專利名稱：一種重組類人膠原蛋白及生物合成方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，特別涉及一種有高熱穩定性的重組類人膠原蛋 白及其生物合成方法。
背景技術：
膠原蛋白在哺乳動物機體中含量十分豐富，它是細胞外基質中的一種纖維 狀蛋白，對動物和人體皮膚、血管、筋腱和軟骨的形成都十分重要，并為這些 結締組織提供一定的結構和機械力學性質。另一方面，膠原蛋白具有良好的細 胞粘附性能，與細胞結合對細胞的生長，分化及遷移有一定的積極作用。此外， 對血小板凝聚等也具有一定的作用。鑒于膠原蛋白固有的生物相容性、生物降 解性和吸收性以及促進細胞形成等諸多功能，在生物醫用材料、組織工程、化 妝品和食品等領域具有廣泛的應用價值。在分子結構上，膠原蛋白是由平行線 型鏈組成，每一線型鏈由三條扭曲左旋的聚肽鏈通過鏈間氫鍵緊密結合而形成一極強的右旋三重螺旋結構。而膠原肽鏈的一級結構多為Gly-Xaa-Yaa的三聯 體，它富含甘氨酸和脯氨酸殘基；另外，還含有較多的不由DNA堿基密碼子編 碼的羥脯氨酸，它是在蛋白質一級結構序列形成之后由特定的酶一一脯氨酸 -4-羥化酶(P4H)作用于序列中的脯氨酸形成的，羥脯氨酸羥基通過分子間氫 鍵對穩定膠原螺旋結構、提高熱穩定性起著重要的作用。對于膠原蛋白而言， 真正可發揮其生物功能的必須是由三條纏繞的直鏈組成，成為螺旋構造，若三 條螺旋直鏈立體結構遭到加工或受高熱而破壞，則成為一般俗稱的明膠。因此， 膠原蛋白的熱穩定性對其發揮生物功能具有相當重要的作用。目前確認的膠原蛋白已有20多種，其中以I型膠原蛋白的含量最多，約 占全部膠原蛋白的90%以上。膠原蛋白多半從牛筋和牛皮等動物組織中萃取， 但隨著禽流感、瘋牛病及其人類變種一一 "克雅氏癥"(Creutzfeldt-jakob disease)等的出現，人們開始擔心動物來源的膠原蛋白及其衍生物可能會受 到病毒污染，并且伴隨潛在的免疫排異反應。為了降低膠原蛋白的免疫排異反 應，科學家設想從人胎盤中獲取膠原蛋白，但是該研究受到世界人權組織及FDA 的阻止。然而，現代生物技術的發展為利用DNA重組技術生產類人膠原蛋白提 供了可能， 一方面可以提高蛋白的純度、降低從動物體內萃取時受到病毒感染 的風險，同時，通過嚴密的分子設計可選擇性地保留膠原蛋白的優點，提高其 活性和力學性能。這就要求在了解膠原蛋白的結構特征，以及結構和性能之間 的關系的基礎上，設計與合成新的膠原蛋白來取代天然膠原蛋白不足。隨著現 代生物技術的發展，國內外陸續有公司或研究單位開始開發重組類膠原蛋白的 生產技術。例如，美國FibroGen公司已成功表達包括I型膠原在內的9種不 同類型的重組膠原蛋白；Cohesion Technologies, Inc.也利用轉基因的方法， 培育出含類人膠原蛋白的小白鼠；美國膠原公司將特定的乳腺表達系統微量注 射到受精卵母細胞后，移植到哺乳動物母體，使其懷胎足月，得到含有重組類 人膠原奶汁的哺乳動物。但通過哺乳類或昆蟲細胞株生產的成本極高、生產周 期長，而且昆蟲細胞和部分哺乳動物中沒有足夠水平的P4H。研究人員也嘗試 利用微生物(如大腸桿菌￡ co/i)來生產類人膠原蛋白，因為該方法的生產成 本相對較低。但在大多數的大腸桿菌和酵母中其自身根本不能合成P4H，因而 不能形成Hyp殘基。所以，用這些方法得到的重組膠原蛋白嚴格地說只是明膠， 因為其內部并沒有形成天然膠原所特有的三重螺旋結構，其理化性質和生物活 性也因而受到很大的影響。發明內容本發明的目的是提供一種在羥脯氨酸缺失的情況下，利用基因重組技術和 生物工程的手段，在膠原區序列引入一段源于T4噬菌體次要纖維蛋白 (Fibritin)的非膠原區序列，然后利用大腸桿菌進行蛋白質的表達，從而獲 得一種具有較高熱穩定性的重組類人膠原蛋白及其生物合成方法。本發明的一種具有較高熱穩定性的重組類人膠原蛋白由膠原區和非膠原 區組成；非膠原區位于膠原區的羧基端。膠原區的氨基酸序列主體為Gly—Pro—Arg， Gly—Asp—Asn， Gly — Pro —Ala， Gly—Ser—Val， Gly—Asp—Thr， Gly—Phe—Arg， Gly—Asp —Ser，Gly—Pro—Thr， Gly—Asp—Thr， Gly—Pro—Glu， Gly-Pro—His, Gly—Glu 一Ala三聯體。非膠原區的氨基酸序列源于T4噬菌體次要纖維蛋白(Fibritin)，該區的 氨基酸序列包含SEQ ID NO:l所示的序列。所述的膠原區由SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列組成。 所述的非膠原區由SEQ ID N0:3所示的氨基酸序列組成。