一株雙基因敲除工程菌及其構建方法和在發酵生產1,3-丙二醇中的應用
【專利摘要】本發明公開了一株雙基因敲除工程菌及其構建方法和在發酵生產1,3?丙二醇中的應用。將產1,3?丙二醇的野生型菌株的基因組中的D?乳酸脫氫酶基因和α?乙酰乳酸合成酶基因同時敲除后獲得的工程菌株，所述的產1,3?丙二醇的野生型菌株是以甘油為原料發酵生產1,3?丙二醇。同時敲除乳酸脫氫酶及乙酰乳酸合成酶兩個基因后獲得的工程菌應用在發酵法生產1,3?丙二醇過程中，在發酵液中1,3?丙二醇占代謝產物比例增加，乳酸與2,3?丁二醇合成同時大幅度減少，其它副產物沒有顯著增加。本發明將在微生物發酵法生產1,3?丙二醇過程中發揮提高工程菌種合成1,3?丙二醇所占比例、降低合成副產物比例的作用，有利于降低生產成本，具有重要應用前景。
【專利說明】
一株雙基因敲除工程菌及其構建方法和在發酵生產1 ,3-丙二 醇中的應用
技術領域
[0001] 本發明屬于生物技術領域，具體涉及一株同時敲除乳酸脫氫酶和乙酰乳酸合成酶 基因的工程菌及其構建方法和在發酵生產1，3-丙二醇中的應用。
【背景技術】：
[0002] 1，3_丙二醇（PD0)是一種重要的化工原料，可作為有機溶劑，應用于耐壓高潤滑 劑、染料、油墨、防凍劑等行業。PD0可用來合成聚酯和聚氨酯、雜環、藥物中間體等，主要用 于合成聚對苯二甲酸丙二醇酯(PTThPTT是繼50年代聚對苯二甲酸乙二醇酯(PET)、70年代 聚對苯二甲酸丁二醇酯(PBT)之后實現工業規模的新的可成纖聚酯高分子材料，是一種極 有發展前途的新型聚酯材料。1998年PTT被美國評為六大石化新產品之一。PTT與PETJBT相 比除具有聚酯的耐化學性外，還具有其它一些更優良的特性。如尼龍的彈性恢復性，在全范 圍無需添加特殊化學藥品即能呈現良好的連續印染特性，抗紫外、臭氧和氮氧化合物的著 色性，抗內應力，低水吸附、低靜電以及良好的可生物降解性，可循還利用性等。由于PTT的 具有以上優良特性，它在地毯工業、服裝材料、工程熱塑料以及其它眾多領域有著很廣泛的 應用。
[0003] 生產PTT纖維的關鍵在于單體原料PD0的來源。PTT占領市場的關鍵在于價格，而 PTT的價格主要取決于roo的價格。由于不能廉價制得roo，制約了 PTT的研制和市場開拓。直 到90年代中期PDO實現了工業化生產，使得PDO價格大大降低，PTT才開始工業化生產和應 用。
[0004] 杜邦和殼牌兩家跨國公司曾采用化學合成路線，以環氧乙烷或丙烯為原料生產 pdo。化學合成法生產roo的缺點是副產物多，選擇性和產率較低，操作條件需要高溫高壓， 設備投資巨大，原料不可再生;同時由于產量有限，長期以來roo售價偏高。
[0005] 目前1，3_丙二醇的生產方法主要是微生物發酵法。與化學合成法相比，微生物發 酵法生產1，3_丙二醇具有顯著的優點：1、利用成本較低的可再生資源(如甘油、玉米、淀粉） 為原料;2、生產條件溫和，操作簡便，不需貴重金屬催化劑;3、選擇性好，副產物較少，易于 分離純化;4、環境污染小。微生物發酵法是以生物技術為特征的"綠色工業"向傳統石油化 工提出的強有力的挑戰，具有重要的現實意義，因而越來越受到重視。
[0006] 微生物發酵法生產1，3_丙二醇是利用微生物發酵甘油產生。至今所有被發現的1， 3-丙二醇生產菌種均為細菌，其中克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、弗氏梓檬酸桿菌 (Citrobacter freudii)和丁酸梭菌（Clostridium butyricum)具有較高的 1，3_丙二醇轉 化率和1，3-丙二醇生產強度，具有較高的開發前景，從而得到了較多關注。
[0007] 目前被用來生產1，3_丙二醇的克雷伯氏菌主要分離自土壤環境中。克雷伯氏菌只 能利用甘油（不能利用糖類)產生1，3_丙二醇。在產生1，3_丙二醇的過程中，甘油發生岐化 反應，氧化途徑中的產物與糖類發酵產物一致，并產生供細胞生長所必需的ATP，在氧化產 物形成的同時釋放還原力NADH;還原途徑則消耗氧化途徑中多余的還原力，生成1，3_丙二 醇。氧化途徑中甘油先被氧化生成丙酮酸;丙酮酸可能轉化為多種發酵副產物，如乳酸、2， 3_ 丁二醇、丁二酸、乙酸、乙醇等。1摩爾丙酮酸生成1摩爾乳酸的過程要消耗1摩爾還原力，2 摩爾丙酮酸生成1摩爾2,3_丁二醇的過程要消耗1摩爾還原力，而1摩爾丙酮酸生成琥珀酸 的過程要消耗2摩爾還原力；丙酮酸被丙酮酸甲酸裂解酶催化分解為乙酰CoA和甲酸，甲酸 再分解為⑶ 2和H2;乙酰CoA在經乙酰磷酸形成乙酸的過程中生成過量的ATP，而在經乙醛形 成乙醇的反應中要消耗2摩爾還原力。還原途徑包括兩步反應:第一步，由依賴于輔酶B 12的 甘油脫水酶催化甘油脫水生成3-羥基丙醛;第二步，由1，3-丙二醇氧化還原酶催化3-羥基 丙醛還原生成1，3-丙二醇，此過程消耗1摩爾還原力。
