專利名稱：一種中國明對蝦抗菌蛋白基因及重組表達和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程領域中抗菌蛋白(crustin)基因的表達，具體地說是一種中國明對蝦抗菌蛋白基因及重組表達和應用。
背景技術：
對蝦養殖是海水養殖的支柱產業之一，隨著市場對優質水產品需求量的不斷增長，蝦類養殖在水產養殖中占據越來越重要的地位。二十世紀九十年代以來，疾病的大規模爆發使海水養殖業蒙受了巨大的損失，抗生素的濫用與環境的惡化使得海水養殖動物的病害難以從根本上得到控制。
海水養殖品種生活于富含各種微生物的水環境中，長期的環境壓力使其形成了有效的防御功能。抗菌肽(蛋白)被認為是魚、蝦、貝等防卸系統的主要成分之一。通過研究海水養殖品種的抗菌肽基因的結構和功能，進而通過基因工程技術在體外進行重組表達，將有希望成為能夠替代抗生素的新型藥物。
免疫防御體系是動物抗病力的基礎，特別是低等無脊椎動物，它們的免疫反應要比高等動物簡單得多，主要依賴于內源的非特異性免疫反應。近幾年的研究表明，低等無脊椎動物在保護自身負受外源有害微生物(如細菌、真菌或病毒)傷害時，其機體中的非特異性抗菌因子如抗菌肽(蛋白)、溶菌酶、轉鐵蛋白等起到非常重要的作用。其中，抗菌肽(蛋白)是由動物和植物細胞特定基因編碼產生的一類小分子多肽(蛋白)，具有抗菌活性。20世紀70年代中期，瑞典科學家Boman等在用E.coli誘導惜古比天蠶(Hyatophora cecropia)時分離得到了世界上第一種抗菌肽—天蠶素(cecropin)。此后，人們相繼在其它昆蟲、兩棲動物、哺乳動物、人、植物、甲殼動物、軟體動物等生物體內都發現存在類似具有抗菌活性的多肽(蛋白)。crustin是最早由Relf等從濱蟹(Carcinus maenas)體內分離純化得到的一種具有很強抑制革蘭氏陽性菌活性的小分子蛋白，其自身不易失活，甚至在被煮沸后仍能保持很高活性(J. M. Relf，J. R. S.Chisholm，G.D.Kemp and V.J.Smith，Purification and characterization of acysteine-rich 11.5-kDa antibacterial protein from the granular haemocytes ofthe shore crab，Carcinus maenas.Eur.J.Biochem.1999；264(2)350-357)。此后，人們先后從凡納濱對蝦、白濱對蝦、日本囊對蝦和斑節對蝦等蝦類中發現了crustin或抗菌蛋白類似物(crustin-like)基因的存在。
crustin的作用機理與傳統抗生素不同，它的靶位點主要是病原體細胞膜，因此不易產生耐藥性。目前，許多病原菌對現有抗生素逐步產生耐藥性，而新型抗生素的發現又極其困難，因此，crustin的研究為開發新型抗菌藥物開辟了廣闊的前景。
總之，crustin以及其他類型抗菌肽(蛋白)的研究不僅具有重要的理論意義，在實踐上也具有巨大的應用潛力，因此，它已成為當前生物醫藥研究的熱點之一。

發明內容
目的在于提供一種中國明對蝦抗菌蛋白基因及其高效重組表達和應用。
本發明技術方案如下中國明對蝦抗菌蛋白基因具有序列表SEQ ID No.1中的堿基序列及SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
所述中國明對蝦抗菌蛋白基因的重組表達從中國明對蝦cDNA文庫中克隆到一種抗菌蛋白基因，利用其成熟肽基因構建原核表達載體，篩選出一種用于高效表達中國明對蝦抗菌蛋白基因的重組表達體系，獲得含二硫鍵的原核表達重組蛋白高效復性的緩沖液系統，從而獲得有活性的重組抗菌蛋白；具體為1.基因克隆根據中國明對蝦EST的提示，利用RACE技術，從血細胞cDNA文庫中克隆目的基因；2.重組表達載體及宿主菌的選擇確定以包含體形式進行重組表達的表達載體pCRT7/NT TOPOTA及能夠緩解目的基因表達產物毒性的宿主菌BL21(DE3)pLysS；3.重組表達載體的構建利用表達載體為T載體的特征，采用一對特異性引物克隆成熟肽基因，PCR產物回收后直接與表達進行連接，構建重組表達載體；4.轉化與篩選將構建得到的重組表達載體轉化大腸桿菌BL21(DE3)pLysS，篩選工程菌并進行誘導表達；5.表達產物的分離純化采用誘導劑異丙基-β-D-硫代半乳糖苷誘導表達工程菌，超聲波破碎細胞，利用金屬螯合柱層析的方法純化抗菌蛋白，蛋白復性，融合標簽切除，獲得有活性的重組抗菌蛋白；所述蛋白復性采用含二硫鍵的原核表達重組蛋白高效復性的緩沖液系統，在復性緩沖溶液中添加氧化型谷胱甘肽和還原型谷胱甘肽；其濃度比復性緩沖溶液(PBS)∶氧化型谷胱甘肽∶還原型谷胱甘肽＝50∶1∶10；復性緩沖溶液pH值為7.2~7.4；所述一對特異性引物為CD-F5’CAG AAT AAA GAC GAT ACT CG 3’；CD-R5’CTA TCC CTC AGA ACC CAG 3’。