所述的具有較高熱穩定性的重組類人膠原蛋白具有如下所示的氨基酸序 列[Gly—Pro—Arg—Gly—Asp—Asn—Gly—Pro—Ala—Gly—Ser—Val—Gly —Pro—Thr—Gly—Asp—Thr—Gly—Pro—Glu—Gly—Phe—Arg—Gly—Asp — Ser — Gly — Pro —His —Gly —Glu — Ala — Gly —Ala —Ser]n-Gly —Tyr —Ile — Pro — Glu—Ala — Pro—Arg — Asp — Gly — Gin — Ala — Tyr一 Val — Arg — Lys — Asp—Gly—Glu—Trp—Val—Leu—Leu—Ser—Thr—Phe—Leu—Ala—Ser。重組類人膠原蛋白的氯基酸序列中的n=l 16。作為本發明的一種改進n=8。本發明還提供了一種合成重組類人膠原蛋白的方法，包括以下步驟(1) 分別設計與膠原區和非膠原區氨基酸序列相對應的DNA序列，DNA序列 的兩端分別為&e I和順e I限制性內切酶位點；(2) 利用化學合成的方法分別得到膠原區和非膠原區的核苷酸序列，經退 火處理分別成為與膠原區和非膠原區氨基酸序列相對應的雙螺旋目的DNA單 體；(3) 膠原區的目的DNA單體通過在質粒中的&e I和順e I限制性內切酶 位點的重復聚合連接而成為重復膠原區的高分子DNA;(4) 非膠原區的目的DNA單體通過在質粒中的I和Tlfte I限制性內切 酶位點連接到重復膠原區的高分子DNA上；(5) 將含有重復膠原區DNA和非膠原區DNA的高分子DNA克隆到表達載體， 并轉入到表達用大腸桿菌宿主細胞，通過誘導劑誘導蛋白質表達；(6) 利用金屬螯合親和層析對表達所得蛋白進行純化，得到具有良好熱穩 定型的重組類人膠原蛋白。所述的重組類人膠原蛋白的合成方法，步驟(2)所述的膠原區和非膠原 區核苷酸序列為膠原區(Col) -l:5， -ACTAGTGGCCCGCGTGGTGATAACGGTCCGGCAGGCAGCGTTGGTCCAACCGGCGATAC TGGTCCAGAAGGTTTCCGGGGCGACAGCGGTCCGCATGGTGAAGCAGGCGCTAGC-3， 膠原區(Col) -2:5 ， -GCTAGCGCCTGCTTCACCATGCGGACCGCTGTCGCCCCGGAMCCTTCTGGACCAGTAT CACCGGTTGGACCAACGCTGCCTGCCGGACCGTTATCACCACGCGGGCCACTAGT-3， 非膠原區(Fol) -l:5， -ACTAGTGGCTATATCCCGGAAGCACCGCGTGATGGTCAGGCATATGTTCGTAAAGATGG TGAATGGGTTCTGCTGAGCACCTTCTTGGCTAGC-3' 非膠原區(Fol) -2:5' -GCTAGCCAAGMGGTGCTCAGCAGAACCCATTCACCATCTTTACGAACATATGCCTGAC CATCACGCGGTGCTTCCGGGATATAGCCACTAGT-3" 本發明的有益之處在于(1) 該重組類人膠原蛋白的分子組裝類似于天然膠原蛋白，非膠原區序列 組成類似0螺旋疏水的一種三聚體結構，它們之間通過形成三個相互作用的P 發夾來形成一個比較小e片層，該結構為膠原蛋白的組裝提供了結點，使膠原 區肽鏈容易形成三重螺旋結構，從而獲得了具有較高熱穩定性的重組類人膠原 蛋白。該膠原蛋白中雖不包含羥脯氨酸殘基，但能形成類似天然膠原蛋白的穩 定的三螺旋結構。因此，該重組類人膠原蛋白的熱穩定性較高，從而解決了國 際上重組膠原蛋白熱穩定性低，很難形成穩定三螺旋結構因而缺乏天然膠原活 性的困境，屬國內外首創。(2) 該重組類人膠原蛋白中非膠原區能夠與膠原區在基因水平的結合后， 可以很好的在蛋白水平一起表達，從而起到形成和穩定膠原蛋白分子三螺旋結 構、提高熱穩定性的作用。(3) 該重組類人膠原蛋白中膠原區三聯體序列多源于天然膠原蛋白，具 有良好的親水性，因此具有較好的生物相容性。(4) 該技術生產的重組類人膠原蛋白具有比天然膠原更高的熱變性溫度 和熱分解溫度，結構更加穩定。它可以廣泛應用在生物醫用材料、組織工程、 化妝品和食品等領域。


圖1為本發明的實施例和對照例的具有不同分子量的重組類人膠原蛋白的十二垸基硫酸鈉一聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS—PAGE)圖；圖1中M—蛋白分子量標準；1泳道一重組類人膠原蛋白Col (8) —Fol， 分子量70kDa; 2泳道一重組類人膠原蛋白Co1 (8)，分子量68 kDa; 3泳道 一重組類人膠原蛋白Col (4) —Fol，分子量41 kDa; 4泳道一重組類人膠原 蛋白Col (4)，分子量39 kDa。圖2為本發明的實施例和對照例的具有不同分子量的重組類人膠原蛋白的 和免疫印跡實驗(Western—Blotting)圖；圖2中M—蛋白分子量標準；1泳道一重組類人膠原蛋白Col (8) —Fol， 分子量70 kDa; 2泳道一重組類人膠原蛋白Col (8)，分子量68 kDa; 3泳道 一重組類人膠原蛋白Col (4) —Fol，分子量41 kDa; 4泳道一重組類人膠原 蛋白Col (4)，分子量39 kDa。