專利名稱：一種提高單分子熒光成像清晰度的方法及其裝置的制作方法
技術領域：
本發明涉及熒光光譜成像技術，特別是一種提高單分子熒光成像清晰度的方法及其裝置。
背景技術：
在上世紀九十年代單分子科學的形成與發展使得人們能夠在原子、分子尺度上觀察和操縱微觀物質世界。在單分子水平進行光學測量，可以揭露被大量分子系綜平均掩蓋的各個分子活動特性。基于單分子高清晰度的熒光成像用于分子探針和染料熒光標記是研究分子擴散、基因重組、蛋白質動力學過程等問題的重要手段和技術。實現單分子熒光成像普遍采用光學共聚焦顯微實驗系統進行測量，然而由于單分子熒光的輻射起伏(取決于分子的三重態特性及分子周圍電子受體俘獲電子的能力)以及較低的信噪比使得單分子熒光成像較為模糊，造成丟失一些局部區域的熒光信息，滿足不了高清晰度熒光成像的要求。

發明內容
本發明提供一種提高單分子熒光成像清晰度和方法，該方法可以解決由于分子熒光輻射起伏以及信噪比較低而造成的單分子熒光成像模糊的問題。為解決上述問題，本發明采用的技術方案是
一種提高單分子熒光成像清晰度的方法，采用皮秒脈沖激光器產生激光，利用函數信號發生器輸出正弦波形的調制電壓信號控制聲光調制器對激光進行強度調制，用調制后的激光掃描照射單分子樣品，使用單光子探測器接收單分子樣品發出的熒光光子，單光子探測器對入射熒光光子響應，并通過光電轉化為一個標準的邏輯電脈沖輸出信號，邏輯電脈沖信號輸入到鎖相放大器，同時將函數信號發生器的同步正弦波形調制電壓信號輸入鎖相放大器，對邏輯電脈沖輸出信號進行解調，得到被測的熒光光譜信號并對熒光光譜信號進行成像。通過調制和解調的過程，只容許包含熒光信號的調制諧波信號成分得到放大， 而抑制了其他頻率的背景信號，即通過壓縮噪聲帶寬有效降低量子噪聲，提高了光譜成像信號的信噪比。本發明還提供一種實現上述方法的裝置，所述的提高單分子熒光成像清晰度的方法的裝置，包括皮秒脈沖激光器聲光調制器、三維納米平移臺、單光子探測器、函數信號發生器、鎖相放大器和計算機數據采集成像與控制系統，函數信號發生器與聲光調制器連接， 皮秒脈沖激光器與聲光調制器相連接，皮秒脈沖激光器輸出的激光經過聲光調制器進行強度調制后由一個二向色鏡反射后通過顯微鏡物鏡聚焦于樣品分子上，分子受激發產生的熒光由顯微鏡物鏡收集，通過二向色鏡進入單光子探測器轉化為邏輯電脈沖信號，單光子探測器和函數信號發生器一起連接鎖相放大器，對邏輯電脈沖信號進行解調，計算機數據采集成像與控制系統分別與鎖相放大器、三維納米平移臺以及單分子探測器連接。本發明利用強度調制激發光場，實現對單分子熒光光子進行強度調制，利用鎖相放大器解調后的模擬信號消除了光子計數的量子漲落，提高了信噪比，實現高清晰度的單分子熒光成像。


圖1為實現本發明所述方法的裝置結構示意圖2 (a)為分子熒光的光子計數光譜；(b)為解調后的分子熒光光譜。圖3 (a)為單分子熒光的光子計數成像；(b)為解調后的單分子熒光成像。圖4 (a)為一個單分子的熒光光子計數成像的三維立體圖像；(b)為解調后的單分子熒光成像的三維立體圖像。圖5為掃描程序和熒光光子計數原理圖。圖中1-皮秒脈沖激光器，2-聲光調制器，3-三維納米平移臺，4-單光子探測器， 5-函數信號發生器，6-鎖相放大器，7-計算機數據采集成像與控制系統。