[0008] 根據克雷伯氏菌發酵甘油的代謝途徑，在發酵過程中，細胞利用底物甘油發酵的 代謝產物除主產物1，3_丙二醇外，還有乳酸、2,3_丁二醇、乙醇、乙酸、丁二酸等主要副產 物。副產物合成對發酵生產1，3-丙二醇主要具有三方面不利影響：1)消耗底物甘油，降低底 物對1，3_丙二醇的轉化率;2)積累較高濃度副產物時對細胞繼續發酵形成較強抑制作用， 妨礙得到高濃度1，3_丙二醇發酵液，同時也降低了發酵液中目標產物1，3_丙二醇在整個代 謝產物中的所占比例;3)從發酵液提取1，3_丙二醇時，副產物較多會增加分離提純1，3_丙 二醇難度與成本。在主要副產物中，又以乳酸和2,3_丁二醇的產量最多，文獻報道野生型克 雷伯氏菌發酵甘油產生1，3_丙二醇的過程中副產物乳酸產量最高可達40g/L以上;其次是 2,3_ 丁二醇，產量最高可達30g/L以上。因此，減少副產物的生成，尤其是減少乳酸和2,3_ 丁 二醇的生產，對提高發酵甘油生成1，3-丙二醇水平，降低發酵生產1，3-丙二醇成本，具有重 要的意義。研究報道單獨敲除乳酸合成代謝途徑中乳酸脫氫酶基因，可以大幅度減少乳酸 合成，但同時2,3_ 丁二醇合成大幅度增加，說明切斷乳酸合成代謝途徑，代謝流主要轉向2， 3_丁二醇合成，不能明顯提升1，3_丙二醇在總的代謝產物中所占比例；而單獨敲除2,3_丁 二醇合成代謝途徑中的關鍵催化酶基因，可以大幅度減少2,3_丁二醇合成，但同時乳酸合 成大幅度增加。

【發明內容】
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[0009] 本發明的目的是提供一種同時敲除乳酸與2,3_ 丁二醇合成代謝途徑編碼基因的 雙基因敲除工程菌及其構建方法及其在生產1，3_丙二醇中應用。
[0010]我們的前期研究發現敲除克雷伯氏菌乙酰乳酸合成酶編碼基因，發酵液中合成乳 酸濃度可達到野生菌的2倍以上，說明切斷2,3_ 丁二醇合成代謝途徑，代謝流主要轉向乳酸 合成，也不能明顯提升1，3_丙二醇在總的代謝產物中所占比例。如果同時切斷乳酸與2,3_ 丁二醇合成代謝途徑，代謝流是主要轉向1，3_丙二醇合成還是轉向其它代謝副產物合成途 徑？如轉向合成乙酸、乙醇或丁二酸？是不是可以提升1，3_丙二醇在所有代謝產物中的比 例?鑒于克雷伯氏菌代謝網絡的復雜性，存在多種代謝副產物合成途徑，加上對雙基因敲除 工程菌的甘油代謝動力學的不可預測性，我們不能判定同時切斷乳酸與2,3-丁二醇合成代 謝途徑對克雷伯氏菌發酵甘油生產1，3_丙二醇的影響。由于對克雷伯氏菌進行連續基因敲 除的遺傳操作的存在一定技術難度，因此研究同時敲除乳酸脫氫酶與乙酰乳酸合成酶對發 酵生產1，3-丙二醇的影響具有創新性。
[0011]本發明的雙基因敲除工程菌，其是通過以下方法構建的，是將產1，3_丙二醇的野 生型菌株的基因組中的D-乳酸脫氫酶基因和α-乙酰乳酸合成酶基因同時敲除后獲得的工 程菌株，所述的產1，3-丙二醇的野生型菌株是以甘油為原料發酵生產1，3-丙二醇。
[0012] 所述的1，3_丙二醇的野生型菌株優選為克雷伯氏菌屬(Klebsiella)的細菌，進一 步優選為肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae) 〇
[0013] 所述的將肺炎克雷伯氏菌的乳酸脫氫酶基因和乙酰乳酸合成酶基因同時敲除，優 選通過以下方法敲除：
[0014] a、PCR擴增肺炎克雷伯氏菌的乳酸脫氫酶基因，將其與克隆載體相連，然后再導入 含Red重組酶質粒pKD46的大腸桿菌Dh5a中，得到含有Red重組酶質粒pKD46及乳酸脫氫酶基 因克隆載體的大腸桿菌Dh5a;
[0015] b、設計與乳酸脫氫酶基因序列同源的兩側翼各~40bp的引物，以質粒pIJ773為模 板，PCR擴增Apra+篩選抗性基因盒，純化得到兩側與乳酸脫氫酶基因同源的Apra+篩選抗性 基因盒DNA片段；
[0016] c、將步驟b獲得的兩側與乳酸脫氫酶基因同源的Apra+篩選抗性基因盒DNA片段電 轉化導入含有Red重組酶質粒pKD46及乳酸脫氫酶基因克隆載體的大腸桿菌Dh5a中；誘導 Red重組酶表達，兩側與乳酸脫氫酶基因同源的Apra+篩選抗性基因盒DNA片段與乳酸脫氫 酶基因克隆載體之間基因同源重組，通過Apra+抗性篩選出含重組片段的克隆菌；
[0017] d、通過PCR擴增兩端為長側翼同源片段，中間為Apra+抗性篩選標記基因盒的DNA 片段；