圖3為本發明的實施例和對照例的具有不同分子量的重組類人膠原蛋白的 示差掃描量熱法(DSC)譜圖；圖3中Col(8)-Fo1的熱變性溫度是89。C; Col(8)的熱變性溫度是88。C; Co1(4)-Fol的熱變性溫度是82。C; Col(4)的熱變性溫度是8rC。圖4為本發明的實施例中重組類人膠原蛋白Col (8) —Fol的熱重分析 (TGA)和微熱熱重(DTG)圖；圖4中Col (8) —Fol的熱分解溫度為332. 6°C。 圖5為本發明的對照例中重組類人膠原蛋白Co1 (8)的熱重分析(TGA) 和微熱熱重(DTG)圖；圖5中Col (8)的熱分解溫度為316.4。C。圖6為本發明的實施例中重組類人膠原蛋白Col (4) —Fol的熱重分析 (TGA)和微熱熱重(DTG)圖；圖6中Col (4) —Fol的熱分解溫度為336. 5°C。圖7為本發明的對照例中重組類人膠原蛋白Co1 (4)的熱重分析(TGA) 和微熱熱重(DTG)圖；圖7中Col (4)的熱分解溫度為317.6°C。
具體實施方式
下面結合實施例來說明本發明的技術方案 實施例l:羧基端含非膠原區的重組類人膠原蛋白本實施例中的重組類人膠原蛋白由膠原區和非膠原區組成；非膠原區位于 膠原區的羧基端，膠原區為目的DNA單體經過8次重復聚合后表達而成。所設 計的序列結構特征是非膠原區形成的類似0螺旋的三聚體，這種具有0發 夾狀的三聚體形成一個P片層，該區域具有強烈的疏水作用，在膠原蛋白分 子的組裝過程中可以起到結點的作用，將三條膠原區的肽鏈扭結在一起形成三 股超螺旋結構，從而使重組類人膠原蛋白的熱穩定性得到了提高。一種設計的重組類人膠原蛋白具有SEQ ID N0:8所示的氨基酸序列。(1) 設計和合成了四個低聚核苷酸膠原區(Col) -1，膠原區(Col) -2，非膠原區(Fol) -l和非膠原區(Fol) -2，然后運用退火的方法分別得到 兩段雙螺旋DNA，其核苷酸序列分別為Col-l:5， -ACTAGTGGCCCGCGTGGTGATAACGGTCCGGCAGGCAGCGTTGGTCCAACCGGCGATAC TGGTCCAGAAGGTTTCCGGGGCGACAGCGGTCCGCATGGTGAAGCAGGCGCTAGC-3， Col-2:5， -GCTAGCGCCTGCTTCACCATGCGGACCGCTGTCGCCCCGGAAACCTTCTGGACCAGTAT CACCGGTTGGACCAACGCTGCCTGCCGGACCGTTATCACCACGCGGGCCACTAGT-3，5 ， -ACTAGTGGCTATATCCCGGAAGCACCGCGTGATGGTCAGGCATATGTTCGTAAAGATGG TGAATGGGTTCTGCTGAGCACCTTCTTGGCTAGC-3， Fol-2:5' -GCTAGCCAAGMGGTGCTCAGCAGAACCCATTCACCATCTTTACGAACATATGCCTGAC CATCACGCGGTGCTTCCGGGATATAGCCACTAGT-3'Col-l和Col-2經退火處理所得雙螺旋DNA對應于氨基酸序列SEQ ID N0:9。Fol-1和Fol-2經退火處理所得雙螺旋DNA對應于氨基酸序列SEQ ID NO:10。在兩段DNA片斷的兩端，分別設計了&e /禾卩M e /限制性內切酶位點。(2) 設計兩個低聚核苷酸(Ad即ter-1和Adapter-2)，然后運用退火的
方法得到一段雙螺旋DNA，序列為 Adapter-l-5， CTAGAATGACTAGTGGGCCCGCTAGCATGT 3， Adapter—2:5， CTAGACATGCTAGCGGGCCCACTAGTCATT 3，把設計有&e /和順e /限制性內切酶位點的Adapter DNA連接到質粒 pUC118 (購自Takara)的J/7s/位點中，制作成一個新的質粒pUC118-linker。其特殊之處在于在原先沒有限制性內切酶位點/和Me /的pUC118 中，通過重組技術導入了該位點而創建了一個新的質粒。(3) 用限制性內切酶加/和臉I對pUC118-linker進行切割，CIAP 處理后，用1.2%瓊脂糖凝膠電泳分離，切取目的片段，利用DNA凝膠回收試劑 盒(Gel Extraction Kit)(購自碧云天公司)純化后與膠原區Col基因連接， 得到重組質粒，命名為pUC118-linker-Col，后轉入大腸桿菌DH5 a (購自 Novagen)中，用氨芐青霉素進行克隆選擇。將克隆株在1. 5ml LB培養基中重 新培養。以堿裂解法提取質粒，以7-M e/雙酶切法篩選接入正確外源基 因的轉化子。