本發明(ming)涉及一(yi)種用(yong)于(yu)生產1-羥基吩嗪的基因(yin)工(gong)程(cheng)菌株及其制備方(fang)法和用(yong)途(tu)，屬于(yu)基因(yin)工(gong)程(cheng)技術領域。

背景技術：

吩(fen)嗪(qin)衍(yan)(yan)生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)(wu)是一類含氮雜(za)環化(hua)合(he)物(wu)(wu)(wu)(wu)，通常顏色各(ge)異，以橙色或(huo)黃色為主，也有(you)(you)綠色、紅色等，側鏈取(qu)代基的(de)(de)不(bu)(bu)同(tong)(tong)(tong)決定(ding)了(le)吩(fen)嗪(qin)顏色的(de)(de)不(bu)(bu)同(tong)(tong)(tong)，而結構(gou)上(shang)的(de)(de)差異同(tong)(tong)(tong)時決定(ding)了(le)各(ge)自不(bu)(bu)同(tong)(tong)(tong)的(de)(de)物(wu)(wu)(wu)(wu)理屬性以及抑制病(bing)原菌(jun)(jun)(jun)的(de)(de)生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)(wu)活性。目(mu)前(qian)自然(ran)界已經發現了(le)多種(zhong)具(ju)有(you)(you)相似基本(ben)結構(gou)的(de)(de)吩(fen)嗪(qin)類化(hua)合(he)物(wu)(wu)(wu)(wu)，有(you)(you)些產吩(fen)嗪(qin)的(de)(de)菌(jun)(jun)(jun)株(zhu)能同(tong)(tong)(tong)時產生(sheng)(sheng)好幾種(zhong)不(bu)(bu)同(tong)(tong)(tong)的(de)(de)吩(fen)嗪(qin)衍(yan)(yan)生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)(wu)，而幾乎所有(you)(you)的(de)(de)吩(fen)嗪(qin)化(hua)合(he)物(wu)(wu)(wu)(wu)對(dui)細菌(jun)(jun)(jun)和(he)真菌(jun)(jun)(jun)都有(you)(you)生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)(wu)活性。假單胞菌(jun)(jun)(jun)產生(sheng)(sheng)的(de)(de)吩(fen)嗪(qin)類抗生(sheng)(sheng)素主要(yao)包(bao)括綠膿(nong)菌(jun)(jun)(jun)素(pyocyanin，PYO)和(he)吩(fen)嗪(qin)-1-羧酰胺(phenazine-1-carboxamide，PCN)、吩(fen)嗪(qin)-1-羧酸(phenazine-1-carboxilic acid,PCA)、1-羥(qian)基吩(fen)嗪(qin)(1-hydroxyphenazine，1-OH-PHZ)、2-羥(qian)基吩(fen)嗪(qin)(2-hydroxyphenazine，2-OH-PHZ)等。研究表明，吩(fen)嗪(qin)不(bu)(bu)僅具(ju)有(you)(you)抑制病(bing)原菌(jun)(jun)(jun)的(de)(de)生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)(wu)活性，它也在根(gen)部定(ding)植及根(gen)際競爭存活方面也起到(dao)了(le)非常重要(yao)的(de)(de)作(zuo)用(yong)。

