一種產琥珀酸的釀酒酵母基因工程菌及其應用
【專利摘要】本發明公開了一種產琥珀酸的釀酒酵母基因工程菌及其應用，屬于遺傳工程和發酵工程領域。本發明用來源于米根霉的蘋果酸脫氫酶基因RoMDH替換PDC1，野生型釀酒酵母發酵的乙醇產量達到最大值13.55±1.062g/L，改造菌株MP乙醇產量分別為11.09±0.539g/L，較野生型下降了18.15％。在此基礎上，敲除SDH2基因。經培養基優化后，MPΔS缺失株可積累琥珀酸0.698±0.0285g/L，相比之下，野生型釀酒酵母不積累琥珀酸。本發明可以有效減少碳流的損失，為構建工程酵母高效生產琥珀酸創造了條件，具有很好的工業應用價值和前景。
【專利說明】
一種產琥珀酸的釀酒酵母基因工程菌及其應用
技術領域
[0001] 本發明涉及一種產琥珀酸的釀酒酵母基因工程菌及其應用，屬于遺傳工程和發酵 工程領域。
【背景技術】
[0002] 琥?白酸（succinic acid)是一種四碳二元酸，學名為丁二酸(butanedioic acid)。 琥珀酸具有30多種重要衍生物化學制品：四氫呋喃、1，4-丁二醇、γ-丁內酯、馬來酸和反丁 烯二酸等，具有巨大的市場空間。在食品行業的主要酸味劑、調味劑等，在醫藥行業可用于 合成鎮靜劑、pH調節劑、避孕藥、抗癌藥物等，在化學行業的主要用作離子螯合劑、表面活性 劑、清潔劑添加劑、起泡劑和潤滑劑等。值得一提的是，琥珀酸作為生物可降解塑料聚丁二 酸丁二醇酯（可完全降解）的主要原料，具有廣泛的應用前景。鑒于上述琥珀酸的重要應用 價值及諸多優勢，美國能源部于2004年專門成立了 1，4_二羧酸組，研究琥珀酸、蘋果酸和延 胡索酸的生產工藝和應用。
[0003] 目前琥珀酸的生產方法主要有化學合成法和微生物發酵法。與化學合成法相比， 微生物發酵法具有很多優勢：原料來源廣，成本低，可再生;反應條件溫和，能耗小，環境友 好。因此，微生物發酵法生產琥珀酸備受人們的關注，近年來，微生物法生產琥珀酸的研究 進展迅速。釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)作為一種真核模式微生物，因具有:遺傳 信息豐富，代謝改造操作方便;營養需求簡單，分離提取工藝成本低廉;在低pH條件下(甚至 口!1〈3.0)生長良好；能夠耐受高濃度的底物；被？04認證為61^3(66116^11^8 &^6(1八8 Safe)微生物，發酵產品具有安全性等優點而成為發酵生產羧酸(乳酸、丙酮酸、蘋果酸、延 胡索酸、琥珀酸、酮戊二酸等)的潛在最適微生物。然而，利用釀酒酵母發酵生產琥珀酸面 臨以下問題：（1)在高濃度糖及通風的條件分批發酵產生大量的乙醇，對于以羧酸為目標產 物來說，乙醇的大量積累使得碳流大量的損失；（2)琥珀酸是TCA循環中的中間代謝產物，釀 酒酵母本身不具有過量積累琥珀酸的代謝途徑，需要構建琥珀酸的合成途徑，但琥珀酸有 比較高的還原勢，若通過TCA還原途徑積累琥珀酸，需要兩個還原氫，比較難積累；（3)實現 減少乙醇產生，丙酮酸得到積累后，如何使得丙酮酸進一步轉化為目標產物琥珀酸，需要增 強丙酮酸羧化反應，使之轉化為草酰乙酸，進入TCA循環，進而轉化為琥珀酸，這一策略琥珀 酸廣量提尚的關鍵。

【發明內容】

[0004] 本發明要解決的第一個技術問題是提供一種產琥珀酸的釀酒酵母基因工程菌，為 代謝工程改造釀酒酵母高效生產琥珀酸打下基礎。
[0005] 所述工程菌是以釀酒酵母為出發菌株，用蘋果酸脫氫酶基因替換了乙醇代謝途徑 中的丙酮酸脫羧酶基因 PDC1，在此基礎上，敲除了琥珀酸代謝途徑中的琥珀酸脫氫酶基因 SDH2。
[0006] 在本發明的一種實施方式中，所述蘋果酸脫氫酶基因來源于米根霉。
[0007] 在本發明的一種實施方式中，所述琥珀酸脫氫酶基因 SDH2的核苷酸序列如Gene ID: 1360234所示。