以Rapid Plasmid DNA Daily Mini-pr印Kit小量制備質粒，并 經DNA測序確認其序列，得質粒pUC118-linker-Col。用&e /和順e /對pUC118-linker-Col進行切割，用1. 2%瓊脂糖凝膠電 泳分離，切取目的片段，利用DNA凝膠回收試劑盒(Gel Extraction Kit)純化 后得到單體Col基因；另一方面，用5^e/或煱e/對pUC118-linker-Col(l) 進行切割，CIAP處理后，用1.2%瓊脂糖凝膠電泳分離，切取目的片段，利用 DNA凝膠回收試劑盒(Gel Extraction Kit)純化后得到線性的 pUC118-linker-Col。將單體Col基因與線性pUCl 18-linker-Col連接，得到 重組質粒，命名為pUC118-linker-Col(2)，后轉入大腸桿菌DH5 a中，用氨芐 青霉素進行克隆選擇。將克隆株在1. 5ml LB培養基中重新培養，用堿裂解法 提取與純化帶有兩個重復(兩倍體)目的DNA的質粒pUCl 18-1 inker-Col (2)。重復該步驟，就可以得到四倍體，八倍體和十六倍體等具有不同重復數量 目的DNA的質粒。(4) 將以上多倍體，如八倍體pUC118-linker-Col (8)用&e /或M e / 進行切割，CIAP處理后，用1.2%瓊脂糖凝膠電泳分離，切取目的片段，利用DNA凝膠回收試劑盒(Gel Extraction Kit)純化后得到線性的 pUC118-linker-Col (8)， 將非膠原區單體 Fol 基因與線性 pUCl 18-1 inker-Col (8)連接得到pUCl 18-1 inker-Col (8) -Fol ，后轉入大腸桿菌 DH5 a中，用氨芐青霉素進行克隆選擇。將克隆株在1. 5ml LB培養基中重新培 養，用堿裂解法提取與純化目的DNA的質粒pUC118-linker-Col (8)-Fol。(5) 用^a/zz^/和歷'/7fl^iT對質粒pUC118-linker-Col (8) -Fol和pET30a(+) (購自Novagen)進行切割，用1. 2%瓊脂糖凝膠電泳分離，切取目的片段，利用DNA凝膠回收試劑盒(Gel Extraction Kit)純化后得到Col (8)-Fol基因和 線性pET30a(+);線性pET30a(+)經CIAP處理后與Co1(8)-Fol基因連接，并 轉入大腸桿菌DH5 ct中，用卡納霉素進行克隆選擇。將克隆株在1. 5ml LB培養 基中重新培養，帶有目的DNA的表達質粒pET30a(+)-Col(8)-Fo1用堿裂解法 提取與純化。(6) 將測序驗證的pET30a(+)-Col (8)-Fol質粒轉化感受態細胞BL21 (DE3) (購自Novagen)細菌，挑取單菌落接種于LB液體培養基，37° C振蕩培養過夜，然后以1:100接種于含10-50u g/ml卡納霉素和25-170u g/ml氯霉素的 TB液體培養基，當0De。。達到0.5-l.O左右時，加入誘導劑IPTG誘導蛋白質的 表達，IPTG的濃度為0. 1-2 mM。繼續培養2-5小時后經離心收集菌體(5000Xg， 4° C離心10分鐘)。(7) 用3-7倍于細胞濕重的冰冷的細胞裂解緩沖液(Cell Lysis Buffer) 將上述收集的菌體重懸，冰浴中進行超聲波破碎細胞，使Co1(8)-Fol蛋白釋 放。細胞破碎后液體粘度升高，若混合液的粘度過高，可適當稀釋細胞裂解液， 或加入含有MgCl2 (終濃度為5 mM)的10 Ug/ml無蛋白酶污染的DNA酶，以 降低粘稠度。20，000Xg， 4° C離心30分鐘，上清即為澄清的細胞粗提物。該 粗提物經金屬螯合親和層析、蒸餾水中透析，再經冷凍干燥收集蛋白，得到重 組類人膠原蛋白。蛋白質的表達和純化結果通過SDS-PAGE凝膠電泳和免疫印 跡實驗(圖1和圖2)進行確認。利用上述方法合成的Col (4) -Fol的SDS-PAGE凝膠電泳和免疫印跡實驗如 圖l和圖2所示。本發明的重組膠原蛋白在n二l 16之間的氨基酸序列的實施例同實施例1。 對照例羧基端不含非膠原區的重組類人膠原蛋白本實施例中的重組類人膠原蛋白僅由膠原區組成，膠原區為目的DNA單體經過4次和8次重復聚合后表達而成。羧基端不含非膠原區的重組類人膠原蛋白具有SEQ ID NO: 13所示的氨基 酸序列。(1) 設計和合成了二個低聚核苷酸膠原區(Col) -1，膠原區(Col) -2，然后運用退火的方法分別得到一段雙螺旋DNA,其核苷酸序列分別為Col-l:5， -ACTAGTGGCCCGCGTGGTGATAACGGTCCGGCAGGCAGCGTTGGTCCAACCGGCGATAC TGGTCCAGAAGGTTTCCGGGGCGACAGCGGTCCGCATGGTGAAGCAGGCGCTAGC-3， Col-2:5 ， -GCTAGCGCCTGCTTCACCATGCGGACCGCTGTCGCCCCGGMACCTTCTGGACCAGTAT CACCGGTTGGACCAACGCTGCCTGCCGGACCGTTATCACCACGCGGGCCACTAGT-3，Col-1和Col-2經退火處理所得雙螺旋DNA對應于氨基酸序列SEQ ID NO: 9。 