1-羥基(ji)(ji)吩嗪(1-OH-PHZ)是一種由銅綠假單胞(bao)菌(Pseudomonas aeruginosa)產生(sheng)的(de)(de)(de)(de)次(ci)生(sheng)代(dai)謝產物(wu)。它(ta)在細(xi)胞(bao)內可作為電子載體。當細(xi)胞(bao)進(jin)行(xing)氧化(hua)還原反應時，將電子傳遞到(dao)靶(ba)細(xi)胞(bao)，導致靶(ba)細(xi)胞(bao)中(zhong)超(chao)氧化(hua)物(wu)的(de)(de)(de)(de)氧自由基(ji)(ji)增加而使細(xi)胞(bao)死亡。在對(dui)(dui)1-OH-PHZ的(de)(de)(de)(de)基(ji)(ji)本性(xing)質進(jin)行(xing)研(yan)究(jiu)的(de)(de)(de)(de)文(wen)獻中(zhong)，Kawata等(deng)人(ren)研(yan)究(jiu)了在閃(shan)光燈照射下，2-OH-PHZ有互變異構(gou)現象，但(dan)1-OH-PHZ比較穩定(ding)。也(ye)有文(wen)獻對(dui)(dui)其生(sheng)物(wu)活(huo)性(xing)進(jin)行(xing)了研(yan)究(jiu)[Kawata,Hiroki；Niizuma,Shigeya；Kikuchi,Koichi.Studies ofphotoinduced tautomerism of2-hydroxyphenazine using flash photolysis[J].Journal ofPhotochemistry and Photobiology,A:Chemistry(1990),54(3),93-8.]。Badria,FaridA等(deng)人(ren)從(cong)以假單胞(bao)菌發酵液的(de)(de)(de)(de)粗提(ti)取(qu)物(wu)進(jin)行(xing)實驗，發現其抑制(zhi)(zhi)多種革蘭氏陽性(xing)菌，白色念(nian)珠菌和釀酒酵母，而從(cong)這種粗提(ti)取(qu)物(wu)中(zhong)鑒定(ding)到(dao)了1-OH-PHZ[Badria,Farid A.；El-Naggar.A.Structures and antimicrobial activity of five phenazine pigments isolated from Pseudomonas aeruginosa.Scientia Pharmaceutica(1994),62(4),355-62]。Mangan等(deng)人(ren)發現1-OH-PHZ對(dui)(dui)土(tu)曲霉菌有很強(qiang)的(de)(de)(de)(de)抗性(xing)。Dakhama,A等(deng)人(ren)研(yan)究(jiu)了1-OH-PHZ對(dui)(dui)于藻(zao)類的(de)(de)(de)(de)抑制(zhi)(zhi)作用，證(zheng)明1-OH-PHZ具有很強(qiang)的(de)(de)(de)(de)抗綠藻(zao)和藍藻(zao)的(de)(de)(de)(de)活(huo)性(xing)，可作為一種天然(ran)產物(wu)進(jin)行(xing)海洋的(de)(de)(de)(de)防污[Mangan,Aedine.Bristol Gen.Interactions between some auralAspergillus species and bacteria[J].Journal ofGeneral Microbiology(1969),58(2),261-6]。

1-OH-PHZ作為(wei)一(yi)種微生(sheng)物(wu)的(de)次生(sheng)代謝產(chan)物(wu)，它的(de)合(he)成方法可(ke)以分(fen)為(wei)生(sheng)物(wu)合(he)成途(tu)(tu)徑(jing)與化學合(he)成途(tu)(tu)徑(jing)。其中(zhong)，對于生(sheng)物(wu)合(he)成途(tu)(tu)徑(jing)來(lai)說，絕大多數文獻(xian)(xian)認為(wei)假(jia)單胞菌(jun)是1-OH-PHZ的(de)主(zhu)要生(sheng)產(chan)菌(jun)。早期有文獻(xian)(xian)顯示(shi)(shi)吩嗪生(sheng)物(wu)合(he)成的(de)前(qian)體(ti)來(lai)自(zi)于莽(mang)草(cao)酸途(tu)(tu)徑(jing)，莽(mang)草(cao)酸通過圖(tu)1所(suo)示(shi)(shi)的(de)生(sheng)物(wu)轉(zhuan)化途(tu)(tu)徑(jing)轉(zhuan)變為(wei)分(fen)支(zhi)酸，并進(jin)一(yi)步合(he)成吩嗪-1-羧酸，最后在PhzS蛋白的(de)作用下轉(zhuan)變為(wei)1-OH-PHZ。

對于化學合成(cheng)(cheng)途徑來(lai)說，文獻提(ti)出可以(yi)對前體進行修飾來(lai)合成(cheng)(cheng)1-OH-PHZ。首先(xian)，從(cong)苯並呋喃氧(yang)化物(wu)與環(huan)己(ji)二酮(tong)的(de)環(huan)加成(cheng)(cheng)反應(ying)得到(dao)1-OH-PHZ的(de)氮(dan)氧(yang)化物(wu)。這樣(yang)，使用連(lian)二亞硫酸鈉還原氮(dan)氧(yang)化部分來(lai)得到(dao)1-OH-PHZ。Haddadin等(deng)人提(ti)出將苯並呋喃氧(yang)化物(wu)與1，2-環(huan)己(ji)二酮(tong)在三乙(yi)胺，氮(dan)氣條件下(xia)反應(ying)7到(dao)8小(xiao)時，得到(dao)一種深棕色反應(ying)混合物(wu)。將這種混合物(wu)酸化，得到(dao)1-羥(qian)基(ji)吩(fen)嗪氮(dan)氧(yang)化物(wu)的(de)混合物(wu)。未加工的(de)1-羥(qian)基(ji)吩(fen)嗪氮(dan)氧(yang)化合物(wu)用連(lian)二亞硫酸鈉處理(li)后得到(dao)1-OH-PHZ[Haddadin,M.J.,et al."Deoxygenation of quinoxaline N-oxides and related compounds."Tetrahedron 30.5(1974):659-666.]。

