專利名稱：重組蛋白a基因及其表達產物的制備與應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物工程技術領域。具體涉及一種重組蛋白A基因、含有重組蛋白A基因的載體以及該載體轉化的菌株和重組蛋白A基因表達產物的制備與應用。
背景技術：
葡萄球菌蛋白A(Staphylococal Protein A，SPA)是一種從金黃色葡萄球菌細胞壁分離的蛋白質。早在1940年，Vevwey發現在某些金黃色葡萄球菌中，含有一種物質，在雙向擴散試驗中能與正常人血清形成沉淀。Jensen(1959)也發現類似現象，并將其命名為A抗原。直到1963年Lofkvist等分離了A抗原，并證明它是一種蛋白質，且與糖有區別，Grov(1960)將其命名為葡萄球菌蛋白A，簡稱SPA或蛋白A(Protein A)。由于SPA的一些免疫特性，它已引起廣大免疫學者的興趣，并發展成為免疫學上一種有用的工具。
編碼SPA的基因于1983年被克隆并在E.coli中表達(Duggleby，C.J and Jones，SAcloning and expression of the Staphylococcus aureus protein A gene in Escherichiacoli.Nucl Acids Res.11(1983)3065-3076；Lofdahl，S.，Guss，B.，et al；Gene forStaphylococcal protein A.Proc.Natl.Acid.Sci.USA 80(1983)697-701)。對SPA結構和功能的研究發現，SPA分子包含A、B、C、D、E五個同源結構域，每個結構域都有能與IgG自主結合的能力。SPA基因有1600bp，SPA基因序列及其編碼的氨基酸序列見序列表SEQ IDNo.3和SEQ ID No.4。
由于葡萄球菌蛋白A具有與大多數哺乳動物IgG的Fc段結合的能力，因此被廣泛應用于單克隆抗體或多克隆抗體的分離純化和檢測，但使用葡萄球菌蛋白A進行分離純化的抗體的純度有待提高。SPA的主要來源是從金黃色葡萄球菌蛋白中提取而來，SPA占菌體總蛋白的1.7％。由于金黃色葡萄球菌是一種致病菌，同時，其菌體蛋白的分離純化存在一定困難，因此，通過基因工程方法獲得重組蛋白A成為一種重要的備選方法，為大規模生產蛋白A提供了新的、安全的途徑。

發明內容
本發明提供了1.重組蛋白A基因；2.構建含有該基因的載體，特別是表達載體；3.提供由該基因轉化的微生物菌株；4.提供由這些轉化菌株高效表達、生產重組蛋白A的方法；5.表達產物的應用。
發明的重組蛋白A基因是以3個人工合成的重組蛋白A基因單體串連而成，各重組蛋白A基因單體間以Acc I酶切位點相連，其中第一個重組蛋白A基因單體前端加入GAATTCATATGGTG，包括起始密碼子ATG和與表達載體pBV220(Zhang ZQ，Yao LH，HouYD.Construction and application of a high level expression vector containing P RP L promoter.BingduXuebao，1990；6111-116)相連的EcoR I酶切位點，最后一個重組蛋白A基因單體末端加入GTAGACTAAGGATCC，其中包括中止密碼子TAA和與表達載體pBV220相連的BamH I酶切位點。該基因的基本特征如下a.序列特征類型核酸鏈數雙鏈b.分子類型DNAc.來源人工合成的重組蛋白A基因單體串連而成d.該基因的結構由3個重組蛋白A基因單體串連而成。該基因由551個核苷酸構成，編碼178個氨基酸。該基因序列及其編碼的氨基酸序列見序列表SEQ ID No.1、SEQID No.2。
本發明還構建了含有上述重組蛋白A基因的載體，這些載體的構建方法是按照常規方法，將通過人工合成的重組蛋白A基因單體酶切后接入相應載體的相應酶切位點之間，再以Acc I內切酶酶切，連接成包含多個串連重組蛋白A基因單體的重組蛋白A基因表達載體。
上述含重組蛋白A基因的大腸桿菌表達載體優先由本發明合成的重組蛋白A基因與大腸桿菌表達載體pBV220構建成的重組表達載體，命名為pBVA20，其構建過程如圖1所示。