[0008] 在本發明的一種實施方式中，所述釀酒酵母為釀酒酵母CEN.PK2-1C，購自 EUROSCARF(//web·uni-frankfurt·de/fbl5/mikro/euroscarf/data/cen·html);其 基因型為：MATa;ura3-52; trpl-289; leu2-3，112;his3 Δ 1 ;MAL2-8C; SUC2〇
[0009] 本發明要解決的第二個技術問題是提供構建所述釀酒酵母基因工程菌的的方法， 將序列如SEQ ID _.5所示的？0(：1替換敲除盒，以及50!12敲除盒，分別轉化釀酒酵母 CEN. PK2-1C，構建得到產琥珀酸的釀酒酵母基因工程菌。
[0010] 所述SDH2敲除盒是以質粒pUG27為模板，以SEQIDN0.3、SEQIDN0.4所示引物進 行PCR擴增得到的。
[0011] 所述pUG27質粒的構建方法參見"Guldener U,Heck S,Fielder T，et al .A new efficient gene disruption cassette for repeated use in budding yeast.Nucleic AcidsRes，1996,24(13):2519-2524^lP"GuoqiangXu，QiangHua，etal.Regulation ofthiamine synthesis in Saccharomyces cerevisiae for improved pyruvate production. Yeast，2012，29:209-217"。
[0012] 本發明所要解決的第三個技術問題是提供一種應用所述釀酒酵母基因工程菌發 酵生產羧酸的方法。
[0013] 所述羧酸包括乳酸、丙酮酸、蘋果酸、延胡索酸、琥珀酸、α-酮戊二酸等。
[0014] 在本發明的一種實施方式中，所述方法包括以下步驟:將30°C、220rpm下培養24h 的基因工程菌種子以5%的接種量轉入發酵培養基于30°C、220rpm條件下培養96h。
[0015] 種子培養基為Yro培養基:葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L。
[0016] 發酵培養基：無氨基酵母氮源1.78凡、（順4)230458/1、葡萄糖2(^/1，添加碳酸鈣 5g/L〇
[0017] 采用釀酒酵母CEN.PK2-1C為出發菌株時，發酵培養基中還需添加亮氨酸100mg/L、 色氨酸20mg/L、組氨酸20mg/L、尿啼啶20mg/L。
[0018] 本發明用蘋果酸脫氫酶基因 RoMDH替換PDC1，野生型釀酒酵母發酵的乙醇產量達 到最大值13.55±1.0628/1，改造菌株的乙醇產量為11.09±0.5398/1，較野生型下降了 18.15%。在此基礎上，敲除SDH2基因，經培養基優化后，雙基因缺少的釀酒酵母基因工程菌 可積累琥珀酸〇. 698 ± 0.0285g/L，相比之下，野生型釀酒酵母不積累琥珀酸。本發明可以有 效減少碳流的損失，并實現琥珀酸的積累，所得基因工程菌可用于構建其他羧酸高產菌株。
【附圖說明】
[0019] 圖1 roci的替換表達敲除盒，大小為2724bp
[0020] 圖2 SDH2敲除盒，大小為1544bp。
[0021] 圖3 PDC1基因敲除或者替換對乙醇發酵的影響。（a)菌體生長；（b)葡萄糖利用； (c)丙酮酸；（d)副產物乙醇。
[0022]圖4 SDH2基因缺失對琥珀酸發酵的影響。（a)菌體生長；（b)葡萄糖利用；（c)琥珀 酸；（d)副產物乙醇。
【具體實施方式】
[0023] 高效液相色譜測定乙醇、殘糖含量的方法:發酵液中乙醇和殘糖含量的測定采用 高效液相色譜儀(HPLC)檢測。發酵液經處理且上清液經0.22μπι微孔濾膜過濾后，利用RID (示差折光檢測器)進行檢測，液相色譜方法如下:色譜柱:BIO-RAD有機酸柱;柱溫:35°C ;流 動相：0.0275%(v/v)稀硫酸，經0.2 2μηι濾膜過濾并除氣；流速：0.6mL/mi η;檢測時間： 25min;進樣量：20yL。
