一種復合發酵菌種及其制備方法和應用
【專利說明】一種復合發酵菌種及其制備方法和應用 【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種復合發酵菌種及其制備方法和應用，尤其是涉及一種用于水牛乳 發酵酸奶的復合發酵菌種及其制備方法和應用。 【技術背景】
[0002] 水牛乳是中國南方地區的一種特色乳品，具有高質、安全、少有的特點。水牛乳 產量較低，但其所含蛋白質、乳脂、維生素、微量元素等均高于黑白花牛奶，被譽為"奶中之 王"。目前我國水牛乳加工產業還處于初級階段，主要以液態乳為主，高附加值產品較少。
[0003] 酸奶是以牛乳為原料，經巴氏殺菌冷卻后加入乳酸菌發酵而成的產品，其發酵乳 含有大量的益生菌，具有調節胃腸道菌群，改善機體免疫系統等功效，因而倍受歡迎，市場 發展潛力巨大。
[0004] γ-氨基丁酸（簡稱GABA)是一種天然非蛋白氨基酸，大量研究已表明，GABA具有 降血壓、抗驚厥、鎮痛、改善睡眠、解毒等多種生理功能。水牛乳酸奶和GABA可謂是完美組 合，利用乳酸菌發酵得到富含GABA的水牛乳酸奶，可進一步提升酸奶的營養價值，使其具 有更多GABA方面的生理功效，以滿足人們對功能性食品的高要求，應運市場的發展，同時 也是目前水牛乳加工產業急需解決的問題。而目前發酵水牛乳酸奶大多采用嗜熱鏈球菌和 保加利亞乳酸桿菌，這些菌種發酵制得的酸奶口感爽滑，組織狀態細膩，但不產GABA，只是 單純地具備普通酸奶的營養價值。另外，現有水牛乳酸奶制作工藝中，還時有選用菌種或菌 種配比不當造成發酵過程中凝乳過粘、組織狀態過硬等問題。 【
【發明內容】
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[0005] 鑒于以上提出的問題，本發明提供了一種用于水牛乳酸奶的復合發酵菌種及其制 備方法和應用。
[0006] 本發明人經研究發現，從生水牛乳中分離出的乳酸乳球菌乳酸亞種 (Lactobacilluslactissubsp.lactis) 25#，保藏于中國典型培養物保藏中心，簡稱 CCTCC，地址為中國湖北省武漢市武漢大學，保藏日期為2015. 11. 25，保藏編號為CCTCC Ν0:Μ2015700,和植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum) 12#，保藏于中國典型培養物保 藏中心，簡稱CCTCC，地址為中國湖北省武漢市武漢大學，保藏日期為2015. 11. 25,保藏編 號為CCTCCΝ0:Μ2015699,這兩種菌種均能產γ-氨基丁酸，且產量較高，故考慮將以上兩 種菌種與傳統酸奶菌種嗜熱鏈球菌混合制得一種可產γ-氨基丁酸的復合發酵菌種，進而 將所述復合發酵菌種運用到水牛乳酸奶的發酵中，以制得一種富含γ-氨基丁酸的水牛乳 酸奶，使所得酸奶在原有普通酸奶營養價值的基礎上，增加了γ-氨基丁酸的特殊生理功 效，進一步提高了酸奶的高附加值。
[0007] 本發明為解決上述技術問題所采用的技術方案為：一種復合發酵菌種，所述復合 發酵菌種由乳酸乳球菌乳酸亞種、植物乳桿菌和嗜熱鏈球菌經活化后按照質量比為1-2 : 1 :1-2的比例混合而成，優選所述復合發酵菌種由乳酸乳球菌乳酸亞種、植物乳桿菌和嗜 熱鏈球菌經活化后按照質量比為2 :1 :1的比例混合而成，所述乳酸乳球菌乳酸亞種和植 物乳桿菌均自生鮮水牛乳中分離而得；分離所得乳酸乳球菌乳酸亞種為乳酸乳球菌乳酸 亞種（Lactobacilluslactissubsp.lactis)25#，于 2015 年 11 月 25 日保藏于中國典型 培養物保藏中心，保藏編號為CCTCCN0:M2015700 ;分離所得植物乳桿菌為植物乳桿菌 (Lactobacillusplantarum) 12#，于2015年11月25日保藏于中國典型培養物保藏中心， 保藏編號為CCTCCN0:M2015699,而嗜熱鏈球菌（保藏編號為CGMCC2718)，購于中國普通 微生物菌種保藏管理中心。