本發明還提供了利用上述含大腸桿菌重組表達載體的大腸桿菌重組株生產重組蛋白A的方法，該方法是將菌種進行培養發酵并經熱誘導使其高效表達重組蛋白A，再收集菌體，經分離純化得到重組蛋白A產品。
本發明上述能表達重組蛋白A的大腸桿菌菌株優先為由含有重組蛋白A基因的表達載體pBVA20轉化大腸桿菌DH5α得到的菌株，命名為Escherichia coli DH5α/pBVA20，簡稱DH5α/pBVA20。
利用大腸桿菌重組菌株DH5α/pBVA20生產重組蛋白A的具體方法為1.種子液的制備將菌種接種于三角瓶，接種量1-2％V/V，于30℃培養過夜；當O.D600達到3-3.5時即可接種發酵；上述所用種子培養基為LB培養基加100-200mg/l氨芐青霉素；2.發酵在無菌條件下將上述培養好的種子培養基按1∶20-1∶5接種于發酵培養基上，30℃發酵至O.D600達到0.4-0.8時，升溫至42C誘導，誘導3～5小時后4℃8000轉/分離心10分鐘收菌；3.重組蛋白A的分離純化1)粗提將上述收集菌體用NaCl+磷酸鹽緩沖液(7.0-8.0)懸浮，超聲破碎，4℃8000轉/分離心10分鐘，收集上清，得粗提液。
經SDS-PAGE電泳檢測表明，用本法提取表達于大腸桿菌胞周質的重組蛋白A效果很好，粗提后大部分重組蛋白A被粗提，殘存于菌體的量極微；2)純化將粗提液進行Sephacryl S200分子篩(法瑪西亞公司生產)純化，以PBS(Ph 7.4)為緩沖液將粗提液上Sephacryl S200分子篩，收集特征峰(第二洗脫峰)即為純化的重組蛋白A，其純度可達90％以上。
本發明生產的重組蛋白A表達于大腸桿菌胞周質中，有利于表達產物的分離純化。利用本發明表達生產重組蛋白A，具有表達量效率高，表達量大(占細菌可溶性蛋白總量的60-80％)，表達時間短(僅3-5小時)，易于純化等優點，并且經實驗證明，本發明所表達的重組蛋白A與野生型蛋白A結合活性相近，而與抗體間的結合力稍弱。
本發明采用溫控型大腸桿菌表達系統生產重組蛋白A，還具有生產周期短(1天)，消耗低，能有效地降低成本，有利于基因工程重組蛋白A的產業化應用。
將本發明的重組蛋白A基因的表達產物重組蛋白A用于與各種不同的層析介質載體如瓊脂糖凝膠、葡聚糖、纖維素、帶羥基的高分子聚合物、硅膠等偶聯成為親和層析介質用于抗體的分離純化。
本發明生產的重組蛋白A與野生型的金黃色葡萄球菌蛋白A相比，其與抗體結合的親和力稍弱，使抗體結合后的洗脫條件更溫和，有利于保持抗體的活性，使抗體分離純化效果良好，抗體純度可一步大于95％。
上述親和層析介質可以由以下步驟制備1.用環氧氯丙烷、氫氧化鈉與相應介質在水介質中進行反應，在30-60℃的溫度下反應2-4小時，反應完后清洗至中性后抽干；2.再與本發明的重組蛋白A在4-25℃溫度下反應16-20小時反應完后清洗再抽干；清洗后得到上述親和層析介質。
以上步驟所得親和層析介質穩定性好，基團脫落少，使用壽命長，使用方便，可從腹水或培養液中直接分離純化抗體。上述親和層析介質也可以用溴化氰活化方法以及其他方法制備。


圖1是重組表達載體pBVA20構建的示意圖，其中，PR、PL為噬菌體啟動子，T1、T2為的轉錄終止序列。
圖2是重組蛋白A表達產物的SDS-PAGE電泳圖。其中，M是標準分子量對照，泳道1是42℃誘導含pBV220空載體的DH5α/pBV220菌體，泳道2是42℃誘導表達的DH5α/pBVA20菌體，泳道3是42℃誘導表達的DH5α/pBVA20菌體培養上清。
圖3是重組蛋白A表達產物分步純化的SDS-PAGE電泳圖。其中，M是標準分子量對照，泳道1是誘導表達的DH5α(pBVA20)菌體，泳道2、泳道3是菌體粗提后初步純化的重組蛋白A，泳道4是菌體粗提后經分子篩Sephacryl S200純化后的重組蛋白A。
