專利名稱：基因重組人抗菌肽mhCAP－18的活性GSLL－39片段及其制備方法和用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及基因重組工程，尤其是利用原核系統表達基因重組人抗菌肽mhCAP-18的活性GSLL-39片段及其制備方法和用途。
背景技術：
天然免疫是機體抵抗病原微生物入侵的第一道屏障，抗微生物肽(antimicrobial peptide)又稱多肽抗生素(peptide antibiotics)，是一類機體自身表達的具有抗微生物活性的小肽，是機體天然免疫的重要組成部分，它們對格蘭氏陽性、陰性細菌、真菌、病毒等都有殺傷作用；抗微生物肽以結構和氨基酸基序分類，人類抗微生物肽可分為防御素(defensin)、cathelicidin和histatin三類。
cathelicidin分子由保守的cathelin樣結構域和特異的C末端結構組成，在哺乳動物中已發現三十余種，但目前僅發現一種人類cathelicidin，hCAP-18/LL-37。該基因位于3號染色體，有4個外顯子，最早由人類骨髓cDNA文庫中篩選出(原稱FALL-39)，編碼由170個氨基酸組成的多肽，其中30個氨基酸為信號肽，其余140個氨基酸編碼分子量為18kD的前體，人類陽離子抗微生物蛋白，hCAP-18(human cationic antimicrobial protein18)。hCAP-18分子是LL-37的前體蛋白，由cathelin樣結構域和LL-37結構域構成，cathelin樣結構域結合并中和LL-37結構域的活性，因此hCAP-18分子本身沒有抗微生物活性；絲氨酸蛋白酶3從丙氨酸103和亮氨酸104間酶切，將其C末端包含37個氨基酸的肽段切下，形成成熟、有活性的抗微生物肽，由于它N端頭兩個氨基酸均為亮氨酸(L)，因此將其命名為LL-37。
LL-37有多種生物學特點1)廣譜抗微生物活性對格蘭氏陽性、陰性細菌，真菌等微生物有抗微生物活性；2)趨化活性對肥大細胞、中性粒細胞、單核細胞、T細胞等有趨化作用(chemotactic)；3)免疫調節活性可上調多種趨化因子和趨化因子受體的表達；4)中和內毒素結合并中和LPS，阻止LPS結合到CD14+細胞上，防止由格蘭氏陰性細菌感染引起的內毒素休克；5)促進血管新生；6)抗降解與其它α螺旋抗微生物肽不同，在溶液中可形成多聚體形式，從而防止了被蛋白酶降解。
LL-37分子氨基酸序列為LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES，呈兩性α螺旋空間構象，即α螺旋的一側集中了親水氨基酸，是親水區，另一側集中了疏水氨基酸，是疏水區；正是由于這種特殊的空間構象，決定了LL-37可插入并通過地毯樣機制(carpet-like mechanism)破壞細胞膜，使之通透性發生改變，最終導致細胞死亡。LL-37分子中間E11-V32部分多肽(11EKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLV32)是兩性α螺旋的核心，N端和C端其它氨基酸對特異空間構象和抗微生物活性貢獻很小。
LL-37在中性粒細胞、睪丸和表皮細胞中呈組成性表達，角質細胞在炎癥時可誘導表達；在表皮、口腔、呼吸道、胎兒、新生兒的天然免疫中起重要作用；本發明人的研究發現LL-37在部分白血病細胞系及新鮮白血病患者骨髓、外周血標本也有表達，但表達水平低于正常人。LL-37表達低下與牛皮癬、濕疣刺、尋常疣、慢性鼻炎、特異性皮炎、肺囊性纖維化、細菌性痢疾、Morbus Kostman(MK)等多種疾病相關；此外，LL-37還可用于中和LPS，預防、治療格蘭氏陰性細菌引起的感染性休克等，因此，重組LL-37有巨大的應用潛力。采用基因工程技術在原核系統表達外源蛋白是目前生物醫學工程的常用手段，但由于LL-37本身的抗微生物特性，因此不能在原核體系中直接表達有抗微生物活性的LL-37。
在原核系統表達重組蛋白是目前常用的手段，具有周期短、成本低、易于大規模生產等特點，目前在科研中使用的LL-37多為通過多肽合成，成本高。由于LL-37有抗菌活性，因此不能在原核系統中直接表達有活性的LL-37；同時由于體內將hCAP18酶切形成活性LL-37的蛋白酶成本高，不適于大規模生產，因此也不宜通過表達hCAP18獲得LL-37。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種在原核體系中表達hCAP-18的方法，通過同時表達hCAP-18的cathelin樣結構域和LL-37結構域，并在兩個結構域間加入凝血酶酶切位點，成功表達沒有抗微生物活性的改造后的mhCAP-18，再經體外酶切、純化，可獲得具有抗微生物活性的重組GSLL-39。GSLL-39與藥物學可接受的其它藥物組合物，所述藥物組合物可給予人以預防、治療hCAP-18/LL-37相關的各種疾病。
為了解決上述問題，本發明采用的技術方案是一種基因重組人抗菌肽mhCAP-18的活性GSLL-39片段，所述的mhCAP-18包含146個氨基酸或其活性片段，編譯mhCAP-18的cDNA序列包含441個核苷酸堿基或其改構體；mhCAP-18在體外經凝血酶酶切得到重組人抗菌肽活性GSLL-39片段，GSLL-39的氨基酸序列為GSLLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES。
基因重組人抗菌肽mhCAP-18的活性GSLL-39片段的制備方法，包括a.利用原核細胞生產含凝血酶酶切位點的人抗菌肽mhCAP-18；b.利用凝血酶酶切含凝血酶酶切位點的人抗菌肽mhCAP-18，獲得重組人抗菌肽活性GSLL-39片段。
所述的原核細胞為大腸桿菌。
所述的利用原核細胞生產基因重組含凝血酶酶切位點的人抗菌肽mhCAP-18包括以下步驟a.根據hCAP-18/LL-37的基因序列設計PCR引物進行反轉錄PCR擴增，獲得表達hCAP-18/LL-37的基因片段，然后根據hCAP-18/LL-37分子cathelin樣結構域、LL-37結構域構和凝血酶酶切位點序列再設計PCR引物，采用Overlap PCR進行擴增，獲得表達含凝血酶酶切位點的人抗菌肽mhCAP-18的基因片段，通過雙酶酶切，定向克隆到原核表達載體中，構建表達載體，并轉化大腸桿菌成為工程菌；b.重組含凝血酶酶切位點的人抗菌肽mhCAP-18的純化誘導后的工程菌，經超聲破碎細菌后離心取上清，再經過層析的方法；c.活性人抗菌肽GSLL-39的純化經純化的重組含凝血酶酶切位點的人抗菌肽mhCAP-18在體外經凝血酶酶切，再經SP離子交換層析及除菌、濃縮和凍干。
所述的原核表達載體是pET系列載體表達系統、T7表達系統、pBAD表達系統、pTrc表達系統、PurePro Caulobacter表達系統、PL表達系統中的一種。
所述的雙酶酶切是通過NcoI和EcoRI雙酶切位點，所述的原核表達載體是pET32c(+)，構建的表達載體為pET-mhCAP-18。
所述的層析方法是Ni2+鏊合層析。
所述的GSLL-39片段用于預防或治療hCAP-18/LL-37相關疾病。
所述的hCAP-18/LL-37相關疾病選自感染性疾病、皮膚損傷修復或格蘭氏陰性細菌引起的感染性休克。
應用途徑包括霧化、外涂、外敷、浸泡的外用，肌肉注射，皮下注射，皮內注射，靜脈注射或口服。
本發明在Cathelin結構域與LL-37結構域之間引入凝血酶的切割位點，使mhCAP-18可順利在原核系統表達，并可在體外經凝血酶酶切獲得具有抗微生物活性的GSLL-39。