[0008] 所述復合發酵菌種的制備方法包括如下步驟：
[0009]a)將乳酸乳球菌乳酸亞種、植物乳桿菌和嗜熱鏈球菌分別在MRS斜面培養基連續 二次復蘇傳代培養，得菌株；
[0010] b)將步驟a)所得菌株分別接種至lOOmlMRS肉湯培養基中，35-40°C搖床培養 20-24h，得培養菌液；
[0011] c)將步驟b)所得培養菌液分別用離心機，以4800-5200rpm的轉速離心6-10min， 收集上清液，得到目的菌液，即活化的乳酸乳球菌乳酸亞種、植物乳桿菌和嗜熱鏈球菌；
[0012] d)將步驟c)所得三種目的菌液按所述比例調配均勻后接種到滅菌后的脫脂水牛 乳中，接種量為脫脂水牛乳總質量的20%，再置于37°C搖床培養16-24h，即得所述復合發 酵菌種。該菌種的保存方式可采用凍干保存或甘油管保存。
[0013] 其中，步驟a)中，所述MRS斜面培養基含如下組分：蛋白胨10g，牛肉粉8g，酵母 粉4g，葡萄糖20g，磷酸氫二鉀2. 0g，檸檬酸氫二銨2. 0g，乙酸鈉5. 0g，硫酸鎂0. 2g，硫酸錳 0· 04g，瓊脂 14g，吐溫-80lg，蒸餾水 1000mL。
[0014] 步驟b)中，所述MRS肉湯培養基含如下組分：酪蛋白酶消化物10g，肉膏粉10g，酵 母膏粉4g，檸檬酸三銨2g，乙酸鈉5g，硫酸鎂0. 2g，硫酸錳0. 05g，硫酸氫二鉀2. 0g，葡萄糖 20g，吐溫-80 1. 08g，蒸餾水 1000mL。
[0015] 所述復合發酵菌種可應用于水牛乳酸奶的發酵。將該復合發酵菌種按照質量百分 比5-10%的接種量加入脫脂水牛乳中發酵酸奶，所得酸奶不僅具備普通酸奶的營養價值， 還富含γ-氨基丁酸，從而附加了γ-氨基丁酸所特有的降血壓、抗驚厥、鎮痛、改善睡眠、 解毒等多種生理功能。
[0016] 本發明提供了一種復合發酵菌種及其制備方法和應用，與現有技術相比，具有以 下有益效果：本發明所提供的復合發酵菌種由自生鮮水牛乳中分離出的乳酸乳球菌乳酸亞 種和植物乳桿菌兩種菌株與傳統酸奶菌種嗜熱鏈球菌混合制得，該復合發酵菌種中，乳酸 乳球菌乳酸亞種和植物乳桿菌均產γ-氨基丁酸，具有降血壓、抗驚厥、鎮痛、解毒等多種 生理功能性，將該復合發酵菌種應用于水牛乳酸奶的發酵，所制得的酸奶中富含γ-氨基 丁酸，從而可使其在原有普通酸奶營養價值的基礎上，同時增加γ-氨基丁酸的特殊生理 功效；另有，該復合菌種中的乳酸乳球菌乳酸亞種和植物乳桿菌均分離自水牛乳，后又將該 復合菌種應用于水牛乳酸奶的發酵，可謂"源于水牛乳而用于水牛乳"，可實現資源的高附 加值循環利用。再有，該發酵菌種用于水牛乳發酵酸奶，發酵過程中不會出現凝乳過粘、組 織狀態過硬等問題，制得酸奶乳香濃郁、質地黏稠、口感細膩，且酸奶中乳酸菌活菌數高，乳 清析出量少，產品后酸化程度可控，保質期長。 【【具體實施方式】】
[0017] 下面的實施例可以幫助本領域的技術人員更全面的理解本發明，但不可以以任何 方式限制本發明。
[0018] 下述各實施例中，無特別說明，涉及的比例均為重量比。
[0019] 下述實施例中，所涉及的檢測方法如下：
[0020] 脂肪測定方法：參照GB5413. 3 ;
[0021] 蛋白質測定方法：參照GB5009. 5 ;
[0022] 酸度測定方法：參照GB5413. 34-2010 ;
[0023] 乳酸菌活菌數計數方法：參照GB2746-1999 ;
[0024] γ-氨基丁酸（GABA)測定方法：高效液相色譜法（HPLC)。
[0025] 下述實施例中原料及設備來源：