在DNA片斷的兩端，分別設計了&e /禾BM^ /限制性內切酶位點。(2) 設計兩個低聚核苷酸(Adapter-1和Adapter-2)，然后運用退火的 方法得到一段雙螺旋DNA，序列為Adapter—1:5， CTAGAATGACTAGTGGGCCCGCTAGCATGT 3， Adapter-2:5， CTAGACATGCTAGCGGGCCCACTAGTCATT 3，把設計有&e /和順e /限制性內切酶位點的Adapter DNA連接到質粒 pUC118 (購自Takara)的i^s/位點中，制作成一個新的質粒pUCl 18-1 inker。其特殊之處在于在原先沒有限制性內切酶位點&e /和順e /的pUC118 中，通過重組技術導入了該位點而創建了一個新的質粒。(3) 用限制性內切酶加/和順e I對pUCl 18-linker進行切割，CIAP 處理后，用1.2%瓊脂糖凝膠電泳分離，切取目的片段，利用DNA凝膠回收試劑 盒(Gel Extraction Kit)(購自碧云天公司)純化后與膠原區基因Col連接， 得到重組質粒，命名為pUC118-linker-Col，后轉入大腸桿菌DH5 a (購自 Novagen)中，用氨芐青霉素進行克隆選擇。將克隆株在1. 5ml LB培養基中重 新培養。以堿裂解法提取質粒，以6^e J-tVv^/雙酶切法篩選接入正確外源基 因的轉化子。以Rapid Plasmid DNA Daily Mini-pr印Kit小量制備質粒，并 經DNA測序確認其序列，得質粒pUCl 18-1 inker-Col 。用&e /和順e /對pUC118-linker-Col進行切割，用1. 2%瓊脂糖凝膠電 泳分離，切取目的片段，利用DNA凝膠回收試劑盒(Gel Extraction Kit)純化 后得到單體Col基因；另一方面，用5^e/或M e/對pUC118-linker-Col(l) 進行切割，CIAP處理后，用1.2%瓊脂糖凝膠電泳分離，切取目的片段，利用 DNA凝膠回收試劑盒(Gel Extraction Kit)純化后得到線性的 pUC118-linker-Col。將單體Col基因與線性pUCl 18-1 inker-Col連接，得到 重組質粒，命名為pUC118-linker-Col (2)，后轉入大腸桿菌DH5 a中，用氨芐 青霉素進行克隆選擇。將克隆株在1. 5ml LB培養基中重新培養，用堿裂解法 提取與純化帶有兩個重復(兩倍體)目的DNA的質粒pUC118-linker-Col (2)。重復該步驟，就可以得到四倍體，八倍體和十六倍體等具有不同重復數量 目的DNA的質粒。(3) 將以上多倍體，如八倍體pUC118-linker-Col (8)用^s/^/和歷/ o7T7 進行切割，同時用^<3/^/和歷'/20 /7/對0￡130&(+)(購自Novagen)進行切割， 用1.2%瓊脂糖凝膠電泳分離，切取目的片段，利用DNA凝膠回收試劑盒(Gel Extraction Kit)純化后得到Col(8)基因和線性pET30a(+);線性pET30a(+) 經CIAP處理后與Col(8)基因連接，并轉入大腸桿菌DH5 ct中，用卡納霉素進 行克隆選擇。將克隆株在1.5ml LB培養基中重新培養，帶有目的DNA的表達 質粒pET30a(+) -Col (8)用堿裂解法提取與純化。(4) 將測序驗證的pET30a(+)-Co1 (8)質粒轉化感受態細胞BL21 (DE3)(購 自Novagen)細菌，挑取單菌落接種于LB液體培養基，37° C振蕩培養過夜， 然后以1:100接種于含10-50 u g/ml卡納霉素和25-170 u g/ml氯霉素的TB液 體培養基，當0De。。達到0.5-l.O左右時，加入誘導劑IPTG誘導蛋白質的表達， IPTG的濃度為0.卜2 mM。繼續培養2-5小時后經離心收集菌體(5000X g， 4° C 離心10分鐘)。(5) 用3-7倍于細胞濕重的冰冷的細胞裂解緩沖液(Cell Lysis Buffer)