[0018] e、將步驟d獲得的DNA片段電轉化導入含有Red重組酶質粒pi J790的野生型克雷伯 氏菌中，誘導Red重組酶表達，兩端長側翼同源片段與乳酸脫氫酶基因之間發生基因同源重 組，將Apra+抗性基因盒插入到乳酸脫氫酶基因中間，通過Apra+抗性篩選出重組菌，即乳酸 脫氫酶基因失活的克雷伯氏菌；
[0019] f、向步驟d獲得的乳酸脫氫酶基因失活的克雷伯氏菌中電轉入PCP20質粒，誘導重 組酶表達，通過Apra+抗性基因盒兩端的FRT位點刪除Apra+抗性基因，得到乳酸脫氫酶基因 失活的克雷伯氏菌突變株，然后將含有Red重組酶的質粒pIJ790轉化進入乳酸脫氫酶基因 失活的克雷伯氏菌突變株，得到含有Red重組酶質粒pIJ790的乳酸脫氫酶基因失活的克雷 伯氏菌突變株；
[0020] g、PCR擴增肺炎克雷伯氏菌的乙酰乳酸合成酶基因，將其與克隆載體相連，然后再 導入含Red重組酶質粒pKD46的大腸桿菌Dh5a中，得到含有Red重組酶質粒pKD46及乙酰乳酸 合成酶基因克隆載體的大腸桿菌Dh5a;
[0021] h、設計與乙酰乳酸合成酶基因同源的兩側翼各~40bp的引物，以質粒PIJ773為模 板，PCR擴增Apra+篩選抗性基因盒，純化該兩側與乙酰乳酸合成酶基因同源的Apra+篩選抗 性基因盒DNA片段；
[0022] i、將步驟h獲得的兩側與乙酰乳酸合成酶基因同源的Apra+篩選抗性基因盒DNA片 段電轉化導入含有Red重組酶質粒pKD46及乙酰乳酸合成酶基因克隆載體的大腸桿菌Dh5a 中，誘導Red重組酶表達，兩側與乙酰乳酸合成酶基因同源的Apra+篩選抗性基因盒DNA片段 與乙酰乳酸合成酶基因克隆載體之間基因同源重組，通過Apra+抗性篩選出含重組片段的 克隆菌；
[0023] j、通過PCR擴增兩端為長側翼同源片段，中間為Apra+抗性篩選標記基因盒的DNA 片段；
[0024] k、將步驟j獲得的DNA片段電轉化導入含有Red重組酶質粒pIJ790的乳酸脫氫酶基 因失活的克雷伯氏菌突變株中，誘導Red重組酶表達，兩端長側翼同源片段與乙酰乳酸合成 酶基因之間發生基因同源重組，將Apra+抗性基因盒插入到乙酰乳酸合成酶基因中間，通過 Apra+抗性篩選出重組菌，即乳酸脫氫酶基因和乙酰乳酸合成酶基因都失活的克雷伯氏菌；
[0025] 1、向步驟k獲得的乳酸脫氫酶基因和乙酰乳酸合成酶基因都失活的克雷伯氏菌中 電轉入PCP20質粒，誘導重組酶表達，通過Apra+抗性基因盒兩端的FRT位點刪除Apra+抗性 基因，獲得乳酸脫氫酶基因與乙酰乳酸合成酶基因都失活的雙基因敲除工程菌。
[0026] 所述的步驟a-Ι的使用的與克雷伯氏菌乳酸脫氫酶基因與乙酰乳酸合成酶基因的 同源序列是乳酸脫氫酶基因與乙酰乳酸合成酶基因的哪一部分序列并不重要，只要是乳酸 脫氫酶基因與乙酰乳酸合成酶基因其中的一部分即可。
[0027] 所述的克隆菌、質粒載體:E.coli Dh5a、克隆載體如pMD18-T、質粒pIJ773、質粒 pKD46、質粒pCP20等，可從商業公司購買。
[0028] 本發明還提供了敲除乳酸與2,3_ 丁二醇代謝途徑基因的雙基因敲除工程菌在生 產1，3_丙二醇中的應用。
[0029] 優選，所述的雙基因敲除工程菌在生產1，3_丙二醇中的應用，雙基因敲除工程菌 在發酵過程中底物甘油濃度為l_50g/L，通氣速度為1.0-3.Ovvm，溫度為30-40攝氏度，pH為 6·0 _8·0 〇
[0030] 本發明利用同源重組、基因敲除的方法使產1，3_丙二醇的野生型菌株中的乳酸脫 氫酶、乙酰乳酸合成酶基因失活，從而得到乳酸與2,3_ 丁二醇代謝途徑被失活的基因工程 菌。用本發明的工程菌進行1，3-丙二醇的發酵生產，乳酸與2，3-丁二醇合成大幅度減少，1， 3_丙二醇在發酵甘油得到的代謝產物中的所占比例顯著增加；由于副產物乳酸與2,3_丁二 醇減少，1，3_丙二醇比例增加，降低了生產成本。實驗證明，將本發明的工程菌按常規方法 發酵36小時，1，3-丙二醇在發酵甘油主要代謝產物中的質量比例由55.1 %提高到68.2%。 本發明將在微生物發酵法生產1，3_丙二醇的工業化生產中發揮重要作用，具有重要的應用 前景。
【附圖說明】：
[0031] 圖1是敲除乳酸脫氫酶基因（LDH)示意圖；
[0032 ]圖2是敲除乙酰乳酸合成酶基因（budB/ALS)示意圖。
【具體實施方式】：
[0033]以下實施例是對本發明的進一步說明，而不是對本發明的限制。
[0034]實施例1:乳酸合成代謝途徑關鍵基因一乳酸脫氫酶基因被失活的肺炎克雷伯氏 菌突變株的構建。出發菌株野生肺炎克雷伯氏菌，構建過程如圖1所示。