圖1是本發明構建的原核表達載體pET-mhCAP-18的圖譜。
其中，H組氨酸標記(His-Tag)；T凝血酶酶切位點。
圖2是重組融合蛋白TrxA-mhCAP-18的鑒定圖。
其中，左側是SDS-PAGE電泳圖，分子量標記在最左側泳道；泳道1是未誘導的BL21-mhCAP-18菌經超聲破碎后可溶性蛋白；泳道2是IPTG誘導的BL21-mhCAP-18菌經超聲破碎后可溶性蛋白。右側是Western blot圖，泳道1是未誘導的BL21-mhCAP-18菌經超聲破碎后可溶性蛋白；泳道2是IPTG誘導的BL21-mhCAP-18菌經超聲破碎后可溶性蛋白。
圖3是純化重組融合蛋白TrxA-mhCAP-18的SDS-PAGE電泳圖。
其中，分子量標記在最左側泳道；泳道1是未誘導的BL21-mhCAP-18菌經超聲破碎后可溶性蛋白；泳道2是IPTG誘導的BL21-mhCAP-18菌經超聲破碎后可溶性蛋白；泳道3是IPTG誘導的BL21-mhCAP-18菌經超聲破碎及鎳柱分離純化得到的TrxA-mhCAP-18融合蛋白。
圖4是TrxA-mhCAP-18經凝血酶酶切及純化后Tris-Trine電泳圖。
其中分子量標記在最左側泳道；泳道1是鎳柱分離純化得到的TrxA-mhCAP-18融合蛋白；泳道2是TrxA-mhCAP-18經凝血酶酶切后；泳道3是TrxA-mhCAP-18經凝血酶酶切、SP Sepharose純化獲得的GSLL-39。
圖5是重組GSLL-39的抗菌圖。
其中虛線是大腸桿菌(Escherichia coli)，實線為金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)。
具體實施例方式
一種基因重組人抗菌肽mhCAP-18的活性GSLL-39片段，所述的mhCAP-18包含146個氨基酸或其活性片段，編譯mhCAP-18的cDNA序列包含441個核苷酸堿基或其改構體；mhCAP-18在體外經凝血酶酶切得到重組人抗菌肽活性GSLL-39片段，GSLL-39的氨基酸序列為GSLLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES。如序列表中的序列1所示，包含441個核苷酸堿基的編譯mhCAP-18的cDNA序列中，序列1-309是編碼cathelin樣結構域的核苷酸序列；序列310-327是編碼凝血酶酶切位點核苷酸序列；序列328-438是編碼LL-37結構域的核苷酸序列；序列439-441是終止密碼子。如序列表中序列2、3、4、5所示，本發明的mhCAP-18包含146個氨基酸的序中，序列1-103是cathelin樣結構域的氨基酸序列；序列104-109是凝血酶酶切位點氨基酸序列；序列110-146是LL-37結構域的氨基酸序列。如序列表6所示，為本發明的活性人抗菌肽GSLL-39的氨基酸序列，序列3-39是LL-37結構域的氨基酸序列。
本發明采用RT-PCR和分子克隆技術，首先從人白血病細胞系J6-1(本發明人實驗室在1976年從AMML建株的粒單型白血病細胞系，見Wu KF，etal.Proc CAMS & PUMC 1986；1∶218-224)克隆了人類抗微生物肽hCAP-18/LL-37的cDNA片段，長度為560bp，見序列表中的表7，序列12-521是編碼區。然后采用Overlap PCR的方法在hCAP-18/LL-37分子Cathelin結構域與LL-37結構域之間引入凝血酶的切割位點，并在兩端引入DNA內切酶位點，構建mhCAP-18，長度為462bp，見序列表中的表8、9、10、11，序列1-12是NcoI酶切識別位點及保護堿基序列；序列13-321是編碼cathelin樣結構域的核苷酸序列；序列322-339是編碼凝血酶酶切位點核苷酸序列；序列340-450是編碼LL-37結構域的核苷酸序列；序列451-453是終止密碼子；453-462是EcoRI酶切識別位點及保護堿基序列。經NcoI和EcoRI雙酶切后定向插入pET32c(+)載體，構建融合蛋白表達載體pET-mhCAP-18，轉入宿主菌E.coli.BL21trxB(DE3)，獲得表達菌株BL21-mhCAP-18；經IPTG誘導，表達可溶性TrxA-mhCAP-18融合蛋白，見序列表中的表12，序列1-109是TrxA結構域的氨基酸序列；序列110-161是pET32c(+)載體序列翻譯成的氨基酸序列；序列162-264是cathelin樣結構域的氨基酸序列；序列265-270是凝血酶酶切位點氨基酸序列；序列271-307是LL-37結構域的氨基酸序列。經鎳柱分離純化得到高純度融合蛋白，再經凝血酶切割、純化，可產生有抗菌活性的GSLL-39，見序列表中的序列6。
本發明的在原核系統表達活性人類抗菌肽hCAP-18的方法所用的原核表達體系包括如pET系列載體表達系統、T7表達系統、pBAD表達系統、pTrc表達系統、PurePro Caulobacter表達系統、PL表達系統等，但不限于此。
本發明表達的重組GSLL-39可單獨使用或與其它藥物配制成藥物組合，用于預防、治療hCAP-18/LL-37相關疾病，包括1)感染性疾病；2)刺激血管新生用于促進皮膚損傷修復；3)中和LPS用于預防和治療格蘭氏陰性細菌引起的感染性休克，但不限于。所述應用途徑包括外用(如霧化、外涂、外敷、浸泡等)、肌肉注射、皮下注射、皮內注射、靜脈注射、口服等，但不限于此。
以下以實施例詳細說明本發明，應理解的是，本發明不限于這些實施例。
實施例1J6-1細胞中hCAP-18/LL-37基因的克隆本例以人白血病細胞系J6-1出發，采用RT-PCR方法獲得人類抗微生物肽hCAP-18/LL-37的cDNA片段，并克隆到pUC18載體上。
1)總RNA提取采用TRIZOLReagent總RNA分離試劑盒(GIBCO)根據廠商指導提取J6-1細胞的總RNA。具體地，離心收集培養至對數生長期的J6-1細胞(約5×106細胞)，加1ml Trizol提取液，吹打混勻室溫放置5分鐘，加0.2ml氯仿，強烈振蕩15秒，室溫放置2-3分鐘，4℃下12,000g離心20分鐘，取上層水相，轉入Ep管，加0.5ml異丙醇，混勻，室溫放置20分鐘，4℃下12,000g離心15分鐘，加1ml 75％乙醇(DEPC水配制)洗滌沉淀一次，4℃下8000g離心5分鐘，空氣中干燥，加20微升DEPC處理水溶解RNA，最后加1微升RNasin，-80℃貯存備用。取1微升所提RNA溶液進行紫外分光光度儀分析(A260/A280≥1.8)和定量。
2)cDNA合成按照Life technologies公司M-MLV逆轉錄酶產品說明書推薦方法在0.2ml Eppendorf管中加入1微升500微克/毫升寡(dT)12-18，5微升總RNA(2微克)，2微升dNTPs(10mM)，DEPC處理水4微升補至12微升，65℃加熱5分鐘，立即至冰浴中1分鐘，稍加離心，按順序加入4微升5×M-MLV逆轉錄酶緩沖液，2微升0.1M DTT，1微升Rnasin(40U/微升)和1微升M-MLV逆轉錄酶，混勻，37℃ 60分鐘，75℃ 15分鐘。將獲得的cDNA于-20℃貯存備用。
3)PCR反應取5微升cDNA，分別加入25pmol hCAP-18特異性的上游引物(5’-gaattccggccatgaagaccc-3’和下游引物(5’-cagagcccagaagcctgagc-3’)，200μM dNTPs和2 U的PyrobestTMDNA聚合酶(TAKARA)，反應體系為50微升。擴增條件為94℃ 30秒，64℃ 30秒，72℃ 45秒，30個循后，72℃延伸10分鐘。PCR擴增反應結果獲得一條大小為560bp的hCAP-18 cDNA片段。其序列見序列表中的表7。