當前的(de)技(ji)術缺陷：天然的(de)1-羥基吩嗪化合物主要出(chu)現(xian)在(zai)(zai)人類的(de)條件致病菌——銅綠假(jia)單胞菌中(zhong)，在(zai)(zai)該細胞內是以吩嗪-1-羧酸為底物，在(zai)(zai)phzS基因(yin)的(de)作用(yong)轉化而來(lai)，不僅其胞內含量非常低，而且該菌種存在(zai)(zai)一定的(de)生物安(an)全性問題，難以進(jin)行大規模(mo)的(de)開發應用(yong)。

技術實現要素：

針對現有(you)技術中(zhong)的缺陷(xian)，本發明的目的是提供一種用于生產(chan)1-羥基吩嗪的基因工程菌株及(ji)其(qi)制備方法。

本發明是通過以下技術方(fang)案實(shi)現的：

第一(yi)方(fang)面，本發明提供了一(yi)種用于(yu)生產1-羥基(ji)吩嗪的基(ji)因工程菌株，其可通過如下方(fang)法獲得：

將(jiang)綠(lv)(lv)針假單(dan)胞(bao)菌HT66(Pseudomonas chlororaphis HT66)CCTCCNO:M2013467及其(qi)衍(yan)生物基(ji)(ji)因(yin)組中的(de)(de)(de)phzH基(ji)(ji)因(yin)(phzH的(de)(de)(de)基(ji)(ji)因(yin)的(de)(de)(de)堿基(ji)(ji)序(xu)列(lie)和對應蛋白質(zhi)的(de)(de)(de)氨(an)基(ji)(ji)酸序(xu)列(lie)分(fen)別如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示)替換為外源的(de)(de)(de)phzS基(ji)(ji)因(yin)，即得。作為優選方案，所述(shu)phzS基(ji)(ji)因(yin)來自可(ke)將(jiang)吩(fen)嗪-1-羧酸轉化為1-羥基(ji)(ji)吩(fen)嗪的(de)(de)(de)銅(tong)綠(lv)(lv)假單(dan)胞(bao)菌株，如銅(tong)綠(lv)(lv)假單(dan)胞(bao)菌株PAOl(參見(jian)Stover C K,Pham X Q,Erwin A L,et al.Complete genome sequence of Pseudomonas aeruginosa PAO1,an opportunistic pathogen[J].Nature,2000,406(6799):959-964.)、PA14(參見(jian)Liberati N T,Urbach J M,Miyata S,et al.An ordered,nonredundant library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14transposon insertion mutants[J].Proceedings ofthe NationalAcademy ofSciences ofthe United States ofAmerica,2006,103(8):2833-2838.)、M18(參見(jian)Wei X,Huang X,Tang L,et al.Global control of GacA in secondary metabolism,primary metabolism,secretion systems,and motility in the rhizobacterium Pseudomonas aeruginosa M18[J].Journal of bacteriology,2013,195(15):3387-3400.)、NCGM2.S1(參見(jian)Miyoshi-Akiyama T,Kuwahara T,Tada T,et al.Complete genome sequence of highly multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa NCGM2.S1,a representative strain of a cluster endemic to Japan[J].Journal ofbacteriology,2011,193(24):7010-7010.)、LESB58(參見(jian)Kukavica-Ibrulj I,BragonziA,Paroni M,et al.In vivo growth of Pseudomonas aeruginosa strains PAO1and PA14and the hypervirulent strain LESB58in a rat model ofchronic lung infection[J].Journal ofbacteriology,2008,190(8):2804-2813.)。

其中，銅綠假(jia)單胞菌株PAOl、PA14、M18、NCGM2.S1、LESB58中phzS基因的堿(jian)基序列分(fen)別如(ru)SEQ ID NO3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7所示。

第(di)二方面(mian)，本(ben)發明提供了一種(zhong)如前述的用于(yu)生產1-羥基吩嗪的基因(yin)工程菌株的制備方法(fa)，其特(te)征在于(yu)，包括如下(xia)步驟：

1)重組質(zhi)粒的構(gou)建；

2)雙親雜交；

3)基因(yin)替換突變株的(de)篩(shai)選。

作為(wei)優選方案，所述重(zhong)組質(zhi)粒的構建包括如下操作：

分別設(she)計用于擴(kuo)增phzH的上(shang)游同源(yuan)臂引(yin)物F1和R1、下游同源(yuan)臂引(yin)物F3和R3，以(yi)及(ji)phzS基因的擴(kuo)增引(yin)物F2和R2并擴(kuo)增相應的基因片段；

通過(guo)Infusion體系連接質粒pK18mobsacB，將phzS基因與phzH基因的上(shang)游片段(duan)和下游片段(duan)整合(he)在一起；

重組質粒轉化大腸(chang)桿菌DH5α感受態細胞(bao)；

其(qi)中，所述F1、R1、F2、R2、F3和R3的基因序列分(fen)別如SEQ ID NO8、SEQ ID NO9、SEQ ID NO10、SEQ ID NO11、SEQ ID NO12、SEQ ID NO13所示。