所述中國明對蝦抗菌蛋白基因對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的生長均具有抑制作用。
本發明有如下優點1.本發明確定了一種中國明對蝦抗菌蛋白基因的全部編碼序列和非編碼序列，從而也弄清了它所編碼的氨基酸序列及其信號肽切割位點，利用所推導的成熟肽氨基酸序列對該基因進行重組表達。
2.本發明篩選出能有效地進行抗菌蛋白重組表達的載體及宿主菌，對研究其他具有抗菌功能蛋白的重組表達提供了依據。
3.本發明對含有二硫鍵的重組蛋白的分離純化及蛋白質復性提供了一個合適的氧化還原體系，可以有效的保證重組蛋白中二硫鍵的正確形成。
4.意義深遠。通過本發明可開發有效的對蝦細菌性疾病的防治藥物。同時，對其他具有抗菌活性蛋白的重組表達及易于氧化的重組蛋白的分離純化的研究提供了新的思路。
具體實施例方式
下面結合實施例對本發明作進一步詳細說明。
實施例一種克隆的中國明對蝦抗菌蛋白基因，具有如下序列(1)SEQ ID No 1的信息(參見序列表)(a)序列特征*長度523堿基對*類型核酸*鏈型雙鏈*拓撲結構線性(b)分子類型cDNA(c)假設否(d)反義否(e)最初來源中國明對蝦(Fenneropenaeus chinensis)序列描述SEQ ID No.1GAGTCCGTTCATCGCACAGCCGAGAAACACTATCAAGATGTTGAAGTTTGTAGTATTATCCGTTGTCGCCGTGGCTGTGGTACACGCCCAGAATAAAGACGATACTCGCTTCCTTGGCGGAGTTCCTGGGGTTGGGGGTGGCTTCGTTCCAGGGGTTCCTGGGCATGGCGGCGTTGCTCCTGTAGGCGGTGGCCTTGTCCCTGGCGGCGGTGGCCTTATCCCTGGAGGTGGATTCGAGTGCAATTACTGCAGAACGAGGTACGGATACGTATGCTGCAAGCCCGGCAGGTGTCCACCGGTTCGCGACGTCTGCCCAGGCCTCAGGCAGGGTGTCCCGATCTGCCGTCAGGACACCGACTGCTTCGGCTCCGACAAATGCTGCTACGACGTCTGCTTGAACGACACCGTCTGCAAACCCATCGTGCTGGGTTCTGAGGGATAGGCCTGCATGTTTAACCCTTCAATTCTACTTTATTAAATAAATACTATAACTGTTAATTGCTTAAAAAAAAAAAAAAAA(2)SEQ ID No.2的信息(參見序列表)(a)序列特征*長度134氨基酸*類型氨基酸*鏈型單鏈*拓撲結構線性(b)分子類型蛋白序列描述SEQ ID No.2MLKFVVLSVVAVAVVHAQNKDDTRFLGGVPGVGGGFVPGVPGHGGVAPVGGGLVPGGGGLIPGGGFECN
YCRTRYGYVCCKPGRCPPVRDVCPGLRQGVPICRQDTDCFGSDKCCYDVCLNDTVCKPIVLGSEG中國明對蝦基因的體外重組表達、分離純化及生物活性分析從中國明對蝦cDNA文庫中篩選到一種抗菌蛋白(crustin)基因，利用其成熟肽基因構建原核表達載體，篩選出一種用于高效表達中國明對蝦抗菌蛋白基因的重組表達體系，找到了一種用于含二硫鍵的原核表達重組蛋白高效復性的緩沖液系統，獲得了有活性的重組抗菌蛋白。具體如下1)基因克隆根據中國明對蝦EST的提示，利用RACE技術，從血細胞cDNA文庫中克隆目的基因；2)重組表達載體及宿主菌的選擇由于目的基因的重組表達產物具有較強的抑菌活性，本發明對目前幾種商業化的表達載體及宿主菌進行篩選，并確定了以包含體形式進行重組表達的表達載體pCRT7/NTTOPOTA及能夠緩解目的基因表達產物毒性的宿主菌BL21(DE3)pLysS。
所述重組表達體系可以高效地表達抗菌蛋白，表達效率達845mg/L。
3)重組表達載體的構建利用表達載體為T載體的特征，設計一對特異性引物(CD-F5’CAG AAT AAA GACGAT ACT CG 3’；CD-R5’CTA TCC CTC AGA ACC CAG 3’)克隆成熟肽基因，PCR產物回收后直接與表達進行連接，構建重組表載體。
