南極來源芽孢桿菌n311及其在防治植物致病真菌上的應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及芽孢桿菌，尤其是涉及一種芽孢桿菌N311及其在制備防治植物致病 真菌發酵上清液中的應用。
【背景技術】
[0002] 植物病害是嚴重威脅農業生產的重要因素，據聯合國糧農組織（FA0)統計，每年 因遭受植物病害而造成的減產損失平均為總產量的10%~15%。目前，由于化學農藥的大 量使用，不僅帶來了植物病原菌產生抗藥性的問題，而且對生態環境和人類健康也造成了 潛在危害。研制開發廣譜、高效、低毒的生物農藥已成為研究人員和農藥使用者的共同目標 (CalvoJ,CalventeV,etal. 2007)〇
[0003] 近年來，從陸地土壤微生物中發現結構新穎的活性物質出現了明顯下降的態勢。 海洋占地球表面的70%以上，蘊藏著豐富的生物資源。迄今海洋生物中已發現包括生物堿 類、萜類、大環聚酯類、肽類以及多糖類等多種新型活性物質。研究表明，許多海洋生物活性 物質具有抗腫瘤、抗病毒、抗真菌、抗艾滋病、抗疲勞及增強免疫等功效（繆輝南，方旭東， 焦炳華.1999)。由于南極獨特的地理及氣候特征，形成了一個干燥、酷寒、強輻射的自然環 境，蘊育了豐富多樣、功能特殊的微生物資源，主要包括生活在海水、海洋沉積物及與海洋 動植物共附生的微生物（曾胤新，陳波，1999)。這些新穎獨特的南極海洋微生物是發現新 型生物活性產物的理想來源（朱建鋼，顏其德，凌曉良.2005)。
[0004] 芽胞桿菌（Bacillusspp.)由于能產生耐熱抗逆的芽胞，是土壤和植物微生物生 態的優勢種群。芽胞桿菌能通過同化作用產生抗菌物質，抑制有害病原微生物的生長或者 直接殺滅病原微生物（嚴婉榮，趙廷昌，等.2013)。許多天然分離的芽胞桿菌菌株已成 功地應用于植物病害生物防治，如日本東京研究所研發的商品菌B.subtilisRB14和美國 Taensa公司研發的商品菌B.amyloliquefaciensFZB42,主要用于防治農作物的枯萎病和 根腐病。我國南京農業大學開發了B.subtilisG1和B.subtilsB3,前者主要用于防治辣 椒病毒病和煙草病毒病，后者則用于防治小麥紋枯病（鄧建良，劉紅彥，等.2010)。

【發明內容】

[0005] 本發明的目的之一在于提供一株芽孢桿菌（Bacillussp. )N311。
[0006] 本發明的目的之二在于提供一種芽孢桿菌（Bacillussp. )N311在制備防治植物 致病真菌發酵上清液中的應用。
[0007] 所述芽孢桿菌（Bacillussp. )N311分離自中國第31次南極科學考察所采集的海 水樣品（59° 00'22. 95〃W，62° 13'03. 316〃S);該菌已于2015年10月15日保藏于中國典 型培養物保藏中心，中國典型培養物保藏中心的地址為中國，武漢，武漢大學，郵編430072， 保藏中心保藏編號為CCTCCNO:M2015607。
[0008] 所述芽孢桿菌（Bacillussp. )N311通過聚合酶鏈式反應（PCR)擴增其16SrDNA 序列，與美國國家生物技術信息中心（NCBI)GenBank數據庫中相應的序列進行比對分析， 發現其與芽孢桿菌屬（Bacillussp.)具有99%的序列相似性；16SrDNA序列的GenBank 登錄號為KT962248。
[0009] 所述芽孢桿菌（Bacillussp. )N311的16SrDNA部分序列如下：