作為(wei)優(you)選方案，所述(shu)Infusion體系的用量為(wei)10μL，且Infusion體系中(zhong)，pK18mobsacB質粒3μL、infusion酶(mei)2μL、水2μL、phzS基因1μL、phzH上游同源(yuan)臂1μL和phzH下(xia)游同源(yuan)臂1μL。

作為優選方案(an)，所述雙親雜交包括如(ru)下操作：

將測序(xu)(xu)驗(yan)證正確的質(zhi)粒轉化(hua)大腸(chang)桿(gan)菌S17感受態(tai)細(xi)胞并測序(xu)(xu)驗(yan)證；

將(jiang)綠針假單胞菌株HT66活化后，接種(zhong)于(yu)液體KB培養(yang)基(ji)(ji)中(zhong)(zhong)(zhong)，在28℃下培養(yang)12h；將(jiang)攜帶(dai)質粒(li)的(de)大腸桿菌S17接種(zhong)于(yu)含50mg/L的(de)Kan的(de)LB培養(yang)基(ji)(ji)中(zhong)(zhong)(zhong)，置37℃下180rpm的(de)搖(yao)床(chuang)中(zhong)(zhong)(zhong)培養(yang)12h；

分(fen)別(bie)將綠(lv)針假單胞菌HT66和大腸桿菌S17菌液離心，以(yi)LB培養基(ji)分(fen)別(bie)重(zhong)懸(xuan)菌體，將二(er)者以(yi)1:1的比(bi)例(li)混合，并置(zhi)于(yu)28℃培養箱中1h，使(shi)其發生(sheng)接合轉(zhuan)移(yi)。

作為優選方(fang)案，所(suo)述基因替換突(tu)變(bian)株(zhu)的篩選聯合采(cai)用單交換陽(yang)性克隆的篩選和雙交換陽(yang)性克隆篩選。

作為優選方(fang)案(an)，所述單交換陽性克隆篩選包括如下操作：

將大腸(chang)桿菌S17與假單(dan)胞菌HT66的混合菌液離心，棄去一半上清液，重新懸浮后涂(tu)布(bu)于(yu)含Amp(100mg/L)和Kan(50mg/L)的LB平板上，置于(yu)28℃培養箱中培養48h。

作為優選(xuan)方案，所述(shu)雙交換(huan)陽性(xing)克隆篩選(xuan)包(bao)括如下操作：

挑取單交換(huan)的(de)菌(jun)體重(zhong)懸并(bing)稀釋，涂(tu)布于含有15％(w/v)蔗糖的(de)LB平板(ban)上，置于28℃培養箱中培養24h；

將生(sheng)長(chang)的(de)菌落分(fen)別接種于(yu)LB平板(ban)和含(han)50mg/L的(de)Kan的(de)LB平板(ban)中，接種位置一(yi)一(yi)對(dui)應，置于(yu)28℃培(pei)養箱(xiang)中培(pei)養24h；

選擇在(zai)Kan平板上不能長而在(zai)LB平板生(sheng)長的(de)菌落，即重組成(cheng)功的(de)菌株使用外部引物F1和R3進行PCR驗證(zheng)。

第三方面，本發明提供了(le)一種利用(yong)前述的基(ji)因工(gong)程菌(jun)株在制備1-羥(qian)基(ji)吩嗪中(zhong)的用(yong)途。

作為優選方案，所述基因工程菌株在(zai)制備1-羥(qian)基吩嗪時的條件為：好氧(yang)培養；溫度：26～30攝氏度；pH：6～8；轉速150～250rpm。

與(yu)現有(you)技術(shu)相比，本發明具有(you)如下的有(you)益效果：

本(ben)發明從水稻(dao)根(gen)際(ji)篩選到一株(zhu)高產吩嗪-1-甲酰胺的(de)綠(lv)針假單胞(bao)菌(jun)HT66(Pseudomonas chlororaphis HT66)CCTCCNO:M2013467，該菌(jun)屬于(yu)植(zhi)物(wu)根(gen)際(ji)細(xi)菌(jun)，屬于(yu)第(di)四類微生(sheng)物(wu)，安(an)全可(ke)靠，營(ying)養需(xu)求簡(jian)單，副產物(wu)，發酵(jiao)周期短(duan)，具(ju)有良好的(de)工(gong)業化(hua)應用潛力。本(ben)發明將其(qi)中的(de)phzH基因替換為(wei)(wei)外源的(de)phzS基因，可(ke)以農副產品為(wei)(wei)原(yuan)料(liao)合成高濃度的(de)吩嗪-1-羧酸，該化(hua)合物(wu)在PhsS蛋白的(de)作(zuo)用下可(ke)轉化(hua)為(wei)(wei)高水平(ping)的(de)1-羥(qian)基吩嗪。