[0024] 生物量的測定方法(Bio-Rid核酸儀）：用0.1M HC1稀釋適當的倍數，設定波長為 600nm，取200yU則定其吸光值。
[0025]乙醇的測定方法(HPLC法）：高效液相色譜儀為美國Waters公司產品，型號為1515， 色譜柱為Aminex HPX-87H column(Bio-Rad)。乙醇用RID檢測器。
[0026] 種子培養基組成:葡萄糖2%，酵母提取物1%，蛋白胨2%，去離子水定容，pH自然， 高壓滅菌（115°C，20min)。
[0027] 發酵培養基組成:無氨基酵母氮源3.4g/L，硫酸銨5g/L，葡萄糖40g/L，按要求分別 添加亮氨酸l〇〇mg/L、色氨酸20mg/L、組氨酸20mg/L、尿啼啶20mg/L。添加碳酸^Sg/L，裝液 量為 40mL/250mL。
[0028] 實施例1低產乙醇及積累琥珀酸釀酒酵母工程菌的構建
[0029] 在野生型基礎上用源于米根霉的蘋果酸脫氫酶基因 RoMDH替換了丙酮酸脫羧酶基 因 roci。在此基礎上，敲除琥珀酸代謝途徑中的關鍵酶基因 SDH2。
[0030] 1、菌株和質粒
[0031 ]釀酒酵母（S · cerevisiae)CEN. PK2-1C購自歐洲EUROSCARF(//web·uni- frankfurt · de/fbl5/mikro/euroscarf/data/cen · html)，其基因型為MATa; ura3_52; trpl- 289;leu2-3，112;his3A 1;MAL2-8G;SUC2。敲除盒模板 pUG27 質粒(包含 HIS3 標記基因 ）、Cre 表達質粒pSH47(用來標記回收）的構建方法參見文獻"Guldener U，Heck S，Fielder T，et al.A new efficient gene disruption cassette for repeated use in budding yeast [J].Nucleic Acids Res,1996,24(13):2519_2524"和"Guoqiang Xu,Qiang Hua，et al.Regulation of thiamine synthesis in Saccharomyces cerevisiae for improved pyruvate production.Yeast,2012,29:209-217" 〇
[0032] 2、基因敲除盒的構建
[0033] 以質粒ST+RoMDH+TDHt+HIS為模板，以MP-F、MP-R引物進行PCR擴增，獲得序列如 SEQ ID勵.5所示的用1?)!1替換1^(：1的!115敲除盒，其部分序列與待敲除基因1^(：1編碼區上 下游同源的DNA片段，其核酸電泳圖如圖1泳道1和2所示。以質粒pUG27為模板，以SDH2-F、 SDH2-R引物進行PCR擴增，獲得SDH2的敲除盒，其核酸電泳圖如圖2泳道1所示。所用到的引 物序列如表1:
[0034] 表1.用RoMDH替換敲除H)C1基因及敲除SDH2所用到的引物
[0035]
[0036] 3、轉化
[0037] 用LiAc方法將PDC1替換敲除盒轉化釀酒酵母CEN.PK2-1C，涂布SD-HIS平板，得到 的陽性轉化子提基因組進行PCR驗證，正確的轉化子保菌，即為pdcl單基因缺失株CEN.PK2- 1CMP。并用質粒pSH47將HIS標記去除。在此基礎上，將SDH2基因敲除盒轉化到釀酒酵母 CEN. PK2-1CMP，涂布SD-HIS平板，得到的陽性轉化子提基因組進行PCR驗證，正確的轉化子 保菌，即為sdh2基因缺失株。通過改造代謝途徑，得到可減少乙醇積累的釀酒酵母工程菌。
[0038] 實施例2發酵法產琥珀酸