具體實施例方式以下以SR染料分子樣品為例，結合附圖對本發明所述的方法和裝置進行進一步的詳細描述。樣品制備首先要根據實驗要求薄膜的厚度來配制聚合物PMMA的濃度。將清洗干凈的蓋玻片放在勻膠機的托盤上，打開勻膠機電源開啟真空泵將玻片吸附在托盤上，將配制好的包含有PMMA和SR染料的甲苯溶液滴到蓋玻片上，開啟勻膠機的啟動按鈕勻膠機將以事先設定好的轉數旋轉，根據要求樣品薄膜的厚度通常設定轉速為800-3000轉/分鐘， 根據樣品濃度的不同還需要調節旋轉時間(如分鐘)。將旋涂有聚合物的樣品玻片標號之后，放入到真空烘干箱中抽好真空后升溫到PMMA玻璃點溫度之上(大約為315 K)，進行淬火處理以消除殘留的溶劑、氧氣及舒緩旋涂技術對聚合物薄膜造成的影響，3小時之后關閉真空烘干箱電源讓其自然冷卻到室溫溫度。淬火處理后的樣品具有更好的光穩定性和更長的光漂白時間。本發明所述的提高單分子熒光成像清晰度的方法的裝置，如圖1所示，包括皮秒脈沖激光器1、聲光調制器2、三維納米平移臺3、單光子探測器4、函數信號發生器5、 鎖相放大器6和計算機數據采集成像與控制系統7。本發明可通過多種公知的儀器實現，具體實施方式
中采用的儀器是皮秒脈沖激光器(picoQuant，PDL808型)，聲光調制器 (Crystal ^Technology，3080-122 型)，三維納米平移臺(Tritor 200/20 SG)，單光子探測器 (SPCM-15)，函數信號發生器(Agilent，33250A型)，鎖相放大器(SRS SR844)，計算機數據采集成像與控制系統(Ni 6251數據采集卡、LabVIEW程序)。函數信號發生器5與聲光調制器2連接，皮秒脈沖激光器1與聲光調制器2相連接，皮秒脈沖激光器1輸出的激光經過聲光調制器2進行強度調制后由一個二向色鏡反射后通過顯微鏡物鏡聚焦于樣品分子上，分子受激發產生的熒光由顯微鏡物鏡收集后通過二向色鏡進入單光子探測器4轉化為邏輯電脈沖信號，單光子探測器4和函數信號發生器5 一起連接鎖相放大器6，對邏輯電脈沖信號進行解調，計算機數據采集成像與控制系統7分別與鎖相放大器6、三維納米平移臺3以及單分子探測器4連接。采用皮秒脈沖激光器產生激光，利用函數信號發生器輸出正弦波形的調制電壓信號控制聲光調制器對激光進行強度調制，用調制后的激光掃描照射單分子樣品，使用單光子探測器接收單分子樣品發出的熒光光子，單光子探測器對入射熒光光子響應，并通過光電轉化為一個標準的邏輯電脈沖輸出信號，邏輯電脈沖信號輸入到鎖相放大器，同時將函數信號發生器的同步正弦波形調制電壓信號輸入鎖相放大器，對邏輯電脈沖輸出信號進行解調，得到被測的熒光光譜信號并對熒光光譜信號進行成像。分子樣品置于三維納米平移臺3上，計算機數據采集成像與控制系統7與三維納米平移臺3相連，計算機數據采集成像與控制系統7輸出電壓信號控制三維納米平移臺3 的掃描。單光子探測器4與計算機數據采集成像與控制系統7連接，通過數據采集卡的計數端子對分子熒光進行光子計數(圖2 (a)所示)和通過LabVIEW程序進行分子熒光的光子計數成像(圖3 (a)所示)。單光子探測器4和函數信號發生器5 —起連接到鎖相放大器 6對單分子熒光光子信號進行解調解調，將解調信號輸入到OT數據采集卡進行模擬采集和成像，鎖相放大器6與計算機數據采集成像與控制系統7相連，記錄解調后的熒光光譜(圖 2 (b)所示)和通過LabVIEW程序進行成像(圖3 (b)所示)。掃描程序和熒光光子計數原理如圖5所示(基于NI6251板卡)。函數信號發生器5 (Agilent，33250A)輸出的正弦波調制信號(30kHz，4. OVpp)加載到聲光調制器2的驅動模塊上，對皮秒脈沖激光器(40MHz)輸出的激光進行強度正弦波調制，被調制后的激光經顯微鏡物鏡聚焦后照射分子樣品，顯微鏡物鏡(100 X，油浸)收集分子發出的熒光，單光子探測器收集入射熒光單光子信號(大約10kHz)，并輸入鎖相放大器 6 (積分時間為30ms)對信號進行解調，計算機記錄解調后的分子熒光信號。采用頻率為30kHz正弦調制電壓作為激光調制信號，對激光進行調制。圖2 (a) 和(b)分別為單分子熒光的光子計數光譜和調制解調后的分子熒光光譜，從圖2 (a)中可