附圖說明

通過閱讀參照以下(xia)附(fu)圖對非限制性實施例(li)所作的詳細描述，本(ben)發明的其(qi)它特征、目(mu)的和優點將會(hui)變得(de)更明顯：

圖1為假單(dan)胞菌中(zhong)常見的吩嗪(qin)合成(cheng)途徑；

圖2為phzS基因與(yu)phzH上(shang)下游(you)同源臂的擴增(zeng)產(chan)物(wu)電(dian)泳圖：a、phzS基因擴增(zeng)后的電(dian)泳圖；b、phzH基因下游(you)、上(shang)游(you)同源臂的電(dian)泳圖(分別為L1和L2)；c、基因phzS與(yu)phzH上(shang)下游(you)片段融合產(chan)物(wu)電(dian)泳圖；

圖3為在HT66-S菌株的(de)PCR驗證電泳圖(外部(bu)引(yin)物F1和R3)；

圖(tu)(tu)4為菌(jun)株HT66和(he)HT66-S發(fa)酵(jiao)產(chan)物(wu)的HPLC圖(tu)(tu)譜，圖(tu)(tu)4a為HT66菌(jun)株發(fa)酵(jiao)產(chan)物(wu)的HPLC圖(tu)(tu)譜，圖(tu)(tu)4b為HT66-S菌(jun)株發(fa)酵(jiao)產(chan)物(wu)的HPLC圖(tu)(tu)譜；

圖5為菌株HT66-S的生長曲(qu)線圖；

圖6為菌株HT66-S合成1-OH-PHZ的(de)產量(liang)與時間關(guan)系曲線。

具體實施方式

下(xia)面結合具體實(shi)施(shi)例對本(ben)發(fa)明(ming)(ming)(ming)進行詳細說(shuo)明(ming)(ming)(ming)。以下(xia)實(shi)施(shi)例將有助于(yu)(yu)本(ben)領(ling)域(yu)的(de)技術人員進一步理解本(ben)發(fa)明(ming)(ming)(ming)，但不以任何形(xing)(xing)式限制(zhi)本(ben)發(fa)明(ming)(ming)(ming)。應當指(zhi)出的(de)是(shi)，對本(ben)領(ling)域(yu)的(de)普(pu)通技術人員來(lai)說(shuo)，在不脫離本(ben)發(fa)明(ming)(ming)(ming)構思的(de)前提下(xia)，還(huan)可(ke)以做出若(ruo)干變形(xing)(xing)和(he)改進。這(zhe)些都屬于(yu)(yu)本(ben)發(fa)明(ming)(ming)(ming)的(de)保護范圍。

本發明的綠針(zhen)假(jia)單胞菌(jun)(Pseudomonas choloraphis)HT66，該菌(jun)株已在中(zhong)國典型(xing)培養物保(bao)(bao)藏(zang)(zang)中(zhong)心(簡稱CCTCC)保(bao)(bao)藏(zang)(zang)，保(bao)(bao)藏(zang)(zang)單位地(di)址為：中(zhong)國.武(wu)漢(han)(han).武(wu)漢(han)(han)大學，郵編為：430072，保(bao)(bao)藏(zang)(zang)日期為：2013年10月12日，保(bao)(bao)藏(zang)(zang)編號為：CCTCC NO∶M 2013467。

實施例1

本實施例涉及一(yi)種用(yong)于生產(chan)1-羥基(ji)吩嗪的(de)基(ji)因工程菌株(zhu)的(de)制備方法，包括如下步(bu)驟(zou)：

一、重組質粒的構建

1、設(she)計引物F2和R2，以銅(tong)綠假(jia)單胞菌PAO1基因組為模板，PCR擴增其phzS基因，電泳圖見(jian)圖2a。

2、分別(bie)設(she)計用于擴增phzH的上游(you)同源(yuan)(yuan)(yuan)臂(bei)引物F1和(he)R1、下游(you)同源(yuan)(yuan)(yuan)臂(bei)引物F3和(he)R3，通過PCR擴增同源(yuan)(yuan)(yuan)臂(bei)并(bing)進行回收和(he)純化(hua)，電泳圖(tu)見圖(tu)2b；

3、通(tong)過Infusion體系連接質粒(li)pK18mobsacB，將phzS基因與(yu)phzH基因的上游(you)片(pian)段(duan)和下游(you)片(pian)段(duan)整合在一起，該融(rong)合片(pian)段(duan)為2.8kb，電泳圖(tu)見圖(tu)2c；