[0035] (1)克隆乳酸脫氫酶基因 LDH
[0036] 根據乳酸脫氫酶基因 LDH的DNA序列(GenBank號：CP000647.1)設計引物，PCR擴增 基因序列，引物序列如下：上游引物LDH-F: 5 ' -CCTCGGACATTTCCTGTTAAT-3 '）與下游引物 LDH-R: (5 '-GGCAAACGCTGCAGCGAGCAG-3 '）。以野生型肺炎克雷伯氏菌(保藏于中國典型培養 物保藏中心，保藏編號為:CCTCC Μ 2011075)基因組DNA為模板，在引物LDH-F和LDH-R的引 導下，PCR擴增乳酸脫氫酶基因 LDH的核酸序列，PCR擴增條件為：先95°C3min;然后94°C 111^11，55°(：11^11，721€2.51^11，共35個循環；最后72°(：1〇1^11。反應結束后，將?0財廣增產物進 行1.5 %瓊脂糖凝膠電泳，回收并純化約210 0 b p目的D N A片段，將其克隆入載體p M D18 - T (TaKaRa公司）中，將重組產物轉化大腸桿菌Dh5a感受態細胞，篩選陽性轉化子，提取質粒， 通過酶切及測序鑒定，表明獲得了插入序列正確的重組載體，命名為ρΤ-LDH質粒。由此獲得 含有pT-LDH質粒的大腸桿菌Dh5a，再將含有Red重組酶質粒pKD46轉化進入該含有pT-LDH質 粒的大腸桿菌Dh5a中，由此獲得含有Red重組酶質粒pKD46及乳酸脫氫酶基因克隆載體的大 腸桿菌Dh5a。
[0037] (2)構建以乳酸脫氫酶基因 LDH序列為側翼的Apra抗性基因盒
[0038]合成弓| *LDH-Apra-F:5'_ gaactggaattcttcgatttcctgctgacagcgaagactgTTCCGGGGATCCGTCGACC-3 '；LDH-Apra-R:5 '-agtggtctccgaaatgctgatcagcgcctcggcggtgaggGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3 '。以LDH-Apra-F， LDH-Apra-R為引物，以質粒p IJ773為模板，PCR擴增Apra+篩選抗性基因盒，得到約1400bp的 DNA片段，其兩側各40bp序列與乳酸脫氫酶基因 LDH序列同源，中間為Apra+篩選抗性基因 盒。回收純化該DNA片段，用于下一步構建長側翼LDH同源序列的抗性基因盒。
[0039]將以上純化得到的DNA片段電轉化導入含有Red重組酶質粒pKD46及乳酸脫氫酶基 因克隆載體的大腸桿菌Dh5a中；誘導Red重組酶表達，兩側與乳酸脫氫酶基因同源的Apra+ 篩選抗性基因盒DNA片段與乳酸脫氫酶基因克隆載體之間基因同源重組，通過Apra+抗性篩 選出含重組Apra+抗性基因盒的克隆菌；以LDH-F:5'-CCTCGGACATTTCCTGTTAAT-3'與LDH-R: (5 ' -GGCAAACGCTGCAGCGAGCAG-3 '為引物，以上一步克隆菌為模板，通過PCR獲得長側翼LDH 同源序列的抗性基因盒LDH-Apra-LDILPCR擴增條件為：先95°C3min;然后94°C lmin，55°C lmin，72°C4min，共35個循環;最后72°C lOmin。反應結束后，將PCR擴增產物進行1.5 %瓊脂 糖凝膠電泳，回收并純化約2700bp目的DNA片段。該DNA片段左側翼LDH同源序列約為500bp， 右側翼LDH同源序列約為750bp，中間為約1400bp的Apra抗性基因盒。該具長側翼LDH同源序 列的抗性基因盒LDH-Apra-LDH用于下一步構建乳酸脫氫酶基因失活的工程菌。
[0040] (3)構建以乳酸脫氫酶基因失活的克雷伯氏菌
[0041] 將上一步獲得的具長側翼LDH同源序列的Apra抗性基因盒LDH-Apra-LDH電轉化導 入含有Red重組酶質粒pIJ790的野生型克雷伯氏菌中；誘導Red重組酶表達，兩端長側翼同 源片段與乳酸脫氫酶基因相應序列之間發生基因同源重組，將Apra抗性基因盒插入到乳酸 脫氫酶基因中間，通過Apra抗性(50ug/ml)篩選出重組菌，即乳酸脫氫酶基因失活的克雷伯 氏菌;通過傳代使PIJ790質粒丟失，由此獲得乳酸脫氫酶基因失活的克雷伯氏菌。
[0042] (4)消除Apra抗性基因盒
[0043]將PCP20質粒電轉化入上一步獲得的乳酸脫氫酶基因失活的克雷伯氏菌中，誘導 重組酶表達，使兩個FRT序列之間的Apra抗性基因盒消除，得到消除了 Apra抗性基因盒的乳 酸脫氫酶基因失活的克雷伯氏菌;通過傳代使PCP20質粒丟失。
[0044] 通過以上4個操作步驟，獲得乳酸合成代謝途徑關鍵基因一乳酸脫氫酶基因失活 的肺炎克雷伯氏囷關變株。
