一種異淀粉酶及其基因、含有該基因的工程菌及其應用
【專利摘要】本發明屬于應用工業微生物領域，公開了一種異淀粉酶及其基因、含有該基因的工程菌及其應用。本發明提供了淀粉水解酶系中關鍵酶之一的異淀粉酶基因，該基因全長為2436bp，G+C含量為66％，編碼811個氨基酸，其核苷酸序列為：SEQ ID NO.1所編碼的內切酶蛋白質氨基酸序列為：SEQ ID NO.2。利用該基因構建的工程菌株能高效表達異淀粉酶，該酶以土豆淀粉為測活底物，通過碘液檢測異淀粉酶的活性，其比活力高達70 600U/mg。利用基因生產的酶制劑可用于糧食加工、食品工業、釀造、發酵、紡織工業和醫藥等工業，在解決實際問題的同時還可以取得可觀的經濟效益。CCTCC NO：M2017
【專利說明】
一種異淀粉酶及其基因、含有該基因的工程菌及其應用
技術領域
[0001] 本發明屬于應用工業微生物領域，公開了一種異淀粉酶基因、含有該基因的工程 菌及其應用。
【背景技術】
[0002] 淀粉作為地球上含量最為豐富的聚合物之一，是由葡萄糖單體單元以葡萄糖苷鍵 連接而成的，根據糖苷鍵的區別分為兩種重要組分:直鏈淀粉(線性α_1，4鍵連接的葡聚糖） 和支鏈淀粉(線性α-l，4鍵連接的葡聚糖上連有α-l，6鍵的支鏈），雖然α-1，6鍵只占總糖苷 鍵的6%左右，使得淀粉糖鏈形成了分支結構。淀粉由于其結構的復雜性，單一酶類難以將 其徹底的水解，因此在淀粉處理過程中通常需要多種酶協同作用，包括淀粉酶以及淀粉 脫支酶等。
[0003] 異淀粉酶(EC 3.2.1.68)是一種主要的淀粉脫支酶，為糖原6-葡聚糖水解酶，對糖 原，支鏈淀粉以及極限糊精中的α-l，6_糖苷鍵具有不同程度的水解作用，但對普魯蘭多糖 則沒有水解作用。即僅能水解分支點的α-l，6糖苷鍵。異淀粉酶在淀粉深加工工業具有重要 的價值，可以與α -1，4-淀粉酶、糖化酶等淀粉酶配合使用生產葡萄糖、麥芽糖、部分麥芽寡 糖、環糊精以及抗性淀粉等產品，提高淀粉的轉化效率。基于異淀粉酶特殊的性質使其在不 同領域具有廣泛的應用前景，如在飼料中添加異淀粉酶可以提高日糧的消化利用率，在配 合其他淀粉水解酶處理淀粉過程中可以提高產物的生成率，作為酶制劑和加工助劑應用于 食品行業以及將異淀粉酶應用于淀粉膜改進方面的研究等。
[0004] 作為一種具有重要工業應用價值的淀粉脫支酶，異淀粉酶研究在國外已有60多年 的歷史。最早報道的是在1951年日本學者Maruo等在釀酒酵母中發現了一種胞內異淀粉酶。 Amemura等人在1988年首次對多支淀粉假單胞菌Pseudomonas amyloderamosa來源的異淀 粉酶的基因進行克隆和表達，目前，只有P.amyloderamosa來源的異淀粉酶實現了工業化生 產。我國異淀粉酶研究雖然相對較晚，但是也開展了廣泛的研究，王武等人1993年研究和討 論了一株產異淀粉酶短桿菌的篩選、誘變，Duan等人2013年將異淀粉酶與α-環糊精酶聯合 使用，顯著提高了環糊精的產量。目前，國內在不同來源的異淀粉酶產生菌以及異淀粉酶的 性質等異淀粉酶研究方面上雖然取得了較多的進展，但是至今還未實現工業化生產。同時 國內自主知識產權的異淀粉酶較少，受限于酶活力以及性質的限制，使得目前市場上的商 業化產品主要為進口酶制劑。

【發明內容】

[0005] 本發明的目的在于提供一種新的異淀粉酶基因，及其編碼的蛋白質。
[0006] 本發明的另一目的是提供含有該異淀粉酶基因的基因工程菌。