4)DNA片段回收采用WizardPCR Preps DNA Purification System(PROMEGA)，按照試劑盒步驟回收DNA片段。具體地，樣品經1×TAE緩沖液配制的低溶點瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后，長波紫外燈下切取所需DNA片段所在的低溶點瓊脂糖凝膠，70℃水浴10分鐘，使膠完全熔化，加入1毫升樹脂并充分混勻后，用注射器將樹脂轉移至小柱中，然后用注射器推入2毫升80％異丙醇洗滌小柱，12000g離心2分鐘使樹脂干，加入50微升去離子水，室溫1分鐘后，10000g離心收集DNA片段。加入0.2倍體積的10M醋酸銨和2倍體積的無水乙醇，室溫放置10分鐘，然后離心沉淀DNA，加1ml 75％乙醇洗滌沉淀一次，置超凈臺待DNA沉淀自然干燥后，加20微升無菌去離子水溶解，4℃保存備用。
5)hCAP-18 cDNA片段與pUC18載體的連接將pUC18載體用SmalI酶切，瓊脂糖凝膠電泳回收酶切片段；按照LifeTechnologies公司連接反應操作說明進行。連接體系中插入片段與pUC18載體片段的摩爾比為3∶1，加入10×連接酶緩沖液1微升，T4連接酶1微升，并用去離子水將總體補至10微升，16℃連接24小時。
6)感受態的制備挑取DH5α單菌落經過夜活化后，1∶100接種于50ml LB培養基中，37℃，250轉/分鐘振蕩3h，至OD＝0.4-0.6。4000g離心10分鐘，棄上清，菌體重懸于5ml冰預冷的TBS溶液中(LB pH6.1，含10％ PEG 4000、5％ DMSO、10mM MgCl2和10mM MgSO4)，冰浴10分鐘，即為感受態細胞，可立即使用或加入20％甘油于-80℃貯存備用。
7)細菌的轉化取連接產物10微升于無菌的離心管中，加入10微升5×KCM溶液(0.5MKCl、0.15M CaCl2、0.25M MgCl2)，用無菌水補足50微升，加入40微升感受態細胞并混勻，冰浴放置20分鐘，室溫放置10分鐘后，加入200微升無抗生素的LB培養液，37℃震蕩培養(100～150轉/分鐘)45分鐘。取50微升轉化菌涂布于含100微克/毫升氨芐青霉素的LB瓊脂板上，37℃平放20分鐘，然后倒置培養10～14小時，待克隆形成，即刻取出于4℃保存待進一步鑒定。
8)重組質粒的小量制備、鑒定用牙簽挑取平板中單菌落，接種于3-5毫升含有氨芐青霉素的LB液體培養基中，37℃恒溫搖床中振蕩過夜，使細菌生長至對數生長晚期，然后將菌液轉入1.5毫升的Eppendorf管中，室溫12,000g離心1分鐘，去上清。采用TAKARA公司miniBEST質粒純化試劑盒，按試劑盒提供方法純化。具體地，用250微升的溶液I充分懸浮細菌沉淀后，加入250微升溶液II，輕輕顛倒混勻4～6次至液體清澈，加入400微升冰預冷的溶液III，輕輕顛倒混勻4～6次，室溫靜置2分鐘，室溫12,000g離心5分鐘收集上清。將試劑盒中離心柱置于收集管上，將收集上清轉移至離心柱中，3600轉/分鐘離心1分鐘，棄濾液；將500微升的Rinse A加入離心柱中，3600轉/分鐘離心1分鐘，棄濾液；將700微升的Rinse B加入離心柱中，3600轉/分鐘離心1分鐘，棄濾液；將700微升的Rinse B加入離心柱中，12000轉/分鐘離心1分鐘，棄濾液；將離心柱置于新Eppendorf管上，在離心柱中央加入60微升去離子水，室溫靜置1分鐘后，12,000轉/分鐘離心1分鐘洗脫質粒DNA。經Xhol I/Sal I雙酶切鑒定插入片段正確后，取質粒20微升(約3微克)送上海生工生物工程有限公司測序采用ABI PRISM 377型全自動測序儀進行DNA序列測定。所測定的DNA序列通過國際互連網查詢GenBanK，應用BLASTN軟件對hCAP-18 cDNA序列進行同源性分析。測序正確的質粒定名為phCAP-18。
兩次獨立PCR產物的克隆與測序結果均表明該J6-1細胞來源的hCAP-18 cDNA包含了hCAP-18基因的全部編碼序列(12-524)，同源性分析顯示其cDNA序列與文獻報道序列的同源性為99％(GenBanK accession no.Z38026.1)，有兩個點突變一個錯義突變(Codon 6，AAT to GAT)，位于信號肽，一個同義突變(Codon 39，GTC to GTG)位于Cathelin保守區；由于兩次獨立PCR產物的克隆與雙向測序結果一致，故可以排除點突變是由于PCR或測序的差錯所至。因此，J6-1細胞來源hCAP-18氨基酸序列與文獻報道序列的同源性為100％，可以作為模板供進一步實驗使用。序列見序列表中的表7所示。
實施例21、原核表達質粒pET-mhCAP-18的構建pET32c(+)載體是Novagen公司pET系列原核表達載體中的一員，多克隆位點位于硫氧還蛋白(TrxA)、6個組氨酸標記(His-Tag)和凝血酶及腸激酶蛋白酶切位點的下游，以N端含TrxA的融合蛋白形式表達外源蛋白，可通過Ni2+鏊合層析純化融合蛋白，并經蛋白酶切釋放目的蛋白。以從J6-1細胞中克隆出的hCAP-18/LL-37為模板，通過Overlap PCR，獲得帶凝血酶酶切位點的DNA片段，構建原核表達載體pET-mhCAP-18。
1)Overlap PCR獲得帶凝血酶酶切位點的DNA片段采用Overlap PCR技術，經三次PCR反應，獲得兩端帶有NcoI和EcoRI核酸內切酶酶切位點，并在Cathelin結構域和LL-37結構域間插入凝血酶酶切位點的DNA片段。
(1)PCR擴增Cathelin結構域cDNA片段在100微升反應體系中含模板(phCAP-18)1微升(＜1納克)、10×PCR反應緩沖液10微升P1引物(5’-tataccatgggtcaggtcctcagctacaag-3’，畫線部分為NcoI酶切位點)2.5微升(10pmol)、P2引物(5’-accgcgtggcaccagggcaaatctcttgttat-3’)2.5微升(10pmol)、dNTPs(每種dNTP各10mM)2微升、PyrobesrTMDNA聚合酶(5U/微升)1微升、雙蒸水補至終體積100微升。反應條件94℃預變性5分鐘后，開始30個循環變性94℃ 30秒、退火56℃ 30秒、延伸72℃ 45秒；最后72℃延伸7分鐘。取5微升樣品，1％瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結果，目的帶大小為336bp。
(2)PCR擴增LL-37結構域cDNA片段在100微升反應體系中含模板(phCAP-18)1微升(＜1納克)、10×PCR反應緩沖液10微升P3引物(5’-gtgccacgcggttctctgctgggtgatttctt-3’)2.5微升(10pmol)、P4引物(5’-gtacgaattctaggactctgtcctgg-3’，畫線部分為EcoRI酶切位點)2.5微升(10pmol)、dNTPs(每種dNTP各10mM)2微升、PyrobestTMDNA聚合酶(5U/微升)1微升、雙蒸水補至終體積100微升。反應條件94℃預變性5分鐘后，開始30個循環變性94℃ 30秒、退火54℃ 30秒、延伸72℃ 20秒；最后72℃延伸7分鐘。取5微升樣品，1％瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結果，目的帶大小為138bp。