[0045]將含有Red重組酶質粒pIJ790轉化進入乳酸脫氫酶基因失活的肺炎克雷伯氏菌突 變株中，得到含有Red重組酶質粒pIJ790的已經失活乳酸脫氫酶的克雷伯氏菌。
[0046] 實施例2:2，3_丁二醇合成代謝途徑關鍵基因一乙酰乳酸合成酶基因被失活的肺 炎克雷伯氏菌突變株的構建。構建過程如圖2所示。
[0047] 出發菌株是實施例1得到的乳酸脫氫酶基因失活的肺炎克雷伯氏菌突變株，構建 過程如圖2所示。
[0048] (1)克隆乙酰乳酸合成酶基因 ALS
[0049] 根據乙酰乳酸合成酶基因 ALS的DNA序列（GenBank號：CP006738.1)設計引物，PCR 擴增基因序列，引物序列如下：上游引物ALS-F:5'-atggacaaacagtatccggtacgc_3'與下游 引物ALS-R: 5 ' -ttacagaatctgactcagatgcag-3 '。以野生型肺炎克雷伯氏菌(保藏于中國典 型培養物保藏中心，保藏編號為:CCTCC Μ 2011075)基因組DNA為模板，在引物ALS-F和ALS-R的引導下，PCR擴增乙酰乳酸合成酶基因 ALS的核酸序列，PCR擴增條件為:先95 °C3min;然 后94°(：1111丨11，55°(：1111丨11，721€2.〇111丨11，共33個循環 ；最后72°(：1〇1^11。反應結束后，將?0財廣增 產物進行1.5 %瓊脂糖凝膠電泳，回收并純化約15 0 0 b p目的D N A片段，將其克隆入載體 PMD18-T (TaKaRa公司）中，將重組產物轉化大腸桿菌Dh5a感受態細胞，篩選陽性轉化子，提 取質粒，通過酶切及測序鑒定，表明獲得了插入序列正確的重組載體，命名為ρΤ-ALS質粒。 由此獲得含有pT-ALS質粒的大腸桿菌Dh5a，再將含有Red重組酶質粒pKD46轉化進入該含有 pT-ALS質粒的大腸桿菌Dh5a中，由此獲得含有Red重組酶質粒pKD46及乙酰乳酸合成酶基因 克隆載體的大腸桿菌Dh5a。
[0050] (2)構建以乙酰乳酸合成酶基因 ALS序列為側翼的Apra抗性基因盒
[0051] 合成弓| *ALS-Apra-F:5'_ CGCCGCGCCGGATGATGCCATCGACCAGGTGGCGAAGCTTTTCCGGGGATCCGTCGACC-3 '；ALS-Apra-R:5 '-CGATATTTTGCGCCAGCTTGTTGAGAGTGCCGGCGATATCGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3 '。以ALS-Apra-F， ALS-Apra-R為引物，以質粒p IJ773為模板，PCR擴增Apra+篩選抗性基因盒，得到約1400bp的 DNA片段，其兩側各40bp序列與乙酰乳酸合成酶基因序列同源，中間為Apra+篩選抗性基因 盒。回收純化該DNA片段，用于下一步構建長側翼ALS同源序列的抗性基因盒。
[0052]將以上純化得到的DNA片段電轉化導入含有Red重組酶質粒pKD46及乙酰乳酸合成 酶基因克隆載體的大腸桿菌Dh5a中；誘導Red重組酶表達，兩側各40bp與乙酰乳酸合成酶基 因同源序列的Apra+篩選抗性基因盒DNA片段與乙酰乳酸合成酶基因克隆載體之間基因同 源重組，通過Apra +抗性篩選出含重組Apra +抗性基因盒的克隆菌；以ALS-F:5'_ atggacaaacagtatccggtacgc-3 ' 與ALS-R: 5 ' -ttacagaatctgactcagatgcag-3 ' 為弓|物，以上 一步克隆菌為模板，通過PCR獲得長側翼ALS同源序列的抗性基因盒ALS-Apra-ALSICR擴增 條件為：先 95°C3min;然后 94°(：1111丨11，55°(：1111丨11，721€3111丨11，共34個循環；最后72°(：1〇111丨11。反 應結束后，將PCR擴增產物進行1.5 %瓊脂糖凝膠電泳，回收并純化約2500bp目的DNA片段。 該DNA片段左側翼ALS同源序列約為400bp，右側翼ALS同源序列約為700bp，中間為約1400bp 的Apra抗性基因盒。該具長側翼ALS同源序列的抗性基因盒ALS-Apra-ALS用于下一步構建 乙酰乳酸合成酶基因失活的工程菌。
[0053] (3)構建以乙酰乳酸合成酶基因失活的克雷伯氏菌