[0007] 本發明的又一目的是提供該基因的應用。
[0008] 異淀粉酶基因，其核苷酸序列為:SEQ ID Ν0.1，該基因全長(從起始密碼子到終止 密碼子)為2436bp，G+C含量為66%，編碼811個氨基酸。
[0009] 本發明所述的異淀粉酶基因編碼的異淀粉酶蛋白質，其氨基酸序列為：SEQ ID Ν0·2〇
[0010] 所述的異淀粉酶最適反應pH為7.0，最適反應溫度為45°C，并在20°C-40°C(lh)和 pH 6.0-10.0 (24h)之間保持活性穩定。
[0011] 含本發明所述異淀粉酶基因的重組質粒。
[0012] 所述的重組質粒優選將所述異淀粉酶基因克隆到pEFaA質粒中所得。
[0013] 含本發明所述的重組質粒的重組微生物。
[0014] 所述的重組微生物，優選以畢赤酵母為宿主菌。
[0015] 本發明所述異淀粉酶蛋白質在淀粉加工或工業生產方面的應用。
[0016] 本發明所述異淀粉酶蛋白質聯合α-l，4淀粉酶內切酶在產麥芽六糖過程中的應 用。
[0017]所述的α-1，4淀粉酶內切酶優選專利申請號為"201310043628.5"（國際申請號為 PCT/CN2013/078680)，名稱為"一種α-淀粉酶及其基因、含有該基因的工程菌及其應用"中 保護的α-l，4淀粉酶內切酶。該α-l，4淀粉酶內切酶的編碼基因如該專利序列表SEQ ID NO.3所示，其氨基酸序列如該專利序列表SEQ ID NO.4所示。表達方法、酶學性質、功能在該 專利中已公開，詳見該專利的公開文本。
[0018]有益效果
[0019] 1.本發明以粘細菌菌株EGB為材料，參考EGB基因組序列信息并結合PCR擴增，成功 獲得異淀粉酶基因序列。該基因全長（從起始密碼子到終止密碼子）為2436bp，G+C含量為 66%，編碼811個氨基酸。
[0020] 2.通過PCR技術擴增末端含Xhol和Xbal酶切位點的完整的異淀粉酶基因片段，將 它連接到畢赤酵母P · pastoris GS115高表達載體pEFaA(購自Novegen公司）的Xhol和Xbal 酶切位點上，轉化表達宿主菌P.pastoris GS115(購自Invitrogen公司），進行甲醇誘導表 達，誘導表達量為〇.5mg/L。
[0021] 3.本發明對異淀粉酶基因表達的產物，通過碘液方法對異淀粉酶進行酶活性測 定，該異淀粉酶能高效的水解可溶性淀粉、玉米淀粉、土豆淀粉和支鏈淀粉，在以土豆淀粉 為底物時的的比活力高達高達70 600U/mg。
[0022] 4.利用該基因構建的工程菌株能高效表達異淀粉酶，在淀粉加工過程中，該異淀 粉酶聯合α-l，4淀粉酶內切酶能夠有效提高淀粉的水解效率，水解產物中麥芽六糖的含量 相比較α-l，4淀粉酶內切酶單獨處理組提高了60%，與商業化脫支酶Pr〇mozyme?D2的40% 提高量相比較，顯示出較好的水解效率和水解穩定性。
【附圖說明】
[0023]圖1異淀粉酶基因的PCR擴增電泳圖
[0024] 1 :DL5000核酸Marker;2:異淀粉酶基因 PCR擴增
[0025]圖2異淀粉酶基因克隆的策略圖
[0026]圖3異淀粉酶基因在P.pastoris GS115(pEFaA)中高效表達實驗方案圖 [0027] 圖4重組異淀粉酶的SDS - PAGE電泳圖
[0028] M:標準蛋白Marker; 1:酵母誘導上清酶液;2:以淀粉平板的酶譜分析
[0029]圖5異淀粉酶酶學性質