4、重組質粒(li)轉化大腸桿菌(jun)DH5α的(de)感受態(tai)細胞，然(ran)后提(ti)取質粒(li)進行測序驗證；

其中，引物(wu)F1、R1、F2、R2、F3和R3的基(ji)因序列分別(bie)如SEQ ID NO8、SEQ ID NO9、SEQ ID NO10、SEQ ID NO11、SEQ ID NO12、SEQ ID NO13所(suo)示。

具體地(di)：F1為：5'ACATGATTACGAATT AGCCGCTGTTGGGTAAAGG3'(SEQ ID NO8)；

R1為：5'GTTTATCTCGGTACCTCAGGGTTGCAAACGCC3(SEQ ID NO9)；

F2為：5'CGACACCGCTGCGCCGGCGT3'(SEQ ID NO10)；

R2為(wei)：5'CTAGCGTGGCCGTTCCACCTGGTTG3'(SEQ ID NO11)；

F3為:5'CTCAACGCCAAATAGTACGAGCCTGAGGGAGCCACGGCAG3'(SEQ ID NO12)；

R3為:5'CGACTCTAGAGGATCATGGCCGAACCACCCTTGC3'(SEQ ID NO13)。

二、雙親雜交

1、將驗證正確的質(zhi)粒轉化大(da)腸桿菌S17感受(shou)態細胞，進一步(bu)測(ce)序驗證；

2、將(jiang)待替換(huan)基因的(de)(de)假單胞(bao)菌株HT66活化后，接種(zhong)到液體KB培養(yang)(yang)基中，置(zhi)28℃下(xia)180rpm的(de)(de)搖(yao)床(chuang)中培養(yang)(yang)12h；將(jiang)攜帶(dai)質粒的(de)(de)大腸桿菌S17也(ye)接種(zhong)于含50mg/L的(de)(de)Kan的(de)(de)LB培養(yang)(yang)基中，置(zhi)37℃下(xia)180rpm的(de)(de)搖(yao)床(chuang)中培養(yang)(yang)12h；

3、將假單胞菌(jun)HT66和(he)大(da)腸(chang)桿菌(jun)S17菌(jun)液(ye)均離心(xin)，棄去培養基；

4、以LB培養基分別重懸菌體(ti)，將(jiang)菌株HT66與S17菌體(ti)以1:1的(de)比例混合(he)菌液(ye)，并置于28℃培養箱(xiang)中1h，使其(qi)發生接合(he)轉移。

三、單(dan)交換陽性克(ke)隆篩選

1、將(jiang)菌株HT66與假單(dan)胞菌的(de)(de)混合菌液(ye)(ye)離心，棄去(qu)部分上清(qing)液(ye)(ye)，重新懸浮后涂布于(yu)含濃度分別為100mg/L的(de)(de)Amp和50mg/L的(de)(de)Kan的(de)(de)LB平板上，置于(yu)28℃培養箱中培養48h；

2、生長(chang)的菌(jun)落即為(wei)導入了重組質(zhi)粒并發(fa)生單交換的假單胞菌(jun)，使用PCR擴增融合片段進行(xing)驗(yan)證(zheng)。

四、雙交(jiao)換(huan)陽性克隆篩(shai)選(xuan)

1、取菌體(ti)重懸并適當稀(xi)釋(shi)，涂布(bu)于含有15％(w/v)蔗糖的LB平板上(shang)，置于28℃培養箱中培養24h；

2、用滅菌牙簽(qian)挑取菌落分別(bie)接種于LB平(ping)板和(he)含50mg/L的Kan的LB平(ping)板中(zhong)，位置(zhi)一一對應，置(zhi)于28℃培養箱中(zhong)培養24h；

3、在(zai)Kan平(ping)板上不能長(chang)出菌落的(de)(de)即為(wei)發生雙交換脫去質粒的(de)(de)菌株(zhu)，使用外部引物F1和R3進(jin)行(xing)PCR驗(yan)(yan)證(zheng)，驗(yan)(yan)證(zheng)電泳(yong)圖(tu)見圖(tu)3，該片段為(wei)2.8kb，與(yu)融合質粒構建的(de)(de)phzS和phzH上下游同源臂的(de)(de)大小(xiao)一致(zhi)。結果表(biao)明替換成功，該菌株(zhu)命(ming)名為(wei)HT66-S菌株(zhu)。

實施例2

本實施(shi)例涉(she)及一種利用實施(shi)例1制備的1-羥基吩(fen)嗪(qin)的液相色譜(pu)分析(xi)方法(fa)，包括(kuo)如下(xia)步驟：