[0054]將上一步獲得的具長側翼ALS同源序列的抗性基因盒ALS-Apra-ALS電轉化導入含 有Red重組酶質粒pIJ790的已經失活乳酸脫氫酶的克雷伯氏菌中（實施例1中構建）；誘導 Red重組酶表達，兩端長側翼同源片段與乙酰乳酸合成酶基因相應序列之間發生基因同源 重組，將Apra抗性基因盒插入到乙酰乳酸合成酶基因中間，通過Apra抗性(50ug/ml)篩選出 重組菌，即乙酰乳酸合成酶基因及乳酸脫氫酶基因同時失活的克雷伯氏菌；通過傳代使 PIJ790質粒丟失。由此得到乙酰乳酸合成酶基因及乳酸脫氫酶基因同時失活的克雷伯氏 菌。
[0055] (4)消除Apra抗性基因盒
[0056]將pCP20質粒電轉化入上一步獲得的乙酰乳酸合成酶基因及乳酸脫氫酶基因同時 失活的克雷伯氏菌中，誘導重組酶表達，使兩個FRT序列之間的Apra抗性基因盒消除，得到 消除了 Apra抗性基因盒的雙基因失活的克雷伯氏菌;通過傳代使pCP20質粒丟失。
[0057]通過以上4步操作，獲得乳酸與2，3_丁二醇合成代謝途徑關鍵基因一乳酸脫氫酶 基因和乙酰乳酸合成酶基因同時失活的肺炎克雷伯氏菌突變株，即為雙基因敲除工程菌。 [0058]實施例3:乳酸脫氫酶基因和乙酰乳酸合成酶基因同時失活的肺炎克雷伯氏菌突 變株的乳酸脫氫酶與乙酰乳酸合成酶活性檢測。
[0059] 對實施例2的乳酸脫氫酶基因與乙酰乳酸合成酶基因同時失活的肺炎克雷伯氏菌 突變株進行乳酸脫氫酶基因與乙酰乳酸合成酶的活性檢測，以野生型肺炎克雷伯氏菌為對 照，具體方法包括以下步驟：
[0060] 1、乳酸代謝途徑關鍵酶乳酸脫氫酶的活性檢測：
[0061 ]對實施例2構建的同時失活乳酸與2，3-丁二醇代謝途徑關鍵基因的乳酸脫氫酶基 因和乙酰乳酸合成酶基因同時失活的肺炎克雷伯氏菌突變株進行乳酸脫氫酶的活性檢測， 以野生型菌株為對照，具體方法包括以下步驟：
[0062] (1)取菌種接種LB培養基，37 °C振蕩培養12小時，得到種子培養菌液；
[0063] (2)取種子培養菌液接種至200ml發酵培養基(見實施例4)中，37 °C振蕩培養12-24 小時，每2小時取樣離心收集菌體；
[0064] (3)用100ml預冷的磷酸緩沖液(0.1M，pH7.5)懸浮洗滌菌體2次；
[0065] (4)用2 · 5ml預冷的磷酸緩沖液(0 · 1M，pH7 · 5)懸浮菌體；
[0066] (5)超聲波破碎菌體(400W探頭工作3秒，間歇3秒，冰浴作用80-100次）；
[0067] (6)2000g離心10min，取上清用于測定酶活（用紫外可見分光光度計測定0D340nm 在lmin內的變化）。乳酸脫氫酶反應體系含有:含25mmol · Γ1的pH 7.4磷酸鉀緩沖液79〇111、 5mmol · L-1 的NADH 80ul、lmol · L-1 MgCl2 10ul、20mmol · L-1 果糖-1，6-二磷酸50ul、 400mmol · L-1丙酮酸50ul、粗酶液20yL。加入酶液后開始反應分光光度計測量Δ A34〇nm/min。 一個酶活單位定義為1分鐘消耗lymo 1 NADH所需的酶量。
[0068] 結果顯示，實施例2構建的乳酸脫氫酶基因和乙酰乳酸合成酶基因同時失活的肺 炎克雷伯氏菌突變株的乳酸脫氫酶活性為野生型菌株的1.8%-5.3%，表明實施例2構建的 乳酸脫氫酶基因和乙酰乳酸合成酶基因同時失活的肺炎克雷伯氏菌突變株的乳酸脫氫酶 失活。
[0069] 2、2，3-丁二醇代謝途徑關鍵酶乙酰乳酸合成酶的活性檢測：
[0070]對實施例2構建的同時失活乳酸與2，3-丁二醇代謝途徑關鍵基因的乳酸脫氫酶基 因和乙酰乳酸合成酶基因同時失活的肺炎克雷伯氏菌突變株進行乙酰乳酸合成酶的活性 檢測，以野生型菌株為對照，具體方法包括以下步驟：
[0071] (1)將乳酸脫氫酶基因和乙酰乳酸合成酶基因同時失活的肺炎克雷伯氏菌突變株 接種于lOOmL培養基(每L水中含有甘油30g，胰蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 5g，pH 7.0，120 °C滅菌20min)中，在37°C下振蕩培養12-24小時，每2小時取樣離心收集菌體；
[0072] (2)用1 OOmL磷酸緩沖液(0.1M，pH7.5)懸浮洗滌菌體2次；
[0073] (3)用2 · 5mL磷酸緩沖液(0 · 1M，pH7 · 5)懸浮菌體；
[0074] (4)4°C超聲波破碎菌體；
[0075] (5)酶活測定根據乙酰乳酸在一定溫度條件下會脫羧形成乙偶姻，而乙偶姻在堿 性條件下可以與肌酸和萘酚的混合物反應生成紅色物質，可在525nm下檢測。反應體系為 lmL 0 · 1M磷酸鈉緩沖液(pH 7 · 0)，其中含40mmol/L的丙酮酸鈉，lmmol/L的氯化鎂，lmmol/L 的TPP，ΙΟμ mol/L的FAD，37°C加入20yL酶液（即破碎菌體液）啟動反應，10min后加50yL3mol/ L硫酸終止反應，37°C脫羧25min，2 000r/min離心lmin后，上清稀釋20倍后取500yL加入 0 · 25mL 0 · 17 %肌酸和0 · 25mL 1 · 7 %的α-萘酚，37 °C顯色30min，于525nm處測定吸光度。乙 偶姻的標準曲線方程為:y = 〇.〇139x，其中X為乙偶姻濃度(ymol/L)，y為0D525值。酶活單位 (IU)定義為在該反應條件下，lmin內催化生成Ιμπιο?/L乙偶姻所需的酶量。