[0030] a:異淀粉酶最適溫度;b:溫度穩定性;c:異淀粉酶最適pH; d: pH穩定性
[0031]圖6異淀粉酶聯合α_1，4淀粉酶內切酶在淀粉處理過程的應用 [0032] a:對照b:麥芽六糖淀粉酶處理;c:麥芽六糖淀粉酶與異淀粉酶聯合處理
[0033]生物材料保藏信息
[0034] Corallococcus coralloldes EGB,保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏地址為 中國武漢，武漢大學，保藏日期為2012年12月17日，保藏號為CCTCC N0:M2012528。
【具體實施方式】
[0035] 實施例1異淀粉酶基因的克隆及表達載體的構建
[0036] 1.1異淀粉酶基因的PCR擴增
[0037] 參考粘細菌EGB基因組序列并結合NCBI基因組信息進行0RF預測，以全長序列設計 異淀粉酶基因引物，以EGB菌(CCTCC NO:M2012528)的基因組DNA為模板，進行異淀粉酶基因 全長的PCR擴增，得到異淀粉酶基因的全長序列，所用引物為F和R，結果見圖1。具體過程參 照圖2。
[0038] F：ctcgagAAAAGAGAGGCTATGACCCCTCCCCGTCGTCAC(XhoI)(SEQ ID NO.5)
[0039] R：tctagaCTTGGCCACCAACACCAGC(XbaI)(SEQ ID NO.6)
[0040] 1.2E.coli DH10B電轉感受態的制備
[0041 ] 從-80°C冰箱中取菌種E. co 1 i DH10B劃線于新鮮的LB平板上，培養過夜，挑取直徑 約2mm菌落接入沒有添加 Mg2+的S0B試管，37 °C培養至0D600到達1.0后，以1/100的接種量接 入裝有l〇〇ml S0B培養基的0.5L搖瓶，18°C，220rpm培養至0D600到達0.7~0.8之間；將搖瓶 置于冰浴中，冷卻l〇min之后，4°C4000rpm離心5min收集菌體沉淀；等體積的滅菌超純水重 懸、洗滌菌體后，4 1€4000印111離心51^11收集菌體沉淀;重復洗滌一次；100111110%甘油重懸 菌體，4 °C4000rpm離心5min收集菌體沉淀;重復洗滌一次;小心棄上清，倒置離心瓶于滅菌 吸水紙上瀝干約lmin。每1000ml培養物用2ml 10%甘油小心重懸，每管100μ1分裝于離心管 后迅速放入-80 °C冰箱保存備用。
[0042] 1.3畢赤酵母感受態細胞制備
[0043]從接種在新鮮的YH)斜面上的畢赤酵母GS115挑取單菌落;接種單菌落至50mL YH) 培養基的250mL三角瓶中，28°C，200rpm，培養過夜至0D6Q()值在1.0-1.5之間；吸取培養液按 5 %接種量接種至50mL YH)培養基的250mL三角瓶中，28°C，200rpm，培養至0D6QQ值在0 · 3-0.5之間；4500rpm，離心5min，收集菌體;將菌體與新鮮配制的8mL酵母細胞感受態母液輕輕 混勾后，室溫放置30min，每10min輕輕搖勾一次;4500rpm，離心5min，收集菌體；用2mL的預 冷的1M山梨醇重懸，然后于4°C條件下，4000rpm，離心5min，收集菌體，重復三次;然后用100 yL預冷的1M山梨醇重懸，分裝至1.5mL離心管中，每管80yL，于-80 °C下保存。
[0044] 1.4重組質粒的構建
[0045] 將1 . 1中異淀粉酶基因 PCR擴增產物經過過柱回收之后與pMD19-T vector (TaKaRaCode: D102A)在連接液作用下，16 °C水浴過夜。酶連體系如下：