以看到單分子熒光的平均光子計數#大約為9K，光子計數起伏M/大約為3K，對應熒光
信號起伏=1/3 ；從圖2 (b)中可以看到單分子熒光解調后的平均信號V大約為
3.6mV，起伏^1T大約為0.3mV，那么熒光信號起伏ΛΙ7/Ρ =1/15，即分子熒光強度起伏由光子計數光譜的1/3減小為解調處理后的1/15。顯微鏡物鏡的空間分辨率約為0. 3 μ m，在圖3中選擇的掃描步長為100 nm,掃描的像素為100 X 100，在x-y平面的掃描面積為10 μπι X 10 μ m。圖3 (a)和(b)分別為單分子熒光的光子計數成像和解調后的單分子熒光成像，成像位置為相同樣品的同一區域，光子計數成像的性噪比SNR大約為8，解調后的單分子熒光成像的性噪比SNR大約為 40，信噪比改善了 5倍。在圖4中選擇的掃描步長為25 nm，掃描像素為40 X 40，在χ-y平面的掃描面積為1 μπι X 1 μπι。圖4 (a)和(b)分別為同一個單分子的熒光光子計數成像的三維立體圖像和解調后的熒光成像的三維立體圖像，從圖4 (a)中可以看到光子計數的起伏較大，而采用本技術通過解調處理后的熒光成像更為平滑。
權利要求
1.一種提高單分子熒光成像清晰度的方法，其特征在于采用皮秒脈沖激光器產生激光，利用函數信號發生器輸出正弦波形的調制電壓信號控制聲光調制器對激光進行強度調制，用調制后的激光掃描照射單分子樣品，使用單光子探測器接收單分子樣品發出的熒光光子，單光子探測器對入射熒光光子響應，并通過光電轉化為一個標準的邏輯電脈沖輸出信號，邏輯電脈沖信號輸入到鎖相放大器，同時將函數信號發生器的同步正弦波形調制電壓信號輸入鎖相放大器，對邏輯電脈沖輸出信號進行解調，得到被測的熒光光譜信號并對熒光光譜信號進行成像。
2.實現如權利要求1所述的提高單分子熒光成像清晰度的方法的裝置，包括皮秒脈沖激光器(1)、聲光調制器(2)、三維納米平移臺(3)、單光子探測器(4)、函數信號發生器(5)、 鎖相放大器(6)和計算機數據采集成像與控制系統(7)，其特征在于函數信號發生器(5) 與聲光調制器(2)連接，皮秒脈沖激光器(1)與聲光調制器(2)相連接，皮秒脈沖激光器(1) 輸出的激光經過聲光調制器(2 )進行強度調制后由一個二向色鏡反射后通過顯微鏡物鏡聚焦于樣品分子上，分子受激發產生的熒光由顯微鏡物鏡收集后通過二向色鏡進入單光子探測器(4)轉化為邏輯電脈沖信號，單光子探測器(4)和函數信號發生器(5) —起連接鎖相放大器(6)，對邏輯電脈沖信號進行解調，計算機數據采集成像與控制系統(7)分別與鎖相放大器(6)、三維納米平移臺(3)以及單分子探測器(4)連接。
全文摘要
本發明涉及熒光光譜成像技術，為了解決由于分子熒光輻射起伏以及信噪比較低而造成的單分子熒光成像模糊的問題，本發明提供一種提高單分子熒光成像清晰度的方法及其裝置。用聲光調制器進行強度調制后的激光掃描照射單分子樣品，使用單光子探測器接收單分子樣品發出的熒光光子并轉化為一個標準的邏輯電脈沖輸出信號，邏輯電脈沖信號輸入到鎖相放大器，同時將同步正弦波形調制電壓信號輸入鎖相放大器，對邏輯電脈沖輸出信號進行解調，得到被測的熒光光譜信號并對熒光光譜信號進行成像。本發明利用強度調制激發光場，實現對單分子熒光光子進行強度調制，利用鎖相放大器解調后的模擬信號消除了光子計數的量子漲落，提高了信噪比，實現高清晰度的單分子熒光成像。
文檔編號G01N21/64GK102507521SQ20111034528
公開日2012年6月20日 申請日期2011年11月4日 優先權日2011年11月4日
發明者張國峰, 肖連團, 賈鎖堂, 陳瑞云, 高巖 申請人:山西大學