記(同實施例1)二、免疫磁性微球的制備取1mL制備好的活化磁性微球(選自中國發明專利ZL03144274.9)，加入6mL經pH9.6，0.1M碳酸鹽緩沖液稀釋好的羊抗人IgG，4℃反應過夜，經PBS洗滌后，加入10％兔血清(RSA)6mL于37℃封閉1小時后，用PBS洗凈即可得到用于IgG檢測的免疫磁性微球。
三、檢測腎綜合征出血熱病人特異性IgG抗體的方法分別在含有15μL已被羊抗人IgG致敏的免疫磁性微球的離心管中加入1∶100PBS稀釋的待測病人血清1mL，陰性或陽性對照各1mL，37℃振蕩反應1小時，在離心管壁外以磁鐵的磁場聚集固定微球，棄去反應液，用PBS反復清洗3次。酶標重組抗原進行顯色判定是在各試驗離心管中加入80倍PBS稀釋的生物素標記表達蛋白1mL，37℃振蕩反應1小時。清洗后再加入新配制的顯色底物1mL，反應10min。該測定OD450值結果經計算P/N＜2.1故判定為陰性，其中P/N＝(待測血清OD450值-空白對照OD450值)/(陰性對照OD450值-空白對照OD450值)。
序列表SEQUENCE LISTING<110>天津市衛生防病中心、天津醫科大學、南開大學<120>檢測腎綜合征出血熱抗體的方法<130>051228<160>5<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>14<212>DNA<213>人工序列<220>
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<221>prim_bind<222>(1)..(14)<400>5tcgggtacca atttcatagg ttcctgg2權利要求
1.檢測腎綜合征出血熱抗體的方法，其特征在于它采用羊抗人IgM(μ鏈)或羊抗人IgG抗體與磁性微球相連，制備免疫磁性微球作為固相吸附載體，建立檢測腎綜合征出血熱病人血清IgM/IgG抗體的新型免疫磁性微球-ELISA方法，其主要步驟如下1)生物素或辣根過氧化物酶(HRP)標記的漢坦病毒(HV)S基因重組蛋白的制備；2)用于捕獲人血清抗體IgM/IgG的免疫磁性微球的制備；3)檢測腎綜合征出血熱病人抗體。
2.按照權利要求1所述的檢測腎綜合征出血熱抗體的方法，其特征在于制備的酶標記重組蛋白是漢坦病毒S基因表達的重組蛋白，其制備工藝包括下述過程1)病毒的培養及RNA提取選取的漢坦病毒S基因來源于我國優勢流行型標準病毒株Z10和L99，保藏單位是中國疾病預防控制中心(CDC)病毒病預防與控制所，將Z10、L99病毒株按常規接種Vero-E6細胞，間接免疫熒光法(IFA)檢查細胞感染程度，在75％～100％細胞已感染時，收取細胞，細胞總RNA的提取使用Qiagen公司的RNeasy Mini Kit，按說明書的步驟提取；2)利用RT-PCR技術獲取編碼目的蛋白的S基因將提取感染細胞的總RNA作為逆轉錄的模板合成cDNA，逆轉錄合成cDNA的引物序列為P14(TAGTAGTAGACTCC)，使用TaKaRa公司的RNA Kit(AMV)試劑盒按說明操作，逆轉錄產物直接用于PCR擴增，擴增Z10株S基因的引物序列P1和P2分別為GGGGTACCGCAACTATGGAGGAACTAC和CGCTCTAGAAGTTTTAAAGGCTCTTGG；PCR擴增L99株S基因的引物序列P3和P4分別為CGCATCGATGGCAACTATGGAAGAAATC和TCGGGTACCAATTTCATAGGTTCCTGG，上述引物序列均由英駿生物技術有限公司合成，反應條件為94℃2min預變性；94℃50sec，50℃～62℃，50～75sec，72℃90sec，共30～35個循環；72℃延伸5～10min，上述PCR擴增產物經序列分析，其結果分別與GenBank登錄的Z10株序列(AF184987)和L99株序列(AF288299)相一致，測序工作由英駿生物技術有限公司提供服務；3)基于大腸桿菌BL21菌株的漢坦病毒S基因pET-32a表達系統的構建用內切酶EcoRI和XhoI分別雙酶切L99病毒株的S基因PCR純化產物及pET-32a載體，用SacI和XhoI分別雙酶切Z10病毒株的S基因PCR純化產物及pET-32a載體，回收目的片段，T4連接酶連接后轉入E.coliBL21菌株的感受態細胞，重組質粒經PCR及雙酶切鑒定，獲得含有pET32a-L99S及pET32a-Z10S重組質粒的E.coliBL21原核表達系統；4)漢坦病毒S基因重組蛋白的表達和鑒定將重組菌株接種于2～5mL含有氨芐青霉素100μg/mL的LB培養液中，37℃振蕩培養至OD600達0.6～0.8時，用終濃度為0.1～2mmol/L的IPTG誘導4小時，收集的菌體用2×凝膠上樣緩沖液重懸，100℃處理1～10min，使菌體裂解，裂解物進行SDS-PAGE電泳分析；并采用全濕或半干轉印法將蛋白轉移到硝酸纖維素膜上，進行Western-blot鑒定，其中一抗和二抗分別