[0076] 結果顯示，實施例2構建的乳酸脫氫酶基因和乙酰乳酸合成酶基因同時失活的肺 炎克雷伯氏菌突變株的乙酰乳酸合成酶活性為野生型菌株的3.5%-6.0%，表明實施例2構 建的工乳酸脫氫酶基因和乙酰乳酸合成酶基因同時失活的肺炎克雷伯氏菌突變株的乙酰 乳酸合成酶失活。
[0077]實施例4:乳酸脫氫酶基因和乙酰乳酸合成酶基因同時失活的肺炎克雷伯氏菌突 變株(LDH、ALS雙基因敲除菌)發酵甘油生產1，3-丙二醇 [0078] (1)培養基
[0079] LB培養基(g · Γ1):酵母粉5,蛋白胨10，NaCl 10,瓊脂10,調節至pH 7.0,用于克雷 伯氏菌菌種的短期保藏及活化。種子及發酵培養基組成見表1:
[0080] 表1:培養基組成
[0081]
[0082] (2)培養方式
[0083] (i)種子活化:從甘油管保藏的實施例2中的乳酸脫氫酶基因和乙酰乳酸合成酶基 因同時失活的肺炎克雷伯氏菌突變株接種至LB培養基斜面活化，溫度37°C下培養12小時活 化種子。
[0084] (ii)種子培養:250mL三角瓶9層紗布封口，裝液量100mL種子培養基，接入斜面菌 苔(步驟i的活化種子)一環，搖床中進行好氧種子培養，溫度30°C，轉速150r · mirT1。
[0085] (iii)發酵培養:為了考察所構建的LDH、ALS雙基因失活的對肺炎克雷伯氏菌發酵 甘油產1，3_丙二醇的影響，以實施例2中的乳酸脫氫酶基因和乙酰乳酸合成酶基因同時失 活的肺炎克雷伯氏菌突變株為實驗組，以出發野生菌肺炎克雷伯氏菌為對照組，進行補料 分批發酵，采用島津LC-20A HPLC分析發酵液中物質組成。
[0086]在5L攪拌發酵罐中進行時，裝液量3L，接種量1%，通入0.5vvm空氣進行微氧發酵 培養，攪拌轉速為200印111。發酵溫度恒定在37<€;似0!1調節卩!1至6.8，發酵過程中體系卩!1通過 流加 40 %的NaOH溶液調控。待菌株進入對數生長期后進行甘油補料，甘油濃度控制在1-50g/L〇
[0087] (iv)發酵結果
[0088]發酵進行36小時，底物消耗、1，3_丙二醇及其它副產物合成情況結果，見表2。
[0089]表2:失活乳酸脫氫酶基因與乙酰乳酸合成酶基因對肺炎克雷伯氏菌發酵甘油生 產1，3-丙二醇的影響
[0090]
[0091] 從發酵結果可以得知，失活LDH、ALS基因使菌種生物量略微降低，甘油消耗量也稍 微降低，說明失活LDH、ALS對菌種的生長存在一定影響；失活LDH、ALS基因工程菌合成1，3_ 丙二醇濃度與野生菌相比也略微降低，但不顯著；工程菌合成1，3-丙二醇生產強度和得率 與野生菌相比無顯著差異;失活LDH、ALS基因工程菌合成副產物乳酸和2,3_ 丁二醇比野生 菌顯著降低，其中乳酸合成降低88.06%，2,3_丁二醇合成降低58.36%;其它副產物合成無 顯著變化。由于工程菌發酵合成副產物乳酸、2,3_丁二醇減少，1，3_丙二醇占總代謝產物的 比例顯著提高，與野生菌相比提高13.1 %。工程菌株發酵液中1，3-丙二醇占總代謝產物比 例是野生菌株的1.24倍。這表明工程菌種發酵甘油代謝流分布1，3_丙二醇提高，主要副產 物乳酸和2,3_ 丁二醇降低，這種特征有利于產品提取過程中降低處理副產物的生產成本， 具有重要應用價值。
【主權項】
1. 一株雙基因敲除工程菌的構建方法，其特征在于，是將產1，3-丙二醇的野生型菌株 的基因組中的D-乳酸脫氫酶基因和α-乙酰乳酸合成酶基因同時敲除后獲得的工程菌株，所 述的產1，3_丙二醇的野生型菌株是以甘油為原料發酵生產1，3_丙二醇。2. 根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于，所述的產1，3_丙二醇的野生型菌株為 克雷伯氏菌屬(Klebsiella)的細菌。3. 根據權利要求2所述的構建方法，其特征在于，所述的產1，3_丙二醇的野生型菌株為 肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae) 〇4. 