將上述收集的菌體重懸，冰浴中進行超聲波破碎細胞，使Col(8)蛋白釋放。細胞破碎后液體粘度升高，若混合液的粘度過高，可適當稀釋細胞裂解液，或加入含有MgCl2 (終濃度為5 mM)的10 ug/ml無蛋白酶污染的DNA酶，以降低 粘稠度。20，000Xg， 4° C離心30分鐘，上清即為澄清的細胞粗提物。該粗提 物經金屬親和層析、蒸餾水中透析，再經冷凍干燥收集蛋白。蛋白質的表達和 純化結果通過SDS-PAGE凝膠電泳和免疫印跡實驗(圖1和圖2)進行確認。利用上述方法合成的Col(4)的SDS-PAGE凝膠電泳和免疫印跡實驗如圖1 和圖2所示。圖1和圖2中，M—蛋白分子量標準；1泳道一重組類人膠原蛋白Col (8) 一Fol，分子量70kDa; 2泳道一重組類人膠原蛋白Co1 (8)，分子量68 kDa; 3泳道一重組類人膠原蛋白Col (4) —Fol，分子量41 kDa; 4泳道一重組類 人膠原蛋白Col (4)，分子量39 kDa。實施例2:重組類人膠原蛋白的實驗研究(1) 將大量表達，純化后的重組類人蛋白裝入透析袋中，將其放入蒸餾 水中透析三天，適當時間間歇要更換蒸餾水，除去大量鹽離子。(2) 將透析后的蛋白質溶液進行適當濃縮后放入一8(TC冰箱預冷2小時 以上后，放入冷凍干燥機，凍干20-24小時，得到重組類人膠原蛋白。(3) 取1-5mg重組類人膠原蛋白進行示差掃描量熱法(DSC)(圖3)、熱 重(TGA)和微熱熱重(DTG)分析(圖4-7)。圖3為本發明的實施例和對照例的具有不同分子量的重組類人膠原蛋白的 示差掃描量熱法(DSC)譜圖，含有非膠原區Fol的重組類人蛋白與不含該區的重 組類人蛋白的穩定性有顯著差異。Col(4)和Col(8)的熱變性溫度分別是8rC 和82°C，而與Co1(4)-Fol和Co1(8)-Fol的熱變性溫度分別是88。C和89°C， 可見非膠原區Fol的引入使重組類人膠原蛋白的熱變性溫度提高了 7'C左右。圖4-7為本發明的實施例和對照例的具有不同分子量的重組類人膠原蛋白 的熱重分析(TGA)和微熱熱重(DTG)圖，Fol的存在使熱分解溫度同樣得到 了提高。Col (4)-Fol和Col (8)-Fol的熱分解溫度分別為332. 6。C和336. 5°C， 而Col (4)和Col (8)的熱分解溫度分別為317. 6°C和316. 4°C。
最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發明的具體實施例子。顯然， 本發明不限于以上實施例子，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從 本發明公開的內容直接導出或聯想到的所有變形，均應認為是本發明的保護范 圍。
序列表SEQ ID NO 1:12 AlaTyr ValArgAspGlyGluTrpValLeuLeuSEQ IDNO: 215 GlyPro ArgGlyAspAsnGlyProAlaGlySerValGlyProThr30 GlyAsp ThrGlyProGluGlyPheArgGlyAspSerGlyProHis36 GlyGlu AlaGlyAlaSerSEQ IDNO: 315 GlyTyr lieProGluAlaProArgAspGlyGinAlaTyrValArg29 LysAsp GlyGluTrpValLeuLeuSerThrPheLeuAlaSerSEQ ID NO:460 actagtggcc cgcgtggtga taacggtccg gcaggcagcg ttggtccaac cggcgatact 114 ggtccagaag gtttccgggg cgacagcggt ccgcatggtg aagcaggcgc tagcSEQ ID NO:560 gctagcgcct gcttcaccat gcggaccgct gtcgccccgg aaaccttctg gaccagtatc 114 accggttgga ccaacgctgc ctgccggacc gttatcacca cgcgggccac tagtSEQ ID NO:660 actagtggct atatcccgga agcaccgcgt gatggtcagg catatgttcg taaagatggt 93 gaatgggttc tgctgagcac cttcttggct ageSEQ ID NO:760 gctagccaag aaggtgctca gcagaaccca ttcaccatct ttacgaacat atgcctgacc 93 atcacgcggt gcttccggga tatagccact agtSEQ ID NO:815 GlyProArgGlyAspAsnGlyProAlaGlySerValGlyProThr30 GlyAspThrGlyProGluGlyPheArgGlyAspSerGlyProHis45 GlyGluAlaGlyAlaSerGlyProArgGlyAspAsnGlyProAla60 GlySerValGlyProThrGlyAspThrGlyProGluGlyPheArg75 GlyAspSerGlyProHisGlyGluAlaGlyAlaSerGlyProArg90 