4)誘導表達及誘導產物的篩選將重組表達載體轉化表達宿主菌BL21(DE3)pLysS，在終濃度為100μg/mL的氨芐青霉素與34μg/mL氯霉素的LB培養基中培養菌體濃度至OD600為0.6左右(37℃，250r/min)，添加終濃度為1mmol/L IPTG進行誘導表達4h；然后采用誘導劑異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(簡稱IPTG)篩選誘導表達工程菌。
5)分離純化誘導結束后，超聲波破碎細胞，利用金屬螯合柱層析的方法純化抗菌蛋白，蛋白復性具體是離心收集菌泥，稱量濕重，按1∶10加入buffer A(50mmol/L磷酸鈉，6mol/L鹽酸胍，300mmol/L氯化鈉，1mmol/L氧化型谷胱甘肽，10mmol/L還原型谷胱甘肽，pH7.2)，超聲波破碎，4℃，12,000r/min下離心30min，收集上清。利用Co-NTA-Agarose在變性條件下進行分離純化。分離純化后的重組蛋白，依次在含有8mol/L、4mol/L、2mol/L、1mol/L及0.5mol/L尿素的50mmol/L PBS緩沖液(1mmol/L氧化型谷胱甘肽，10mmol/L還原型谷胱甘肽，pH7.4)中透析各8h，將裂解液中的鹽酸胍替換出來，在50mmol/L pH7.4 PBS緩沖液平衡的Sephadex G-75層析柱去除尿素，收集洗脫液。
6)酶切去除融合標簽將洗脫液的蛋白濃度稀釋至2mg/mL，利用Invitrogen公司的EKMaxTM試劑盒進行融合標簽的切除(25℃，24h)。
7)抑菌實驗將去除融合標簽后的蛋白濃縮至64μmol/L，同時以50mmol/L pH7.4的PBS為陰性對照。利用牛津杯瓊脂擴散法檢測其對革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureu)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、藤黃微球菌(Micrococcus luteus)與革蘭氏陰性菌大腸桿菌(Escherichia coli)、鰻弧菌(Vibrio anguillarum)的抑菌活性。即將待檢測菌株分別于37℃，200r/min下培養過夜；次日離心菌體并用滅菌的50mmol/L pH7.4的PBS洗滌菌體2次，并利用PBS稀釋菌體至106cells/mL，取100μl均勻涂布于LB平板表面，于37℃培養箱中培養2h后，取出平板在瓊脂表面等距離放置牛津杯，向牛津杯中添加不同濃度梯度的重組蛋白，同時以PBS作為陰性對照，37℃培養箱中繼續培養22h，取出觀察結果。
結果表明4μmol/L的重組蛋白能有效地抑制所檢測的革蘭氏陽性菌(金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌與藤黃微球菌)的生長，16μmol/L的重組蛋白能有效地抑制所檢測的革蘭氏陰性菌(大腸桿菌與鰻弧菌)的生長。
該基因的成功克隆與重組蛋白生物活性的鑒定，在新型抗菌藥物的開發上具有重要應用前景。
序列表SEQUENCE LISTING<110>中國科學院海洋研究所<120>一種中國明對蝦抗菌蛋白基因及重組表達和應用<130>
<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>523<212>DNA<213>中國明對蝦(Fenneropenaeus chinensis)<220>
<221>ORF<222>(40)..(444)<223>
<400>1gagtccgttc atcgcacagc cgagagaaac actatcaaga tgttgaagtt tgtagtatta 60tccgttgtcg ccgtggctgt ggtacacgcc cagaataaag acgatactcg cttccttggc120ggagttcctg gggttggggg tggcttcgtt ccaggggttc ctgggcatgg cggcgttgct180cctgtaggcg gtggccttgt ccctggcggc ggtggcctta tccctggagg tggattcgag240tgcaattact gcagaacgag gtacggatac gtatgctgca agcccggcag gtgtccaccg300gttcgcgacg tctgcccagg cctcaggcag ggtgtcccga tctgccgtca ggacaccgac360