根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述將肺炎克雷伯氏菌的基因組中的D-乳 酸脫氫酶基因和乙酰乳酸合成酶基因同時敲除是通過RED同源重組基因敲除方法將D-乳 酸脫氫酶基因和乙酰乳酸合成酶基因敲除。5. 根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述的將肺炎克雷伯氏菌的D-乳酸脫氫酶 基因和α-乙酰乳酸合成酶基因敲除同時敲除，是通過以下方法敲除： a、 PCR擴增肺炎克雷伯氏菌的乳酸脫氫酶基因，將其與克隆載體相連，然后再導入含 Red重組酶質粒pKD46的大腸桿菌Dh5a中，得到含有Red重組酶質粒pKD46及乳酸脫氫酶基因 克隆載體的大腸桿菌Dh5a; b、 設計與乳酸脫氫酶基因序列同源的兩側翼各~40bp的引物，以質粒pIJ773為模板， PCR擴增Apra+篩選抗性基因盒，純化得到兩側與乳酸脫氫酶基因同源的Apra+篩選抗性基 因盒DNA片段； c、 將步驟b獲得的兩側與乳酸脫氫酶基因同源的Apra+篩選抗性基因盒DNA片段電轉化 導入含有Red重組酶質粒pKD46及乳酸脫氫酶基因克隆載體的大腸桿菌Dh5a中；誘導Red重 組酶表達，兩側與乳酸脫氫酶基因同源的Apra+篩選抗性基因盒DNA片段與乳酸脫氫酶基因 克隆載體之間基因同源重組，通過Apra+抗性篩選出含重組片段的克隆菌； d、 通過PCR擴增兩端為長側翼同源片段，中間為Apra+抗性篩選標記基因盒的DNA片段； e、 將步驟d獲得的DNA片段電轉化導入含有Red重組酶質粒pIJ790的野生型克雷伯氏菌 中，誘導Red重組酶表達，兩端長側翼同源片段與乳酸脫氫酶基因之間發生基因同源重組， 將Apra+抗性基因盒插入到乳酸脫氫酶基因中間，通過Apra+抗性篩選出重組菌，即乳酸脫 氫酶基因失活的克雷伯氏菌； f、 向步驟d獲得的乳酸脫氫酶基因失活的克雷伯氏菌中電轉入pCP20質粒，誘導重組酶 表達，通過Apra+抗性基因盒兩端的FRT位點刪除Apra+抗性基因，得到乳酸脫氫酶基因失活 的克雷伯氏菌突變株，然后將含有Red重組酶的質粒pIJ790轉化進入乳酸脫氫酶基因失活 的克雷伯氏菌突變株，得到含有Red重組酶質粒pIJ790的乳酸脫氫酶基因失活的克雷伯氏 菌突變株； g、 PCR擴增肺炎克雷伯氏菌的乙酰乳酸合成酶基因，將其與克隆載體相連，然后再導入 含Red重組酶質粒pKD46的大腸桿菌Dh5a中，得到含有Red重組酶質粒pKD46及乙酰乳酸合成 酶基因克隆載體的大腸桿菌Dh5a; h、 設計與乙酰乳酸合成酶基因同源的兩側翼各~40bp的引物，以質粒pIJ773為模板， PCR擴增Apra+篩選抗性基因盒，純化該兩側與乙酰乳酸合成酶基因同源的Apra+篩選抗性 基因盒DNA片段； i、 將步驟h獲得的兩側與乙酰乳酸合成酶基因同源的Apra+篩選抗性基因盒DNA片段電 轉化導入含有Red重組酶質粒pKD46及乙酰乳酸合成酶基因克隆載體的大腸桿菌Dh5a中，誘 導Red重組酶表達，兩側與乙酰乳酸合成酶基因同源的Apra+篩選抗性基因盒DNA片段與乙 酰乳酸合成酶基因克隆載體之間基因同源重組，通過Apra+抗性篩選出含重組片段的克隆 菌； j、 通過PCR擴增兩端為長側翼同源片段，中間為Apra+抗性篩選標記基因盒的DNA片段； k、 將步驟j獲得的DNA片段電轉化導入含有Red重組酶質粒pIJ790的乳酸脫氫酶基因失 活的克雷伯氏菌突變株中，誘導Red重組酶表達，兩端長側翼同源片段與乙酰乳酸合成酶基 因之間發生基因同源重組，將Apra+抗性基因盒插入到乙酰乳酸合成酶基因中間，通過Apra +抗性篩選出重組菌，即乳酸脫氫酶基因和乙酰乳酸合成酶基因都失活的克雷伯氏菌； l、 向步驟k獲得的乳酸脫氫酶基因和乙酰乳酸合成酶基因都失活的克雷伯氏菌中電轉 入pCP20質粒，誘導重組酶表達，通過Apra+抗性基因盒兩端的FRT位點刪除Apra+抗性基因， 獲得乳酸脫氫酶基因與乙酰乳酸合成酶基因都失活的雙基因敲除工程菌。6. -種按照權利要求1、2、3、4或5所述的構建方法構建得到的雙基因敲除工程菌。7. 權利要求6所述的雙基因敲除工程菌在生產1，3_丙二醇中的應用。8. 權利要求7所述的應用，其特征在于，所述的雙基因敲除工程菌在生產1，3_丙二醇中 的應用，是雙基因敲除工程菌在發酵過程中底物甘油濃度為l-50g/L，通氣速度為1.0-3 · Ovvm，溫度為 30-40攝氏度，pH為 6 · 0-8 · 0。
【文檔編號】C12P7/18GK105936915SQ201610179046
【公開日】2016年9月14日
【申請日】2016年3月24日
【發明人】周勝, 秦啟偉, 王著希, 黃友華
【申請人】中國科學院南海海洋研究所