GlyAspAsnGlyProAlaGlySerValGlyProThrGlyAspThr105GlyProGluGlyPheArgGlyAspSerGlyProHisGlyGluAla120GlyAlaSerGlyProArgGlyAspAsnGlyProAlaGlySerVal135GlyProThrGlyAspThrGlyProGluGlyPheArgGlyAspSer150GlyProHisGlyGluAlaGlyAlaSerGlyProArgGlyAspAsn165GlyProAlaGlySerValGlyProThrGlyAspThrGlyProGlu180GlyPheArgGlyAspSerGlyProHisGlyGluAlaGlyAlaSer195GlyProArgGlyAspAsnGlyProAlaGlySerValGlyProThr210GlyAspThrGlyProGluGlyPheArgGlyAspSer ■GlyProHis225GlyGluAlaGlyAlaSerGlyProArgGlyAspAsnGlyProAla240GlySerValGlyProThrGlyAspThrGlyProGluGlyPheArg255GlyAspSerGlyProHisGlyGluAlaGlyAlaSerGlyProArg270GlyAspAsnGlyProAlaGlySerValGlyProThrGlyAspThr285GlyProGluGlyPheArgGlyAspSerGlyProHisGlyGluAla300GlyAlaSerGlyTyrlieProGluAlaProArgAspGlyGinAla315丁yrValArgLysAspGlyGluTrpValLeuLeuSerThrPheLeu317 Ala Ser SEQ ID NO:915 Gly Pro Arg Gly Asp Asn Gly Pro Ala Gly Ser Val Gly Pro Thr 30 Gly Asp Thr Gly Pro Glu Gly Phe Arg Gly Asp Ser Gly Pro His 36 Gly Glu Ala Gly Ala SerSEQ ID NO:1015 Gly Tyr lie Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gin Ala Tyr Val Arg29 Lys Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu Ala SerSEQ ID NO:1130 ctagaatgac tagtgggccc gctagcatgtSEQ ID NO:1230 ctagacatgc tagcgggccc actagtcattSEQ ID NO:1315GlyProArgGlyAspAsnGlyProAlaGlySerValGlyProThr30GlyAspThrGlyProGluGlyPheArgGlyAspSerGlyProHis45GlyGluAlaGlyAlaSerGlyProArgGlyAspAsnGlyProAla60GlySerValGlyProThrGlyAspThrGlyProGluGlyPheArg75GlyAspSerGlyProHisGlyGluAlaGlyAlaSerGlyProArg90GlyAspAsnGlyProAlaGlySerValGlyProThrGlyAspThr105GlyProGluGlyPheArgGlyAspSerGlyProHisGlyGluAla120GlyAlaSerGlyProArgGlyAspAsnGlyProAlaGlySerVal135GlyProThrGlyAspThrGlyProGluGlyPheArgGlyAspSer150GlyProHisGlyGluAlaGlyAlaSerGlyProArgGlyAspAsn165GlyProAlaGlySerValGlyProThrGlyAspThrGlyProGlu180GlyPheArgGlyAspSerGlyProHisGlyGluAlaGlyAlaSer195GlyProArgGlyAspAsnGlyProAlaGlySerValGlyProThr210GlyAspThrGlyProGluGlyPheArgGlyAspSerGlyProHis225GlyGluAlaGlyAlaSerGlyProArgGlyAspAsnGlyProAla240GlySerValGlyProThrGlyAspThrGlyProGluGlyPheArg255GlyAspSerGlyProHisGlyGluAlaGlyAlaSerGlyProArg270GlyAspAsnGlyProAlaGlySerValGlyProThrGlyAspThr285GlyProGluGlyPheArgGlyAspSerGlyProHisGlyGluAla288 Gly Ala Ser
權利要求