[0047] 將10μ1酶連產物加入到200μ1在冰上融化后的E.coli DH10B感受態細胞中，冰浴 30min，在42°C水浴鍋中熱激90s后。快速轉移到冰浴中冷卻1~2min，向每管中加入800μ1液 體LB培養基，37 °C搖床80_90rpm溫育45min，復蘇細胞。4000rpm離心3min，剩余200μ1感受態 細胞涂布于含l〇〇mg/l氨芐青霉素的LB瓊脂平板上，平板倒置于37°C培養箱培養。挑取經過 測序正確的轉化子并提取質粒。挑取單菌落在含氨芐青霉素的LB培養基中培養過夜， 12000rpm離心10min收集菌體，利用質粒提取試劑盒提取質粒，送上海英濰捷基生物有限公 司測序。結果該基因全長(從起始密碼子到終止密碼子)為2436bp，G+C含量為66%，序列為 SEQ ID NO. 1;該基因編碼811個氨基酸，其氨基酸序列為SEQ ID N0.2。
[0048] 并將提取的重組質粒用Xba I和Xho I雙酶切，同時將質粒pEFa A也用相同的Xba I和 Xhol進行雙雙酶切。
[0049] 酶切體系：
[00511在37°C水浴中，反應3h以上。酶切產物進行0.75%的瓊脂糖凝膠電泳切膠回收 [0052] 1.5酶連轉化 [0053] 體系如下：
[0055]將體系放置于16 °C水浴鍋中過夜反應。將酶連產物轉化到E.coli DH10B中后，涂 布于含有終濃度為25yg/mL的Zeocin的LB培養基平板上，挑取取轉化子質粒并酶切驗證，測 序正確后保存于終濃度為15 %甘油的-80 °C低溫冰箱中；構建成功的重組質粒命名為pEFa A-IaM〇
[0056] 1 · 6重組質粒pEFaA- IaM的線性化
[0057]采用限制性內切酶Sea I對正確的重組質粒進行線性化，將體系放置于37°C水浴 條件下反應8h后回收酶切產物。
[0058] 反應體系如下：
[0060]本實驗采用乙醇沉淀法純化和回收線性化產物，具體方法如下：
[0061 ] 1.加入預冷的1/10體積的3M醋酸鈉 (pH 5.2)和2倍體積的無水乙醇，輕輕混勻后 放置于_20°C下20min;
[0062] 2.然后于4°C條件下12000rpm，離心10min，棄上清液；
[0063] 3.向離心管中加入2倍體積的預冷70 %乙醇，12000rpm，離心3min，重復一次，棄上 清；
[0064] 4.待乙醇揮發干凈后，加入30yL無菌水溶解。
[0065] 1.7電轉化
[0066] 將0.2cm電轉化杯放置于冰上5min，打開電轉化儀，調整所需電轉化參數：電壓 1.5kV，電阻250 Ω，電容25yF;向制備好的畢赤酵母GS115感受態細胞中加入l-3yg DNA片 段，輕輕混勻后放置于冰上5min后轉移至電轉杯中；按照儀器使用說明書進行電轉操作；電 轉化后立刻向電轉杯中加入lmL預冷的1M山梨醇，轉入1.5mL離心管中，放置在30 °C培養箱 中靜置培養lh;室溫下4000rpm下離心3min，棄上清，收集菌體后用200yL YPDS重懸;將100μ L細胞懸浮液涂布在含有100yg/mL Zeocin的ΥΗ)平板上;將平板放置在30°C下培養3-4天， 待菌體長出。