(3)PCR擴增mhCAP-18(NcoI酶切位點-Cathelin-凝血酶酶切位點-LL37-EcoRI酶切位點)DNA片段在100微升反應體系中含Cathelin結構域cDNA 1微升(＜1納克)、LL-37結構域cDNA 1微升(＜1納克)、10×PCR反應緩沖液10微升、P1引物(5’-tataccatgggtcaggtcctcagctacaag-3’，畫線部分為NcoI酶切位點)2.5微升(10pmol)、P4引物(5’-gtacgaattctaggactctgtcctgg-3’，畫線部分為EcoRI酶切位點，)2.5微升(10pmol)、dNTPs(每種dNTP各10mM)2微升、PyrobestTMDNA聚合酶(5U/ul)1微升、雙蒸水補至終體積100微升。反應條件94℃預變性5分鐘后，開始30個循環變性94℃ 30秒、退火40℃ 30秒、延伸72℃ 45秒；最后72℃延伸7分鐘。取5微升樣品，1％瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結果，目的帶大小為462bp，即為兩端含NcoI和EcoRI酶切位點的mhCAP-18，見序列表中的表8。
2)DNA片段的回收進行瓊脂糖凝膠電泳后，割下含有目的DNA(462bp)的瓊脂塊，放入1.5毫升離心管中，采用WizardPCR Preps DNA Purification System(PROMEGA)，按照試劑盒步驟回收DNA片段。具體方法同上。
3)純化PCR產物和pET32c(+)空載體的雙酶切及純化、回收在50微升反應體系中含PCR反應產物(～10微克)、10×酶切反應緩沖液5微升、10×BSA儲液5微升、Nco I(～12U/微升)2微升、Eco RI(～15U/微升)1微升、添加雙蒸水至終體積50微升；反應條件37℃水浴4小時后加入10×電泳上樣緩沖液(TAKARA)6微升以終止酶切反應。
在50微升反應體系中含pET32c(+)空載體1微克、10×酶切反應緩沖液5微升、10×BSA儲液5微升、Nco I(～12U/微升)1微升、Eco RI(～15U/微升)1微升、添加雙蒸水至終體積50微升；反應條件37℃水浴4小時后加入10×電泳上樣緩沖液(TAKARA)6微升以終止酶切反應。
將以上酶切產物進行瓊脂糖電泳，分別割下含有目的DNA片段的瓊脂塊，放入1.5毫升離心管中，采用WizardPCR Preps DNA PurificationSystem(PROMEGA)，按照試劑盒步驟回收DNA片段。具體方法同上。
4)體外重組、陽性克隆的篩選將上述純化的載體和插入片段依照MBI公司連接反應操作說明進行連接反應。具體地，在20微升連接體系中含插入片段50納克、載體片段50納克、10×連接酶緩沖液2微升、T4 DNA連接酶0.5微升(2.5U)、用去離子水將總體積補至終體積20微升，22℃連接1小時。取連接產物10微升，轉化DH5α感受態細菌，在含100微克/毫升氨芐青霉素(AMP)的LB瓊脂平板上培養過夜(具體方法同上)，待克隆形成，即刻取出于4℃保存待進一步鑒定。常規方法小量提取重組質粒，經初步Nco I、Eco RI雙酶切鑒定后，送上海生工生物工程有限公司測序，測序結果顯示重組質粒的插入片段的序列正確，與pET32c(+)的閱讀框架的一致。將該質粒命名為pET-mhCAP-18。其圖譜見圖1。
2、表達重組融合蛋白的工程菌BL21-mhCAP-18的建立BL21trxB(DE3)是Novagen公司用于pET系列原核表達載體表達外源蛋白的受體菌株，基因型為F-ompT hsdSB(rB-mB-)gal dcm trxB15∷kan(DE3)。用pET-mhCAP-18重組質粒轉化BL21trxB(DE3)受體菌，獲得表達重組融合蛋白的工程菌BL21-mhCAP-18。
1)BL21trxB(DE3)的轉化BL21trxB(DE3)感受態的制備同DH5α感受態的制備。取pET-mhCAP-18重組質粒50納克于無菌離心管中，按前述方法轉化，取50微升轉化菌涂布于含氨芐青霉素(100微克/毫升)、卡那霉素(15微克/毫升)雙抗性的LB瓊脂平板上，37℃恒溫孵箱正置培養1h后，倒置培養8~12小時，待克隆形成(直徑不超過1毫米)，即刻取出于4℃保存待進一步鑒定。取陽性轉化菌落在3毫升氨芐青霉素、卡那霉素雙抗性LB培養液中進行液體培養，37℃振蕩培養六小時后，取菌液，采用P1引物和P4引物進行PCR檢測確定成功轉化的菌株(PCR方法、條件如前所述)。成功轉化的工程菌命名為BL21-mhCAP-18，菌株在含20％甘油的LB培養基中-80℃保存，在IPTG誘導下，可表達重組融合蛋白TrxA-mhCAP-18，序列如序列表中的表12所示，序列1-109是TrxA結構域的氨基酸序列；序列110-161是pET32c(+)載體序列翻譯成的氨基酸序列；序列162-264是cathelin樣結構域的氨基酸序列；序列265-270是凝血酶酶切位點氨基酸序列；序列271-307是LL-37結構域的氨基酸序列。
2)融合蛋白TrxA-mhCAP-18的小量誘導表達及鑒定(1)誘導表達取同一菌株的成功轉化的工程菌，接種相同培養條件(雙抗性LB，3毫升)，37℃振蕩培養至OD600為0.6左右，在一管加入誘導劑IPTG(終濃度200微克/毫升)繼續誘導，另一管作為非誘導對照，繼續培養6~8小時。
(2)重組蛋白的鑒定取菌液離心棄培養液后向，用PBS重新懸起菌體，超聲破碎后，12000g離心取上清，加入4×SDS-PAGE上樣緩沖液，100℃水浴5分鐘，進行12％SDS-PAGE電泳，電泳后進行考馬斯亮藍染色或進行Western blot分析。
考馬斯亮藍染色用至少5倍體積的染色液浸泡凝膠，放脫色搖床上室溫緩慢旋轉3-4小時；換掉染色液并回收以備后用，用脫色液浸泡凝膠，緩慢搖動4-8h，其間換3-4次脫色液。繼續脫色24h，直到滿意為止。重組融合蛋白TrxA-mhCAP-18的分子量為34kD。
Western blot分析剪6塊新華3號濾紙和一塊硝酸纖維素膜(NC膜)；把NC膜放在陽極濾紙上，再放上SDS-PAGE凝膠及陰極濾紙，精確對齊、不留氣泡；根據凝膠面積按0.65mA/平方厘米接通電源，電轉移2-2.5小時。轉移結束后，取下NC膜，將含Marker的NC膜放在氨基黑染液(0.2％氨基黑+7％乙酸)中染色30分鐘，用蒸餾水略漂洗一下后脫色(30％甲醇+10％乙酸)。其余部分以TBST(10mM Tris-HCl pH8.0，150mM NaCl，0.1％Tween20)室溫溫和搖動洗膜15分鐘，加入一抗封閉液中置4℃搖動過夜；按每平方厘米加0.1毫升小鼠抗人LL-37單抗溶液(HBT公司，稀釋度為1∶200)，混勻后裝入袋中，4℃下輕搖2小時；棄去一抗液，用TPBS(PBS含0.02％Tween-20)洗3次，每次10分鐘，然后按每平方厘米膜加0.1ml加入HRP標記的兔抗小鼠二抗溶液(1∶5000)，室溫下輕輕振蕩1小時。取出膜，在TBST中洗膜三次，每次10分鐘。顯色取6毫克DAB溶于10毫升0.01MTris-HCl(PH7.6)溶液中，加10微升30％ H2O2充分混勻，將膜放入上述顯色液中，室溫下輕輕搖動，觀察顯色反應，當條帶達所需深度時(1-3分鐘)，立刻用水洗膜。誘導后產生分子量為34kD的特異條帶。
3、BL21-mhCAP-18的誘導表達、TrxA-mhCAP-18重組融合蛋白純化、酶切及GSLL-39重組蛋白的純化通過IPTG誘導，獲得可溶性TrxA-mhCAP-18重組融合蛋白，用Ni2+鏊合層析柱純化，獲得高純度的重組融合蛋白，再經凝血酶酶切，SP Sepharose層析，獲得高純度的GSLL-39重組蛋白。