1、一種重組類人膠原蛋白，其特征在于該重組類人膠原蛋白由膠原區和非膠原區組成。
2、 根據權利要求l所述的重組類人膠原蛋白，其特征在于所述非膠 原區位于膠原區的羧基端。
3、 根據權利要求1或2所述的重組類人膠原蛋白，其特征在于所述 的非膠原區的氨基酸序列源于T4噬菌體次要纖維蛋白。
4、 根據權利要求1或2所述的重組類人膠原蛋白，其特征在于膠原區由SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列組成。
5、 根據權利要求1或2所述的重組類人膠原蛋白，其特征在于非膠 原區由SEQ ID N0:3所示的氨基酸序列組成。6、 根據權利要求1或2所述的重組類人膠原蛋白，其特征在于該重 組類人膠原蛋白具有如下所示的氨基酸序列[Gly —Pro—Arg—Gly—Asp —Asn — Gl y — Pro — Ala — Gl y — Ser — Val — Gl y — Pro — Thr — Gl y — Asp — Thr —Gly —Pro — Glu —Gly — Phe — Arg —Gly — Asp —Ser—Gly —Pro—His —Gly —Glu —Ala — Gly — Ala — Ser]「Gly_Tyr_Ile —Pro —Glu —Ala — Pro 一 Arg—Asp — Gly — Gln—Ala — Tyr — Val — Arg — s — Asp — Gl y — Glu 一Trp—Val—Leu — Leu—Ser—Thr—Phe —Leu—Ala—Ser。7、 根據權利要求6所述的重組類人膠原蛋白，其特征在于該序列中 n=l 16。8、 根據權利要求7所述的重組類人膠原蛋白，其特征在于該序列中n=8。9、 一種如權利要求l所述的重組類人膠原蛋白的生物合成方法，其特 征在于(1) 分別設計與膠原區和非膠原區氨基酸序列相對應的DNA序列，DNA 序列的兩端分別為&e I和M e I限制性內切酶位點；(2) 利用化學合成的方法分別得到膠原區和非膠原區的核苷酸序列，經 退火處理分別成為與膠原區和非膠原區氨基酸序列相對應的雙螺旋目的 DNA單體； (3) 膠原區的目的DNA單體通過在質粒中的&e I和Me I限制性內切 酶位點的重復聚合連接而成為重復膠原區的高分子DNA;(4) 非膠原區的目的DNA單體通過在質粒中的&e I和Me I限制性內 切酶位點連接到重復膠原區的高分子DNA上；(5) 將含有重復膠原區DNA和非膠原區DNA的高分子DNA克隆到表達載 體，并轉入到表達用大腸桿菌宿主細胞，通過誘導劑誘導蛋白質表達；(6) 利用金屬螯合親和層析對表達所得蛋白進行純化，得到具有良好熱 穩定型的重組類人膠原蛋白。10、根據權利要求7所述的重組類人膠原蛋白的生物合成方法，其特 征在于步驟(2)所述的膠原區和非膠原區核苷酸序列為-膠原區(Col) -1:5' -ACTAGTGGCCCGCGTGGTGATAACGGTCCGGCAGGCAGCGTTGGTCCAACCGGCGA TACTGGTCCAGAAGGTTTCCGGGGCGACAGCGGTCCGCATGGTGAAGCAGGCGCTAGC-3， 膠原區(Col) -2:5' -GCTAGCGCCTGCTTCACCATGCGGACCGCTGTCGCCCCGGAAACCTTCTGGACCAG TATCACCGGTTGGACCAACGCTGCCTGCCGGACCGTTATCACCACGCGGGCCACTAGT-3， 非膠原區(Fol) -l:5 ， -ACTAGTGGCTATATCCCGGAAGCACCGCGTGATGGTCAGGCATATGTTCGTAMGA TGGTGAATGGGTTCTGCTGAGCACCTTCTTGGCTAGC-3， 非膠原區(Fol) -2:5 ， -GCTAGCCAAGAAGGTGCTCAGCAGAACCCATTCACCATCTTTACGAACATATGCCT GACCATCACGCGGTGCTTCCGGGATATAGCCACTAGT-3 ，。
全文摘要
本發明公開了一種重組類人膠原蛋白及生物合成方法，重組類人膠原蛋白包括由膠原區和非膠原區組成，非膠原區位于膠原區的羧基端，非膠原區的氨基酸序列源于T4噬菌體次要纖維蛋白，膠原區由SEQIDNO2所示的氨基酸序列組成，非膠原區由SEQIDNO3所示的氨基酸序列組成。本發明的重組類人膠原蛋白具有較高熱穩定性的重組類人膠原蛋白，具有良好的親水性，因此具有較好的生物相容性，該技術生產的重組類人膠原蛋白具有比天然膠原更高的熱變性溫度和熱分解溫度，結構更加穩定，它可以廣泛應用在生物醫用材料、組織工程、化妝品和食品等領域。
文檔編號C07K19/00GK101148479SQ200710070660
公開日2008年3月26日 申請日期2007年9月11日 優先權日2007年9月11日
發明者姚菊明, 杜春玲 申請人:浙江理工大學