[0067]將平板上長出的單菌落挑至含有100yg/mL Zeocin的YH)平板上，待長出后使用目 的基因的特征引物進行菌落PCR，以檢測目的基因是否整合到酵母染色體中；25yL反應體 系，退火溫度60°C，延伸時間lmin 3〇S(3PCR產物用0.75%瓊脂糖凝膠電泳檢測0嫩片段大 小。陽性克隆命名為P.pastoris GS115(pEFaA-IaM)〇
[0068] 實施例2·異淀粉酶基因在P.pastoris GS115(pEFaA_lam)中的高效表達
[0069] 2.1異淀粉酶IaM的表達
[0070] 將表達菌株P·pastoris GS115(pEFaA_IaM)劃線平板培養，挑取單菌落至50mL液 體Yro三角瓶中，28°C，200rpm培養24h;然后在室溫下4000rpm，離心5min，棄去上清液，將菌 體用25mL BMMY培養基重懸，開始誘導酵母細胞的表達;繼續28°C條件下，200rpm培養，每隔 24h補加甲醇至終濃度為0.5% (v/v)，共培養96h;待培養結束后，檢測目的蛋白的酶活，結 果發現該異淀粉酶的表達量達到〇. 5yg/mL。
[0071] 2.2蛋白質電泳SDS-PAGE鑒定和復性酶譜
[0072] 蛋白樣品在12 %的聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS - PAGE )，電泳完成后，對含有酶樣品 的泳道進行割膠處理，放置于含有預冷的2.5%Triton-X 100的平板中，4°C放置30min后， 更換Triton-X100,放置30min;然后將條帶轉移到含有預冷的0.1M pH 7.0Tris-HCl的緩沖 液中，4°C，30min后，更換緩沖液，繼續放置30min;同樣的操作放置在50mM pH 7.0Tris-HCl 緩沖液中，時間間隔為15min;將復性好的條帶鋪展在溶解于50mM pH 7.0Tris-HCl緩沖液 的可溶性淀粉固體平板上，37°C反應lOmin后，滴加碘液進行顯色。由于異淀粉酶IaM能水解 淀粉成低聚糖物質使得其不能和碘液發生顏色反應，所以條帶上有活性的異淀粉酶IaM處 不會產生藍紫色反應，通過這一現象可檢測電泳后條件的酶是否具有活性。圖4顯示表達后 的異淀粉酶條帶較為單一，酶譜結果顯示該單一條帶為異淀粉酶表達目的條帶。
[0073] 實施例3.異淀粉酶酶學性質的研究
[0074] 3 · 1溫度對酶活力的影響
[0075] 最適反應溫度的測定：在不同溫度（20 Γ、30 Γ、40 Γ、45 Γ、50 Γ、55 Γ、60 Γ、70 °C)，pH7.0的條件下測定重組酶純化酶的活性，將最高酶活力設定為100% (圖5a)。熱穩定 性的測定:將重組酶純化酶液在20 °C、30 °C、40°C、45°C、50°C、60°C、70°C，pH7 · 0下保溫lh， 每隔lOmin取樣，于冰上迅速冷卻，各自測定殘余酶活力，以未保溫的酶活力為100% (圖 5b)。經測定該淀粉酶最適反應溫度為45°C，并在20°C_45°C之間保持穩定。
[0076] 3·2ρΗ對酶活力的影響
[0077] 最適反應pH的測定:在不同pH值(5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0)，50°(：下測定重組 酶純化酶液的活性，將最高活力設定為100% (圖5c) 穩定性的測定:將重組酶純化酶液 在 口!13.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0下，4°(：保持2411，后各自測定其殘余活力， 以PH7.0的酶活力為100% (圖5d)。經測定該淀粉酶最適反應pH為6.0，并在pH 6.0-11.0保 持穩定。