[0012] 所述芽孢桿菌（Bacillussp.)N311可在制備防治植物致病真菌發酵上清液中應 用。
[0013] 所述防治植物致病真菌發酵上清液的制備方法如下：首先將芽孢桿菌（Bacillus sp. )N311在含有5mLLB培養基的試管中進行活化培養，然后將活化的菌株接種到500mL LB培養基中進行發酵培養，發酵培養結束后離心除去菌體，得到防治植物致病真菌發酵上 清液。
[0014] 所述LB培養基的組成為：氯化鈉10g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，121°C 高滅壓菌20min。
[0015] 所述離心除去菌體是在10, 000r/min下離心15~20min。
[0016] 所述活化培養的時間為12~24h。
[0017]所述發酵培養的溫度為28~30°C，發酵培養的時間為48~60h，發酵培養的搖床 轉速為180~220r/min。
[0018] 所述植物致病真菌包括但不限于鐮刀菌、香蕉炭疽菌、宛氏擬青霉、核盤菌、長柄 鏈格孢、綠色木霉、立枯絲核菌、互生鏈格孢、灰霉菌和膠孢炭疽菌。
[0019] 所述防治植物致病真菌發酵上清液的使用方法如下：將防治植物致病真菌發酵上 清液直接或稀釋后噴灑在植物上。
[0020] 與現有技術相比，本發明具有以下優點：
[0021] 發酵上清液的制備工藝簡單，抑真菌譜廣，生防效果好。在油菜菌核病（核盤菌） 的盆栽防治試驗中顯示出較好的生物防治效果，防效達到50%以上。
【附圖說明】
[0022] 圖1為芽孢桿菌（Bacillussp. )N311的菌落形態。
[0023] 圖2為芽孢桿菌（Bacillussp. )N311的發酵上清液對不同植物致病真菌的抑菌 效果圖。在圖2中：A:灰霉菌；B:宛氏擬青霉；C:核盤菌；D:綠色木霉；E:立枯絲核菌；F: 長柄鏈格孢；G:膠孢炭疽菌；Η:互生鏈格孢；I:鐮刀菌；J:香蕉炭疽菌。
【具體實施方式】
[0024] 下面結合實施例對本發明作進一步描述。
[0025] 實施例1:芽孢桿菌（Bacillussp.)N311的分離篩選
[0026] 本發明涉及芽孢桿菌（Bacillussp.)N311來源于本申請人從中國第31次南極科 學考察所采集的海水樣品中篩選獲得。該菌在LB培養基上生長，28°C培養24h后，菌體呈 淡黃色，菌落表面粗糙、干燥，邊緣不規則，見圖1。
[0027] 實施例2 :芽孢桿菌（Bacillussp.)N311菌種鑒定
[0028]利用 16SrDNA通用引物 27F和 1492R(27F:AGAGTTTGATCCTGGCTCAT;1492R: ACGGCTACCTTGTTACGACTT)對南極來源菌株N31116SrDNA序列進行擴增。以N311總 DNA為PCR擴增模板，在PCR擴增儀上進行PCR反應。反應條件為：94 °C變性lmin; 55°C退火lmin;72°C延伸1.5min，30個循環。擴增序列經測序公司測序后，獲得該菌 株16SrDNA序列。將該序列通過與美國國家生物技術信息中心GenBank中核酸數據進 行比對分析（ //ncbi.nlm.nih.gov/blast)。結果顯示，N311 的 16SrDNA序列與 Bacillusmethylotrophicus(HQ662596. 1)、Bacillusamyloliquefaciens(JF460737. 1)、 及Bacillusamyloliquefaciens(JQ062537. 1)等菌株的序列相似性為99%，即芽孢桿菌 (Bacillussp.)N311與芽孢桿菌同源，因此，將其命名為芽孢桿菌（Bacillussp.)N311。
[0029] 實施例3:植物致病真菌抗菌譜的測定
[0030] 采用紙片法測定芽孢桿菌（Bacillussp.)N311對10種植物致病真菌的抑制活 性。用無菌打孔器將受試致病真菌制成菌塊，用牙簽挑取一菌塊接種于馬鈴薯固體培養基 平板中央，28°C的條件下培養。待受試致病真菌菌絲體擴散生長后，將滅菌的雙層濾紙片 (直徑6mm)放置于菌塊四周，濾紙片距離菌絲邊緣約lcm。在每個濾紙片上加50μL的無 菌發酵上清液，繼續培養24h，通過與對照組比較，觀測菌絲體