1)重組蛋白的誘導表達以1∶1000的比例接種表達重組蛋白的工程菌于1升雙抗性LB培養基中，37℃振蕩培養約4小時，至細菌培養液的OD600為0.6左右，加入IPTG(終濃度200微克/毫升)，在20℃進行誘導表達重組蛋白，繼續振蕩培養30小時。6000g離心5分鐘收集菌體。以1/10培養體積(100毫升)將菌體重懸于結合緩沖液中(Tirs·Cl 20mM，NaCl 0.5M，PMSF 0.1mM)，在冰浴中進行超聲波破碎菌體(60％能量，共900秒)。4℃下，將破碎后的菌體溶液30000g離心30分鐘，取上清上樣Ni2+鏊合層析柱。
2)重組融合蛋白的純化Ni2+鏊合層析柱的制備取3毫升Ni2+鏊合層析介質ChelatingSepharoseTMFast Flow(Amersham Biosciences)裝柱，以5倍柱床體積的去離子水洗脫保存液(20％乙醇溶液)，然后加入5倍柱床體積的NiCl2溶液(50mM)使層析介質與Ni2+鏊合，再以10柱床體積的去離子水洗滌柱床以初去非鏊合的Ni2+離子，最后加入10倍柱床體積的結合緩沖液(20mMTirs·Cl，pH7.9，0.5M NaCl)平衡層析柱，將破碎后的菌體上清溶液上樣Ni2+鏊合層析柱，待樣品自然流過柱床后以，10倍柱床體積的結合緩沖液(20mM Tirs·Cl，pH7.9，0.5M NaCl，50mM咪唑)洗柱以去除非結合的蛋白和細菌的其他可溶性成份；然后以10倍柱床體積的洗滌緩沖液(20mM Tirs·Cl，pH7.9，0.5M NaCl，150mM咪唑)進一步洗去非特異結合的蛋白成分；最后用洗脫緩沖液(20mM Tirs·Cl，pH7.9，0.5M NaCl，300mM咪唑)洗脫，收集洗脫液。于4℃透析(透析液，50mM Tirs·Cl，0.15M NaCl，pH7.6)，過夜以除去蛋白溶液中的咪唑成分。
SPS-PAGE電泳分析，考馬斯亮藍染色可見，經純化后得到分子量為34kD的單一條帶。
BCA法測定得到的重組蛋白的濃度具體地，按A液(1％BCA二鈉鹽，2％Na2CO3·H2O，0.16％酒石酸鈉，0.4％NaOH，0.95％NaHCO3，pH11.25)1毫升加入B液(4％CuSO4·5H2O)20微升混勻，配制蛋白測定反應液，分裝1毫升/管；在1毫升反應液中分別加入50微升樣品蛋白溶液及蛋白標準液(100微克/毫升～800微克/毫升的牛血清白蛋白，)混勻，于37℃水浴中反應30分鐘；最后進行562nm波長光吸收分析。繪制標準蛋白濃度對光吸收值(OD562)的線性圖，根據標準蛋白的OD562-蛋白濃度關系，計算樣品的蛋白濃度。
TrxA-mhCAP-18重組融合蛋白表達量達8毫克/升。
3)TrxA-mhCAP-18重組融合蛋白酶切和重組GSLL-39純化按照重組融合蛋白∶凝血酶＝1毫克∶0.2微克的比例在凝血酶緩沖體系(150mM Tris·Cl，150mM NaCl，2.5mM CaCl2，pH7.5)25℃，反應16小時切除融合蛋白中的蛋白擔體成分。Tris-Trine電泳顯示三個條帶TrxA部分分子量13.9kD，cathelin部分分子量15.4kD，GSLL-39分子量4.6kD。
將酶切反應產物上樣SP SepharoseTMFast Flow(AmershamBiosciences)離子交換柱，以10倍柱床體積的上樣緩沖液(150mM Tris·Cl，150mM NaCl，pH7.5)洗柱以除去非特異結合的其它蛋白分子，最后用洗脫緩沖液(150mM Tris·Cl，500mM NaCl，pH11.5)洗脫、收集重組GSLL-39。Tris-Trine電泳顯示經純化后得到GSLL-39的單一條帶，分子量為4.6kD。
實施例3重組GSLL-39抑菌實驗供試菌種為金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和大腸桿菌(Escherichia coli)，接種于3毫升LB培養基中，37℃振蕩培養12小時，6000g離心5分鐘，去上清，沉淀用pH7.4的10mM的磷酸緩沖液沖洗兩次，稀釋成1000個菌落(CFU)/毫升備用。20微升不同濃度的重組GSLL-39混入180微升的菌懸液中，37℃振蕩培養1小時，取100微升上述混合物平鋪于LB平板上，培養16小時，計數每毫升菌落總數(CFU)。GSLL-39對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有抑菌作用，ED50小于5微克/毫升。
序列表<110>中國醫學科學院血液學研究所<120>基因重組人抗菌肽mhCAP-18的活性GSLL-39片段及其制備方法和用途<160>12<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>441<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>(1)..(309)<223>編碼hCAP-18/LL-37的cathelin樣結構域的核苷酸序列<220>
<221>CDS<222>(310)..(327)<223>編碼凝血酶酶切位點核苷酸序列<220>
<221>CDS<222>(328)..(441)<223>編碼hCAP-18/LL-37的LL-37結構域的核苷酸序列(含終止密碼)<220>
<221>mutation<222>(27)..(27)
<223>C to G<400>1cag gtc ctc agc tac aag gaa gct gtg ctt cgt gct ata gat ggc atc48Gln Val Leu Ser Tyr Lys Glu Ala Val Leu Arg Ala Ile Asp Gly Ile1 5 10 15aac cag cgg tcc tcg gat gct aac ctc tac cgc ctc ctg gac ctg gac96Asn Gln Arg Ser Ser Asp Ala Asn Leu Tyr Arg Leu Leu Asp Leu Asp20 25 30ccc agg ccc acg atg gat ggg gac cca gac acg cca aag cct gtg agc144Pro Arg Pro Thr Met Asp Gly Asp Pro Asp Thr Pro Lys Pro Val Ser35 40 45ttc aca gtg aag gag aca gtg tgc ccc agg acg aca cag cag tca cca192Phe Thr Val Lys Glu Thr Val Cys Pro Arg Thr Thr Gln Gln Ser Pro50 55 60gag gat tgt gac ttc aag aag gac ggg ctg gtg aag cgg tgt atg ggg240Glu Asp Cys Asp Phe Lys Lys Asp Gly Leu Val Lys Arg Cys Met Gly65 70 75 80aca gtg acc ctc aac cag gcc agg ggc tcc ttt gac atc agt tgt gat288Thr Val Thr Leu Asn Gln Ala Arg Gly Ser Phe Asp Ile Ser Cys Asp85 90 95aag gat aac aag aga ttt gcc ctg gtg cca cgc ggt tct ctg ctg ggt336Lys Asp Asn Lys Arg Phe Ala Leu Val Pro Arg Gly Ser Leu Leu Gly100 105 110gat ttc ttc cgg aaa tct aaa gag aag att ggc aaa gag ttt aaa aga384Asp Phe Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Glu Phe Lys Arg115 120 125att gtc cag aga atc aag gat ttt ttg cgg aat ctt gta ccc agg aca432Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val Pro Arg Thr130 135 140gag tcc tag441Glu Ser145