從發酵液中(zhong)取(qu)出(chu)1mL菌液，12000rpm離心(xin)90s，取(qu)400μL上(shang)清液置于(yu)另一干凈的1.5mL離心(xin)管中(zhong)；向離心(xin)管中(zhong)加入(ru)800μL乙酸(suan)乙酯，充(chong)分震(zhen)蕩；將(jiang)萃取(qu)混合液于(yu)5000rpm離心(xin)5min，取(qu)400μL上(shang)層有機相(xiang)，置于(yu)另一干凈的1.5mL離心(xin)管中(zhong)；將(jiang)萃取(qu)后(hou)的乙酸(suan)乙酯相(xiang)減壓蒸餾，完全蒸干后(hou)，加入(ru)200μL甲醇，充(chong)分溶解(jie)后(hou)進行(xing)HPLC檢測(ce)(若產量較大，需進行(xing)進一步稀釋后(hou)進樣)。HPLC檢測(ce)條件(jian)：檢測(ce)波長254nm，C18反(fan)相(xiang)柱(zhu)，流(liu)速1mL/min，柱(zhu)溫30℃。流(liu)動相(xiang)：水相(xiang)為5mM乙酸(suan)銨溶液，有機相(xiang)為甲醇。

表1 流(liu)動(dong)相檢測(ce)梯度

菌株HT66和HT66-S發酵液(ye)的(de)(de)(de)HPLC檢測結(jie)果如圖4A和4B所示(shi)，根據相關化(hua)合物(wu)的(de)(de)(de)標準品的(de)(de)(de)HPLC圖，吩嗪(qin)-1-羧酸(suan)(PCA)的(de)(de)(de)出峰(feng)時(shi)(shi)間(jian)為2.8min，PCN的(de)(de)(de)出峰(feng)時(shi)(shi)間(jian)為11.7min，1-羥(qian)基(ji)(ji)吩嗪(qin)的(de)(de)(de)出峰(feng)時(shi)(shi)間(jian)為14.4min，將phzH基(ji)(ji)因(yin)替換為phzS基(ji)(ji)因(yin)后，菌株HT66-S的(de)(de)(de)發酵液(ye)中化(hua)合物(wu)PCN消(xiao)失，而1-羥(qian)基(ji)(ji)吩嗪(qin)化(hua)合物(wu)出現。

實施例3

本(ben)實施(shi)例涉及一種利用實施(shi)例1得到的基(ji)因(yin)工程菌株制備1-羥基(ji)吩嗪(qin)的方(fang)法，包(bao)括如(ru)下步驟(zou)：

將充分(fen)(fen)活化的(de)菌(jun)株HT66WT和HT66-S分(fen)(fen)別接種(zhong)到(dao)(dao)含5mL KB培養(yang)(yang)基的(de)小瓶中(zhong)于28℃，180rpm進行震蕩培養(yang)(yang)。12h后以1％的(de)接種(zhong)比(bi)接種(zhong)到(dao)(dao)裝有100mL KB培養(yang)(yang)基的(de)250mL三角(jiao)瓶中(zhong)，在相同條件下(xia)繼續(xu)培養(yang)(yang)48h。定時(shi)從(cong)發酵液(ye)中(zhong)取出1mL菌(jun)液(ye)，12000rpm離(li)心90s，用(yong)移液(ye)槍吸凈上清。使(shi)用(yong)1mL去離(li)子(zi)水(shui)(shui)重懸菌(jun)體，以去離(li)子(zi)水(shui)(shui)作為(wei)空白，在分(fen)(fen)光光度計波長(chang)600nm處測(ce)(ce)試其光密度值(zhi)，即OD600。測(ce)(ce)量時(shi)需要將菌(jun)液(ye)進行適當的(de)稀釋(shi)，使(shi)得最終測(ce)(ce)量OD600讀(du)數處于0.4～0.8之間(jian)。將測(ce)(ce)量的(de)數據(ju)繪制(zhi)生長(chang)曲線，以表(biao)征(zheng)菌(jun)體生長(chang)情況(kuang)，見圖5。結果表(biao)明，將基因phzH替換為(wei)phzS后，菌(jun)株生長(chang)無明顯變化，菌(jun)株的(de)穩定性好。

同(tong)時取(qu)樣1mL，以(yi)乙(yi)(yi)酸(suan)乙(yi)(yi)酯萃(cui)取(qu)發酵液，將有機相濃縮至(zhi)干后以(yi)甲醇重新溶解，用HPLC檢測1-羥基(ji)(ji)吩(fen)(fen)嗪(qin)的產(chan)(chan)量(liang)，見圖6。結(jie)果表明(ming)，將基(ji)(ji)因phzH替換為phzS后，能夠合成(cheng)1-羥基(ji)(ji)吩(fen)(fen)嗪(qin)，且發酵48h的產(chan)(chan)量(liang)為33.4mg/L，是目前(qian)報道的最高(gao)1-羥基(ji)(ji)吩(fen)(fen)嗪(qin)產(chan)(chan)量(liang)。