[0026] 下述實施例中，所米用的乳酸乳球菌乳酸亞種（Lactobacilluslactissubsp. lactis) 25#和植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum) 12#均分離自生鮮水牛乳，其中，乳 酸乳球菌乳酸亞種（Lactobacilluslactissubsp.lactis) 25#，保藏于中國典型培養物保 藏中心，簡稱CCTCC，地址為中國湖北省武漢市武漢大學，保藏編號為CCTCCNO:Μ2015700， 保藏日期為2015. 11.25 ;植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum) 12#，保藏于中國典型 培養物保藏中心，簡稱CCTCC，地址為中國湖北省武漢市武漢大學，保藏編號為CCTCCNO:Μ 2015699,保藏日期為2015. 11. 25。所采用的嗜熱鏈球菌購于中國普通微生物菌種保藏中 心，保藏編號為CGMCCΝ0:1·2718。
[0027] 水牛乳，廣西水牛研究所種水牛場；MRS培養基，青島科園海博生物技術有限公 司；MRS肉湯，廣東環凱微生物科技有限公司；低速大容量離心機：型號：DD- 5M;冷凍干燥 機：ALPHAl-2LDplus型，德國MARTINCHRIST公司；三用恒溫水槽型號：DK- 600S，上海精 宏實驗設備有限公司；電子天平ME204E/02梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。
[0028] 實施例1
[0029] -種復合發酵菌種，所述復合發酵菌種由自生鮮水牛乳中分離出的乳酸乳球 菌乳酸亞種（Lactobacilluslactissubsp.lactis)25#、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum) 12#和傳統酸奶菌種嗜熱鏈球菌經活化后按質量比1 :1 :1混合制得，其制備方 法為：先按照如下原料配比配制MRS斜面培養基和MRS肉湯培養基，其中，所述MRS斜面 培養基含如下組分：蛋白胨l〇g，牛肉粉8g，酵母粉4g，葡萄糖20g，磷酸氫二鉀2. 0g，檸 檬酸氫二銨2. 0g，乙酸鈉5. 0g，硫酸鎂0. 2g，硫酸錳0. 04g，瓊脂14g，吐溫-80lg，蒸餾水 1000mL;所述MRS肉湯培養基含如下組分：酪蛋白酶消化物10g，肉膏粉10g，酵母膏粉4g， 檸檬酸三銨2g，乙酸鈉5g，硫酸鎂0. 2g，硫酸錳0. 05g，硫酸氫二鉀2. 0g，葡萄糖20g，吐 溫-80 1.08g，蒸餾水1000mL。隨后，將凍干保存的乳酸乳球菌乳酸亞種（Lactobacillus lactissubsp.lactis) 25#、植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum) 12# 和嗜熱鏈球菌分 別在MRS斜面培養基連續二次復蘇傳代培養，得菌株；再將所得菌株分別接種至lOOmlMRS 肉湯培養基中，35 °C搖床培養24h，得培養菌液；進而將所得培養菌液分別用離心機以 4800rpm的轉速離心10min，收集上清液，得到目的菌液，即活化的乳酸乳球菌乳酸亞種、植 物乳桿菌和嗜熱鏈球菌；最后將所得三種目的菌液按所述比例調配均勻后接種到滅菌后的 脫脂水牛乳中，接種量為脫脂水牛乳總質量的20%，再置于37°C搖床培養16h，即得所述復 合發酵菌種。
[0030] 實施例2
[0031] -種復合發酵菌種，所述復合發酵菌種由自生鮮水牛乳中分離出的乳酸乳球 菌乳酸亞種（Lactobacilluslactissubsp.lactis)25#、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum) 12#和傳統酸奶菌種嗜熱鏈球菌按質量比2 :1 :1混合制得，其制備方法為：按 照實施例1相同的配方配制MRS斜面培養基和MRS肉湯培養基；將凍干保存的乳酸乳球 菌乳酸亞種（Lactobacilluslactissubsp.lactis)25#、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum) 12#和嗜熱鏈球菌分別在MRS斜面培養基連續二次復蘇傳代培養，得菌株；將所 得菌株分別接種至lOOmlMRS肉湯培養基中，37°C搖床培養22h，得培養菌液；將所得培養 菌液分別用離心機以5000