為HFRS患者混合血清和1∶100～500PBS稀釋的辣根過氧化酶標記羊抗人IgG，其中PBS濃度在本方法中皆為0.01mM，pH為7.4，SDS-PAGE結果顯示構建的重組菌株pET32a-L99S/E.coliBL21及pET32a-Z10S/E.coliBL21均表達一個67.1kDa目的蛋白，Western-blot的結果為該重組蛋白與HV感染病人血清反應出現特異性條帶，表明其具有良好的抗原性；5)漢坦病毒S基因重組蛋白的提取和純化將誘導后的發酵菌液經5000r/min離心10min，收集菌體用pH7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗三遍，菌體沉淀用PBS重懸，超聲破碎菌體，12000r/min，4℃離心1小時，收集上清，最后用鎳離子親合層析柱(Ni-NTA)純化表達的蛋白，收集洗脫液，經過真空冷凍干燥，制備出漢坦病毒S基因重組蛋白純品，經SDS-PAGE或HPLC色譜法測定重組蛋白的純度為95～98％；6)漢坦病毒S基因重組蛋白的標記，它包括生物素和HRP標記兩種方法(A)標記生物素的實施步驟如下取純化后的表達蛋白10～30mg，溶于0.05～0.2M/L NaHCO3(pH8.5)緩沖液2～10mL中，加入活化生物素3～5mg，攪拌，室溫反應1～4小時，加入甘氨酸50～100mg，終止反應，生物素標記的重組蛋白經飽和硫酸銨沉淀2次后，沉淀物以2～5mLPBS溶解，透析后，真空冷凍干燥保存；(B)利用過碘酸鈉法標記HRP的實施步驟如下將1～5mg HRP溶于1～10mL蒸餾水中，加入新鮮配制的0.06M NaIO4溶液0.1～1mL，混勻，4℃放置30min，加入0.16M乙二醇-NaCl溶液0.5～1mL，預冷無水乙醇1～10mL室溫放置30min，離心，取沉淀物用蒸餾水使之完全溶解，即為醛化HRP，加入5～20mg表達蛋白的溶液1mL，混勻并裝透析袋，用0.05M碳酸鹽緩沖液pH9.5，4℃緩慢攪拌透析6～18小時，使之結合，然后吸出加入NaBH4或KBH4溶液(5mg/mL)0.05～0.2mL，4℃放置2小時，加入等體積飽和硫酸銨，使沉淀物完全溶于PBS中，并透析過夜，次日再離心，除去不溶物即得酶標記物，用PBS加至1～5mL進行測定后，真空冷凍干燥保存。
3.按照權利要求1所述的檢測腎綜合征出血熱抗體的方法，其特征在于制備用于捕獲人血清抗體IgM/IgG的免疫磁性微球，是將中國專利ZL03144274.9活化的磁性微球與羊抗人IgM(μ鏈)/羊抗人IgG的抗體連接，致敏為免疫磁性微球；具體作法是在2～8℃下，取上述活化好的磁性微球1～5mL，加入經pH9.6，0.1M碳酸鹽緩沖液稀釋過的羊抗人IgM(μ鏈)/羊抗人IgG5～10mL，充分反應后經PBS淋洗，加入10％兔血清(RSA)5～10mL于37℃封閉1小時后，用PBS洗凈即可得到用于IgM/IgG檢測的免疫磁性微球。
4.按照權利要求1所述的檢測腎綜合征出血熱抗體的方法，其特征在于檢測腎綜合征出血熱病人抗體的方法，具體實驗步驟為分別在含有15μL已被羊抗人IgM(μ鏈)/羊抗人IgG致敏的免疫磁性微球的離心管中加入1∶50～100PBS稀釋的待測病人血清1mL，陰性和陽性對照各1mL，37℃振蕩反應1小時，在離心管壁外以磁鐵聚集固定微球，棄去反應液，用PBS反復清洗3次，然后進行酶標重組抗原顯色判定，方法是在實驗離心管中加入80～100倍PBS稀釋的HRP或生物素標記的重組蛋白1mL，37℃振蕩反應1小時，清洗后再加入新配制的顯色底物1mL，反應10min，肉眼觀察顏色變化，空白和陰性對照無色，陽性對照顯藍色，則結果成立，檢測管顯色深于或等于陽性對照顏色則表明實驗結果呈陽性，或者測定OD450值計算P/N≥2.1的判定為陽性，P/N＜2.1的判定為陰性，其中P/N＝(待測血清OD450值-空白對照OD450值)/(陰性對照OD450值-空白對照OD450值)。
全文摘要
本發明提供了一種檢測腎綜合征出血熱(HFRS)抗體的方法，屬于生物技術領域，涉及利用免疫磁性捕獲技術和酶標記重組病毒的抗原蛋白，對由漢坦病毒所致HFRS抗體檢測技術。其目的是為HFRS的早期診斷提供一種簡便、快速、靈敏、特異的適于基層單位使用的檢測方法。本發明將pET原核表達系統表達的漢坦病毒代表株Z10和L99的S基因重組蛋白純化，標記生物素或辣根過氧化物酶。將磁性微球連接羊抗人IgM(μ鏈)或羊抗人IgG抗體，使其致敏，得到用于檢測漢坦病毒漢城型或漢灘型的特異性IgM/IgG抗體的免疫磁性微球，建立檢測血清標本中HFRS特異性IgM/IgG抗體的快速、靈敏的免疫磁性微球－ELISA方法。
文檔編號G01N33/531GK1811451SQ20061001315
公開日2006年8月2日 申請日期2006年1月27日 優先權日2006年1月27日
發明者王擷秀, 陳錦英, 白鋼, 楊東靖 申請人:天津市衛生防病中心, 天津醫科大學, 南開大學