實施例4

對常(chang)見植物病(bing)原真(zhen)菌的(de)抑菌活性

稱取適量1-OH-PHZ溶于二甲基(ji)(ji)亞砜，配制成1000mg/L的(de)(de)(de)(de)藥(yao)劑(ji)溶液(ye)。按一(yi)定比(bi)例加(jia)入到融化好(hao)的(de)(de)(de)(de)PDA培(pei)(pei)養(yang)(yang)基(ji)(ji)中，混(hun)合后倒入滅菌(jun)的(de)(de)(de)(de)培(pei)(pei)養(yang)(yang)皿中，分(fen)別制成含(han)(han)(han)藥(yao)劑(ji)濃度為(wei)0，20，40mg/L的(de)(de)(de)(de)含(han)(han)(han)藥(yao)培(pei)(pei)養(yang)(yang)基(ji)(ji)平板(ban)。供試(shi)的(de)(de)(de)(de)菌(jun)株(zhu)，用直(zhi)(zhi)(zhi)徑(jing)(jing)為(wei)5mm的(de)(de)(de)(de)打孔(kong)器(qi)在菌(jun)落(luo)邊緣(yuan)打取菌(jun)餅，然后將(jiang)菌(jun)餅移到上述(shu)含(han)(han)(han)藥(yao)的(de)(de)(de)(de)培(pei)(pei)養(yang)(yang)基(ji)(ji)平板(ban)中央(yang)。以(yi)不(bu)加(jia)藥(yao)的(de)(de)(de)(de)平板(ban)培(pei)(pei)養(yang)(yang)基(ji)(ji)為(wei)對照。每平板(ban)接(jie)種(zhong)1塊，每種(zhong)藥(yao)劑(ji)為(wei)1個處理(li)(li)，每處理(li)(li)重復(fu)3次。28℃全黑暗培(pei)(pei)養(yang)(yang)5天，每天用“十”字交(jiao)叉法測定各處理(li)(li)的(de)(de)(de)(de)菌(jun)落(luo)增長直(zhi)(zhi)(zhi)徑(jing)(jing)。其中的(de)(de)(de)(de)菌(jun)落(luo)生長直(zhi)(zhi)(zhi)徑(jing)(jing)指(zhi)的(de)(de)(de)(de)是菌(jun)落(luo)實際直(zhi)(zhi)(zhi)徑(jing)(jing)減(jian)去打孔(kong)器(qi)的(de)(de)(de)(de)直(zhi)(zhi)(zhi)徑(jing)(jing)。

測量了(le)五天的菌(jun)(jun)絲(si)生長(chang)直(zhi)(zhi)徑后，明顯觀(guan)察到不同濃度的1-OH-PHZ對(dui)不同植物病(bing)原(yuan)真(zhen)菌(jun)(jun)的抑(yi)制(zhi)效果(guo)(guo)有明顯的差異，且(qie)濃度越高，抑(yi)制(zhi)效果(guo)(guo)越好(hao)。為了(le)方(fang)便鑒定，下面只列出第五天測定的植物病(bing)原(yuan)真(zhen)菌(jun)(jun)菌(jun)(jun)絲(si)生長(chang)直(zhi)(zhi)徑數據(ju)，見表(biao)2。從其中可(ke)以(yi)(yi)清晰的看(kan)出當1-OH-PHZ的藥劑濃度為40mg/L時，除(chu)西(xi)瓜枯萎(wei)病(bing)原(yuan)真(zhen)菌(jun)(jun)外(wai)其他幾種(zhong)真(zhen)菌(jun)(jun)均被(bei)完(wan)全抑(yi)制(zhi)住。通過與(yu)空白對(dui)照比較可(ke)以(yi)(yi)發現，1-OH-PHZ對(dui)四種(zhong)植物病(bing)原(yuan)真(zhen)菌(jun)(jun)的抑(yi)制(zhi)效果(guo)(guo)由(you)強到弱依次為：油菜菌(jun)(jun)核病(bing)原(yuan)真(zhen)菌(jun)(jun)>水稻稻瘟病(bing)原(yuan)真(zhen)菌(jun)(jun)>小麥赤(chi)霉(mei)病(bing)原(yuan)真(zhen)菌(jun)(jun)>西(xi)瓜枯萎(wei)病(bing)原(yuan)真(zhen)菌(jun)(jun)。

表2 四種植(zhi)物病(bing)原真(zhen)菌菌落生長(chang)直(zhi)徑(單位(wei)：mm)

以上(shang)對本發(fa)明(ming)的具體實施例進行了描述。需要理解的是，本發(fa)明(ming)并不(bu)局限于上(shang)述特定實施方式，本領域(yu)技(ji)術人員可以在權利(li)要求的范圍內做出(chu)各種(zhong)變形或修(xiu)改，這(zhe)并不(bu)影響本發(fa)明(ming)的實質內容。