[0039] 將30°C、220rpm下培養24h的基因工程菌種子以起始0D6Q() = 0.2的接種量轉入發酵 培養基于30°C、220rpm條件下培養96h，每隔一定的時間段取樣測0D，同時取樣lmL離心保存 用來測乙醇和琥珀酸的產量。
[0040]細胞生物量的測定方法：
[0041 ]取一定量的菌懸液置于1.5mL EP中，加適量的0.1M的稀鹽酸溶解菌懸液中的碳酸 鈣并同時稀釋到合適倍數，渦旋混勻，用Bio-Rid核酸儀，于600nm處比色測0D值。
[0042]乙醇和琥珀酸含量的測定方法(HPLC法）：
[0043] 將每個時間點的發酵液12000rpm離心2min，取上清500yL，用三氯乙酸等倍處理， 于4°C放置3h以上，沉降蛋白。然后用0.22μπι的親水膜過濾后，得到的樣品進行HPLC分析。
[0044] 對照菌株Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1C在36h時積累乙醇達 13.55土 1.062g/L，用RoMDH替換PDC1后，乙醇產量下降到11.09 ± 0.539g/L，較改造前下降了 18.15 %。在此基礎上，SDH2敲除后，琥珀酸產量達到0.698 ±0.0285g/L，而敲除前，酵母菌 株是不積累琥珀酸的。
[0045] 雖然本發明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發明，任何熟悉此技 術的人，在不脫離本發明的精神和范圍內，都可做各種的改動與修飾，因此本發明的保護范 圍應該以權利要求書所界定的為準。
【主權項】
1. 一種產琥珀酸的釀酒酵母基因工程菌，其特征在于，以釀酒酵母為出發菌株，用蘋果 酸脫氫酶基因替換了乙醇代謝途徑中的丙酮酸脫羧酶基因 roci，并敲除了琥珀酸代謝途徑 中的琥珀酸脫氫酶基因 SDH2。2. 根據權利要求1所述的一種產琥珀酸的釀酒酵母基因工程菌，其特征在于，所述蘋果 酸脫氫酶基因來源于米根霉。3. 根據權利要求1所述的一種產琥珀酸的釀酒酵母基因工程菌，其特征在于，所述琥珀 酸脫氫酶基因 SDH2的核苷酸序列如Gene ID: 1360234所示。4. 根據權利要求1所述的一種產琥珀酸的釀酒酵母基因工程菌，其特征在于，所述釀酒 酵母為釀酒酵母CEN.PK2-1C;其基因型為:MATa;ura3-52; trpl-289; leu2-3，112 ;his3 Δ 1; MAL2-8c；SUC2〇5. -種構建權利要求1-4任一所述的釀酒酵母基因工程菌的的方法，其特征在于，將序 列如SEQ ID N0.5所示的PDC1替換敲除盒，以及SDH2敲除盒，分別轉化釀酒酵母CEN.PK2-1C，構建得到產琥珀酸的釀酒酵母基因工程菌。6. -種應用權利要求1-4任一所述釀酒酵母基因工程菌發酵生產羧酸的方法，其特征 在于，所述羧酸包括乳酸、丙酮酸、蘋果酸、延胡索酸、琥珀酸、酮戊二酸。7. 根據權利要求6所述的方法，其特征在于，包括以下步驟:將30 °C、220rpm下培養24h 的基因工程菌種子以5%的接種量轉入發酵培養基于30°C、220rpm條件下培養96h;發酵培 養基:無氨基酵母氮源1.78/1、（順4) 23〇458/1、葡萄糖2(^/1，添加碳酸鈣58/1。8. 根據權利要求6或7所述的方法，其特征在于，采用釀酒酵母CEN.PK2-1C為出發菌株 時，發酵培養基中還需添加亮氨酸l〇〇mg/L、色氨酸20mg/L、組氨酸20mg/L、尿啼啶20mg/L。9. 權利要求1-4任一所述釀酒酵母基因工程菌在構建羧酸高產菌株中的應用。
【文檔編號】C12N15/81GK105838632SQ201610333309
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年5月19日
【發明人】徐國強, 蔣伶活, 蘇珂, 李佳雨, 劉維瑾, 范歐洋, 趙禎
【申請人】江南大學