<210>2<211>103<212>PRT<213>人工序列<400>2Gln Val Leu Ser Tyr Lys Glu Ala Val Leu Arg Ala Ile Asp Gly Ile1 5 10 15Asn Gln Arg Ser Ser Asp Ala Asn Leu Tyr Arg Leu Leu Asp Leu Asp20 25 30Pro Arg Pro Thr Met Asp Gly Asp Pro Asp Thr Pro Lys Pro Val Ser35 40 45Phe Thr Val Lys Glu Thr Val Cys Pro Arg Thr Thr Gln Gln Ser Pro50 55 60Glu Asp Cys Asp Phe Lys Lys Asp Gly Leu Val Lys Arg Cys Met Gly65 70 75 80Thr Val Thr Leu Asn Gln Ala Arg Gly Ser Phe Asp Ile Ser Cys Asp85 90 95Lys Asp Asn Lys Arg Phe Ala100<210>3<211>6<212>PRT<213>人工序列<400>3Leu Val Pro Arg Gly Ser1 5<210>4<211>37<212>PRT<213>人工序列
<400>4Leu Leu Gly Asp Phe Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Glu1 5 10 15Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val20 25 30Pro Arg Thr Glu Ser35<210>5<211>146<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>PEPTIDE<222>(1)..(103)<223>hCAP-18/LL-37的cathelin樣結構域的氨基酸序列<220>
<221>PEPTIDE<222>(104)..(109)<223>凝血酶酶切位點氨基酸序列<220>
<221>PEPTIDE<222>(110)..(146)<223>hCAP-18/LL-37的LL-37結構域的氨基酸序列<400>5Gln Val Leu Ser Tyr Lys Glu Ala Val Leu Arg Ala Ile Asp Gly Ile1 5 10 15Asn Gln Arg Ser Ser Asp Ala Asn Leu Tyr Arg Leu Leu Asp Leu Asp20 25 30Pro Arg Pro Thr Met Asp Gly Asp Pro Asp Thr Pro Lys Pro Val Ser35 40 45
Phe Thr Val Lys Glu Thr Val Cys Pro Arg Thr Thr Gln Gln Ser Pro50 55 60Glu Asp Cys Asp Phe Lys Lys Asp Gly Leu Val Lys Arg Cys Met Gly65 70 75 80Thr Val Thr Leu Asn Gln Ala Arg Gly Ser Phe Asp Ile Ser Cys Asp85 90 95Lys Asp Asn Lys Arg Phe Ala Leu Val Pro Arg Gly Ser Leu Leu Gly100 105 110Asp Phe Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Glu Phe Lys Arg115 120 125Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val Pro Arg Thr130 135 140Glu Ser145<210>6<211>39<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>PEPTIDE<222>(3)..(39)<223>hCAP-18/LL-37的LL-37結構域的氨基酸序列<400>6Gly Ser Leu Leu Gly Asp Phe Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly1 5 10 15Lys Glu Phe Lys Arg Ile Val G1n Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn20 25 30Leu Val Pro Arg Thr Glu Ser35<210>7
<211>560<212>DNA<213>人類(Homo sapiens)<220>
<221>mutation<222>(27)..(27)<223>A to G<220>
<221>mutation<222>(128)..(128)<223>C to G<400>7gaattccggc catgaagacc caaagggatg gccactccct ggggcggtgg tcactggtgc60tcctgctgct gggcctggtg atgcctctgg ccatcattgc ccaggtcctc agctacaagg120aagctgtgct tcgtgctata gatggcatca accagcggtc ctcggatgct aacctctacc180gcctcctgga cctggacccc aggcccacga tggatgggga cccagacacg ccaaagcctg240tgagcttcac agtgaaggag acagtgtgcc ccaggacgac acagcagtca ccagaggatt300gtgacttcaa gaaggacggg ctggtgaagc ggtgtatggg gacagtgacc ctcaaccagg360ccaggggctc ctttgacatc agttgtgata aggataacaa gagatttgcc ctgctgggtg420atttcttccg gaaatctaaa gagaagattg gcaaagagtt taaaagaatt gtccagagaa480tcaaggattt tttgcggaat cttgtaccca ggacagagtc ctagtgtgtg ccctaccctg540gctcaggctt ctgggctctg560<210>8<211>462<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>primer bind