[0078] 3.3異淀粉酶底物特異性
[0079]以可溶性淀粉，土豆淀粉，玉米淀粉，支鏈淀粉，直鏈淀粉，普魯蘭多糖為底物，對 表達的異淀粉酶進行底物特異性分析(如表1)，結果發現該異淀粉酶對可溶性淀粉，土豆淀 粉，玉米淀粉，支鏈淀粉等底物均具有活性，其中土豆淀粉為底物時活性最高。以土豆淀粉 為測活底物，通過碘液檢測異淀粉酶的活性，酶活單位定義為每分鐘OD610值上升0.01為一 個活力單位，測得異淀粉酶的比活力為70 600U/mg。
[0080]表 1
[0082] 實施例4.異淀粉酶聯合相關淀粉水解酶在淀粉加工過程中的應用
[0083] 由于淀粉中含有大量的支鏈淀粉，導致淀粉酶解不完全，影響水解產物的含量，而 異淀粉酶為專一性切割淀粉支鏈的水解酶，使淀粉的支鏈化程度減少，提高酶解效率。因此 異淀粉酶配合其他淀粉水解酶在淀粉加工過程中的應用能夠顯著提高淀粉的利用效率，提 高產物的生產量。
[0084]根據專利201310043628.5引述，α-1，4淀粉酶內切酶為一個高產麥芽六糖的淀粉 水解酶。本專利采用該α-1，4淀粉酶內切酶與異淀粉酶配合使用，以提高淀粉處理產物中的 麥芽六糖含量。以土豆淀粉為底物，每g土豆淀粉中加入8U的異淀粉酶和1U的α-1，4淀粉酶 內切酶，45°C處理lh。同時商業化的普魯蘭酶Promozyme?D2作為處理對照，添加酶量和處 理條件參考異淀粉酶。高效液相色譜檢測水解產物中麥芽六糖的含量。液相色譜條件:安捷 倫液相色譜，Cosmosil Sugar-D氨基柱，ELSD ES2000蒸發光散射檢測器，流動相為乙腈/水 = 65/35(v/v)，流速是lmL/min，柱溫30°C。圖6所示，異淀粉酶與α-l，4淀粉酶內切酶聯合處 理，與單一α-l，4淀粉酶內切酶處理相比較，麥芽六糖的含量提高0.6倍，相比商業化普魯蘭 酶0.4倍的提高量，本專利所述的異淀粉酶具有較為高效的催化效率，同時該異淀粉酶在聯 合加工淀粉過程中的水解形式在整個水解過程中與商業化普魯蘭酶相比較也較為穩定。
【主權項】
1. 一種異淀粉酶基因，其核苷酸序列為:SEQ ID NO. 1。2. 權利要求1所述的異淀粉酶基因編碼的異淀粉酶蛋白質，其氨基酸序列為：SEQ ID Ν0·2〇3. 含權利要求1所述異淀粉酶基因的重組質粒。4. 根據權利要求3所述的重組質粒，其特征在于所述的重組質粒是將權利要求1所述異 淀粉酶基因克隆到質粒PEFaA中所得。5. 含權利要求1所述的異淀粉酶基因的重組微生物。6. 根據權利要求5所述的重組微生物，其特征在于主要以畢赤酵母為宿主菌。7. 權利要求2所述異淀粉酶蛋白質聯合其他淀粉水解相關酶在淀粉加工或工業生產方 面的應用。8. 根據權利要求7所述的應用，其特征在于所述的其它淀粉水解相關酶為α-l，4淀粉酶 內切酶。9. 權利要求1所述異淀粉酶基因在淀粉加工、食品以及飼料等領域的基因工程應用。10. 權利要求2所述異淀粉酶蛋白質作為酶制劑在淀粉加工、食品以及飼料等領域的生 產應用。
【文檔編號】A23K20/189GK105886519SQ201610368731
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年5月30日
【發明人】崔中利, 李周坤, 冀凱, 黃彥
【申請人】南京農業大學