tgcttcggct ccgacaaatg ctgctacgac gtctgcttga acgacaccgt ctgcaaaccc420atcgtgctgg gttctgaggg ataggcctgc atgtttaacc cttcaattct actttattaa480ataaatacta taactgttaa ttgcttaaaa aaaaaaaaaa aaa 523<210>2<211>134<212>PRT<213>中國明對蝦(Fenneropenaeus chinensis)<400>2Met Leu Lys Phe Val Val Leu Ser Val Val Ala Val Ala Val Val His1 5 10 15Ala Gln Asn Lys Asp Asp Thr Arg Phe Leu Gly Gly Val Pro Gly Val20 25 30Gly Gly Gly Phe Val Pro Gly Val Pro Gly His Gly Gly Val Ala Pro35 40 45Val Gly Gly Gly Leu Val Pro Gly Gly Gly Gly Leu Ile Pro Gly Gly50 55 60Gly Phe Glu Cys Asn Tyr Cys Arg Thr Arg Tyr Gly Tyr Val Cys Cys65 70 75 80Lys Pro Gly Arg Cys Pro Pro Val Arg Asp Val Cys Pro Gly Leu Arg85 90 95Gln Gly Val Pro Ile Cys Arg Gln Asp Thr Asp Cys Phe Gly Ser Asp100 105 110Lys Cys Cys Tyr Asp Val Cys Leu Asn Asp Thr Val Cys Lys Pro Ile115 120 125Val Leu Gly Ser Glu Gly130
權利要求
1.一種中國明對蝦抗菌蛋白基因，其特征在于具有序列表SEQ ID No.1中的堿基序列及SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
2.一種按照權利要求1所述中國明對蝦抗菌蛋白基因的重組表達，其特征在于從中國明對蝦cDNA文庫中克隆到一種抗菌蛋白基因，利用其成熟肽基因構建原核表達載體，篩選出一種用于高效表達中國明對蝦抗菌蛋白基因的重組表達本系，獲得含二硫鍵的原核表達重組蛋白高效復性的緩沖液系統，從而獲得有活性的重組抗菌蛋白；具體為1)基因克隆根據中國明對蝦EST的提示，利用RACE技術，從血細胞cDNA文庫中克隆目的基因；2)重組表達載體及宿主菌的選擇確定以包含體形式進行重組表達的表達載體pCRT7/NT TOPOTA及能夠緩解目的基因表達產物毒性的宿主菌BL21(DE3)pLysS；3)重組表達載體的構建利用表達載體為T載體的特征，采用一對特異性引物克隆成熟肽基因，PCR產物回收后直接與表達進行連接，構建重組表達載體；4)轉化與篩選將構建得到的重組表達載體轉化大腸桿菌BL21(DE3)pLysS，篩選工程菌并進行誘導表達；5)表達產物的分離純化采用誘導劑異丙基-β-D-硫代半乳糖苷誘導表達工程菌，超聲波破碎細胞，利用金屬螯合柱層析的方法純化抗菌蛋白，蛋白復性，融合標簽切除，獲得有活性的重組抗菌蛋白。
3.按照權利要求2所述中國明對蝦抗菌蛋白基因的重組表達，其特征在于所述蛋白復性采用含二硫鍵的原核表達重組蛋白高效復性的緩沖液系統，在復性緩沖溶液中添加氧化型谷胱甘肽和還原型谷胱甘肽；其濃度比復性緩中溶液∶氧化型谷胱甘肽∶還原型谷胱甘肽＝50∶1∶10；復性緩沖溶液pH值為7.2~7.4。
4.按照權利要求2所述中國明對蝦抗菌蛋白基因的重組表達，其特征在于所述一對特異性引物為CD-F5’CAG AAT AAA GAC GAT ACT CG 3’；CD-R5’CTA TCC CTC AGA ACC CAG 3’。
5.一種按照權利要求1所述中國明對蝦抗菌蛋白基因的應用，其特征在于對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的生長均具有抑制作用。
全文摘要
本發明涉及一種中國明對蝦抗菌蛋白基因及重組表達和應用。它具有序列表中SEQID No.1堿基序列及SEQ ID No.2所示的氨基酸序列；篩選出了利用原核表達系統進行體外重組表達抗菌蛋白的載體pCR
文檔編號C07K14/435GK1936000SQ200510047228
公開日2007年3月28日 申請日期2005年9月19日 優先權日2005年9月19日
發明者相建海, 張繼泉, 李富花, 王在照 申請人:中國科學院海洋研究所