<222>(1)..(12)<223>Overlap PCR引物序列，含NcoI酶切識別位點及保護堿基序列<220>
<221>CDS<222>(13)..(321)<223>編碼hCAP-18/LL-37的cathelin樣結構域的核苷酸序列<220>
<221>CDS<222>(322)..(339)<223>序列322-339是編碼凝血酶酶切位點核苷酸序列<220>
<221>CDS<222>(340)..(453)<223>編碼hCAP-18/LL-37的LL-37結構域的核苷酸序列(含終止密碼)<220>
<221>primer_bind<222>(454)..(462)<223>Overlap PCR引物序列，含EcoRI酶切識別位點(與終止密碼共用一個堿基g453)及保護堿基序列<220>
<221>mutation<222>(39)..(39)<223>C to G<400>8tataccatgg gt cag gtc ctc agc tac aag gaa gct gtg ctt cgt gct ata51Gln Val Leu Ser Tyr Lys Glu Ala Val Leu Arg Ala Ile1 5 10gat ggc atc aac cag cgg tcc tcg gat gct aac ctc tac cgc ctc ctg 99Asp Gly Ile Asn Gln Arg Ser Ser Asp Ala Asn Leu Tyr Arg Leu Leu15 20 25gac ctg gac ccc agg ccc acg atg gat ggg gac cca gac acg cca aag 147Asp Leu Asp Pro Arg Pro Thr Met Asp Gly Asp Pro Asp Thr Pro Lys30 35 40 45cct gtg agc ttc aca gtg aag gag aca gtg tgc ccc agg acg aca cag 195
Pro Val Ser Phe Thr Val Lys Glu Thr Val Cys Pro Arg Thr Thr Gln50 55 60cag tca cea gag gat tgt gac ttc aag aag gac ggg ctg gtg aag cgg243Gln Ser Pro Glu Asp Cys Asp Phe Lys Lys Asp Gly Leu Val Lys Arg65 70 75tgt atg ggg aca gtg acc ctc aac cag gcc agg ggc tcc ttt gac atc291Cys Met Gly Thr Val Thr Leu Asn Gln Ala Arg Gly Ser Phe Asp Ile80 85 90agt tgt gat aag gat aac aag aga ttt gcc ctg gtg cca cgc ggt tct339Ser Cys Asp Lys Asp Asn Lys Arg Phe Ala Leu Val Pro Arg Gly Ser95 100 105ctg ctg ggt gat ttc ttc cgg aaa tct aaa gag aag att ggc aaa gag387Leu Leu Gly Asp Phe Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Glu110 115 120 125ttt aaa aga att gtc cag aga atc aag gat ttt ttg cgg aat ctt gta435Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val130 135 140ccc agg aca gag tcc tag aattcgtac 462Pro Arg Thr Glu Ser145<210>9<211>103<212>PRT<213>人工序列<400>9Gln Val Leu Ser Tyr Lys Glu Ala Val Leu Arg Ala Ile Asp Gly Ile1 5 10 15Asn Gln Arg Ser Ser Asp Ala Asn Leu Tyr Arg Leu Leu Asp Leu Asp20 25 30Pro Arg Pro Thr Met Asp Gly Asp Pro Asp Thr Pro Lys Pro Val Ser35 40 45
Phe Thr Val Lys Glu Thr Val Cys Pro Arg Thr Thr Gln Gln Ser Pro50 55 60Glu Asp Cys Asp Phe Lys Lys Asp Gly Leu Val Lys Arg Cys Met Gly65 70 75 80Thr Val Thr Leu Asn Gln Ala Arg Gly Ser Phe Asp Ile Ser Cys Asp85 90 95Lys Asp Asn Lys Arg Phe Ala100<210>10<211>6<212>PRT<213>人工序列<400>10Leu Val Pro Arg Gly Ser1 5<210>11<211>37<212>PRT<213>人工序列<400>11Leu Leu Gly Asp Phe Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Glu1 5 10 15Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val20 25 30Pro Arg Thr Glu Ser35<210>12<211>307<212>PRT<213>人工序列
<220>
<221>PEPTIDE<222>(1)..(109)<223>TrxA結構域的氨基酸序列<220>
<221>PEPTIDE<222>(110)..(161)<223>序列110-161是pET32c(+)載體序列翻譯成的氨基酸序列<220>
<221>PEPTIDE<222>(162)..(264)<223>hCAP-18/LL-37的cathelin樣結構域的氨基酸序列<220>
<221>PEPTIDE<222>(265)..(270)<223>凝血酶酶切位點氨基酸序列<220>
<221>PEPTIDE<222>(271)..(307)<223>hCAP-18/LL-37的LL-37結構域的氨基酸序列<400>12Met Ser Asp Lys Ile Ile His Leu Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thr Asp1 5 10 15Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala Ile Leu Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp20 25 30Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Ala Pro Ile Leu Asp Glu Ile Ala Asp35 40 45Glu Tyr Gln Gly Lys Leu Thr Val Ala Lys Leu Asn Ile Asp Gln Asn50 55 60Pro Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Gly Ile Arg Gly Ile Pro Thr Leu Leu65 70 75 80Leu Phe Lys Asn Gly Glu Val Ala Ala Thr Lys Val Gly Ala Leu Ser
85 90 95Lys Gly Gln Leu Lys Glu Phe Leu Asp Ala Asn Leu Ala Gly Ser Gly100 105 110Ser Gly His Met His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro115 120 125Arg Gly Ser Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln130 135 140His Met Asp Ser Pro Asp Leu Gly Thr Asp Asp Asp Asp Lys Ala Met145 150 155 160Gly Gln Val Leu Ser Tyr Lys Glu Ala Val Leu Arg Ala Ile Asp Gly165 170 175Ile Asn Gln Arg Ser Ser Asp Ala Asn Leu Tyr Arg Leu Leu Asp Leu180 185 190Asp Pro Arg Pro Thr Met Asp Gly Asp Pro Asp Thr Pro Lys Pro Val195 200 205Ser Phe Thr Val Lys Glu Thr Val Cys Pro Arg Thr Thr Gln Gln Ser210 215 220Pro Glu Asp Cys Asp Phe Lys Lys Asp Gly Leu Val Lys Arg Cys Met225 230 235 240Gly Thr Val Thr Leu Asn Gln Ala Arg Gly Ser Phe Asp Ile Ser Cys245 250 255Asp Lys Asp Asn Lys Arg Phe Ala Leu Val Pro Arg Gly Ser Leu Leu260 265 270Gly Asp Phe Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Glu Phe Lys275 280 285Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val Pro Arg290 295 300Thr Glu Ser30權利要求
1.一種基因重組人抗菌肽mhCAP-18的活性GSLL-39片段，其特征是所述的mhCAP-18包含146個氨基酸或其活性片段，編譯mhCAP-18的cDNA序列包含441個核苷酸堿基或其改構體；mhCAP-18在體外經凝血酶酶切得到重組人抗菌肽活性GSLL-39片段，GSLL-39的氨基酸序列為GSLLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES。
2.一種基因重組人抗菌肽mhCAP-18的活性GSLL-39片段的制備方法，其特征是包括a.利用原核細胞生產含凝血酶酶切位點的人抗菌肽mhCAP-18；b.利用凝血酶酶切含凝血酶酶切位點的人抗菌肽mhCAP-18，獲得重組人抗菌肽活性GSLL-39片段。
3.根據權利要求2所述的基因重組人抗菌肽mhCAP-18的活性GSLL-39片段的制備方法，其特征是所述的原核細胞為大腸桿菌。
4.根據權利要求3所述的基因重組人抗菌肽mhCAP-18的制備方法，其特征是所述的利用原核細胞生產基因重組含凝血酶酶切位點的人抗菌肽mhCAP-18包括以下步驟a.根據hCAP-18/LL-37的基因序列設計PCR引物進行反轉錄PCR擴增，獲得表達hCAP-18/LL-37的基因片段，然后根據hCAP-18/LL-37分子cathelin樣結構域、LL-37結構域構和凝血酶酶切位點序列再設計PCR引物，采用Overlap PCR進行擴增，獲得表達含凝血酶酶切位點的人抗菌肽mhCAP-18的基因片段，通過雙酶酶切，定向克隆到原核表達載體中，構建表達載體，并轉化大腸桿菌成為工程菌；b.重組含凝血酶酶切位點的人抗菌肽mhCAP-18的純化誘導后的工程菌，經超聲破碎細菌后離心取上清，再經過層析的方法；c.活性人抗菌肽GSLL-39的純化經純化的重組含凝血酶酶切位點的人抗菌肽mhCAP-18在體外經凝血酶酶切，再經SP離子交換層析及除菌、濃縮和凍干。
5.根據權利要求4所述的基因重組人抗菌肽mhCAP-18的制備方法，其特征是所述的原核表達載體是pET系列載體表達系統、T7表達系統、pBAD表達系統、pTrc表達系統、PurePro Caulobacter表達系統、PL表達系統中的一種。
6.根據權利要求4所述的基因重組人抗菌肽mhCAP-18的制備方法，其特征是所述的雙酶酶切是通過NcoI和EcoRI雙酶切位點，所述的原核表達載體是pET32c(+)，構建的表達載體為pET-mhCAP-18。
7.根據權利要求5或6所述的基因重組人抗菌肽mhCAP-18的活性GSLL-39片段方法，其特征是所述的層析方法是Ni2+鏊合層析。
8.根據權利要求1所述的基因重組人抗菌肽mhCAP-18的活性GSLL-39片段，其特征是所述的GSLL-39片段用于預防或治療hCAP-18/LL-37相關疾病。
9.根據權利要求8所述的基因重組人抗菌肽mhCAP-18的活性GSLL-39片段的用途，其特征是所述的hCAP-18/LL-37相關疾病選自感染性疾病、皮膚損傷修復或格蘭氏陰性細菌引起的感染性休克。
10.根據權利要求1所述的基因重組人抗菌肽mhCAP-18的活性GSLL-39片段的用途，其特征是應用途徑包括霧化、外涂、外敷、浸泡的外用，肌肉注射，皮下注射，皮內注射，靜脈注射或口服。
全文摘要
本發明公開了一種基因重組人抗菌肽mhCAP－18的活性GSLL－39片段及其制備方法和用途，所述的mhCAP－18包含146個氨基酸或其活性片段，編譯mhCAP－18的cDNA序列包含441個核苷酸堿基或其改構體；mhCAP－18在體外經凝血酶酶切得到重組人抗菌肽活性GSLL－39片段，GSLL－39的氨基酸序列為GSLLGD FFRKSKEK IGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES。在原核體系中表達hCAP－18的方法，通過同時表達hCAP－18的cathelin樣結構域和LL－37結構域，并在兩個結構域間加入凝血酶酶切位點，成功表達沒有抗微生物活性的改造后的mhCAP－18，再經體外酶切、純化，可獲得具有抗微生物活性的重組GSLL－39。GSLL－39與藥物學可接受的其它藥物組合物，所述藥物組合物可給予人以預防、治療hCAP－18/LL－37相關的各種疾病。
文檔編號C07K14/435GK1597695SQ0314428
公開日2005年3月23日 申請日期2003年9月17日 優先權日2003年9月17日
發明者吳克復, 鄭國光, 楊應華, 李戈, 饒青 申請人:中國醫學科學院血液學研究所