圖4是重組蛋白A瓊脂糖凝膠6B FF分離腹水中的IgG2a的分離純化色譜圖；圖5是重組蛋白A瓊脂糖凝膠6B FF分離腹水中的IgG2a的SDS-PAGE電泳結果圖，其中泳道1mark；泳道2腹水；泳道3IgG2a；圖6是重組蛋白A葡聚糖凝膠分離腹水中的IgG2a的分離純化色譜圖；圖7是重組蛋白A葡聚糖凝膠分離腹水中的IgG2a的SDS-PAGE電泳結果圖，其中泳道1mark；泳道2腹水；泳道3IgG2a；圖8是重組蛋白A纖維素凝膠分離腹水中的IgG2a的分離純化色譜圖；圖9是重組蛋白A纖維素凝膠分離腹水中的IgG2a的SDS-PAGE電泳結果圖，其中泳道1mark；泳道2腹水；泳道3IgG2a；圖10是重組蛋白A聚乙烯醇凝膠分離腹水中的IgG2a的分離純化色譜圖；圖11是重組蛋白A聚乙烯醇凝膠分離腹水中的IgG2a的SDS-PAGE電泳結果圖，其中泳道1mark；泳道2腹水；泳道3IgG2a具體實施方式
以下通過實施例結合附圖對本發明作進一步詳細說明，這并不限制本發明的范圍。
實施例1 重組蛋白A基因單體的合成通過化學合成的方法，設計合成重組蛋白A基因單體的兩條鏈，退火獲得重組蛋白A基因單體序列。其序列包括長度為174bp，兩端是Acc I酶切位點，用于多個重組蛋白A基因單體構建的重復序列區。另外，還包括起始密碼子ATG，第二密碼子GTG，終止密碼子TAA，及克隆用EcoR I及BamH I限制性內切酶接頭共29bp。上述過程見說明書附1。
實施例2 含一個重組蛋白A基因單體的pBV220載體的構建用限制型內切酶EcoR I和BamH I將上述重組蛋白A基因單體切下，與經EcoR I及BamHI酶切的載體pBV220連接，轉化大腸桿菌，篩選具有氨芐青霉素抗性的轉化子，經質粒提取，酶切鑒定后證明重組蛋白A基因單體已克隆至pBV220中。上述過程見說明書附圖之圖1。
實施例3 含有重組蛋白A基因的pBVA20載體的構建將上述含一個重組蛋白A基因單體的pBV220載體及重組蛋白A基因單體以AccI酶切，回收相應片段后連接，轉化大腸桿菌，篩選具有氨芐青霉素抗性的轉化子，經質粒提取，酶切篩選獲得含有重組蛋白A基因的pBVA20載體。上述過程見說明書附圖之圖1。
實施例4 能高效表達重組蛋白A的大腸桿菌菌株DH5α/pBVA20的構建用CaCl2法將pBVA20轉化E.coli DH5α，在含有氨芐青霉素的LB平板上篩選轉化子，經質粒檢測和酶切分析獲得含有pBVA20的重組轉化子DH5α/pBVA20。上述過程見說明書附圖之圖1。
實施例5 利用大腸桿菌工程菌E.coli DH5α/pBVA20生產重組蛋白A1)菌種的培養發酵挑取大腸桿菌工程菌E.coli DH5α/pBVA20，接種于LB培養基中，接種量1-2％V/V，于30℃培養過夜；次日在無菌條件下將上述培養好的種子培養基按1∶20-1∶5接種于發酵培養基上，30℃發酵至O.D600達到0.4-0.8時，升溫至42℃誘導，誘導3～5小時后離心收菌；取少量細胞加2×上樣緩沖液，煮沸5分鐘后按標準做SDS-PAGE凝膠電泳，結果如說明書附2，經誘導的E.coli DH5α/pBVA20菌體及上清在20kD的位置出現一條新的蛋白帶(見圖2泳道1及泳道3)，DH5α/pBV220(DH5α/pBV220為轉化了pBV220空載體的DH5α菌，見圖2泳道1)不出現此帶，證明重組蛋白A已在E.coli DH5α/pBVA20中誘導表達。
2)表達的重組蛋白A的純化將上述收集菌體用NaCl+磷酸鹽緩沖液(pH7.0-8.0)懸浮，超聲破碎，4℃離心，收集上清，得粗提液。經SDS-PAGE電泳檢測表明，用本法提取表達于大腸桿菌胞周質的重組蛋白A效果很好，粗提后大部分重組蛋白A被粗提，殘存于菌體的量極微；將粗提液進行Sephacryl S200分子篩純化，收集特征峰(第二洗脫峰)即為純化的重組蛋白A，其純度可達90％以上。
實施例6 重組蛋白A用于抗體檢測，Elisa檢測表達的重組蛋白A與抗體結合的實驗1)包被96孔板，每孔包被重組蛋白A樣品100μl，37℃，1小時。
2)封閉每孔以100μl 1％的BSA封閉，37℃，1小時。
3)加一抗每孔加入約100μg人抗體，37℃，1小時。
4)加二抗每孔加入約100μl 11000辣根標記抗體，37℃，1小時。
5)顯色。
經Elisa檢測表明本發明提取的重組蛋白A與人抗體有強結合活性，與野生型蛋白A結合活性相近，每孔包被5ng重組蛋白A即可獲得明顯檢測信號。結果顯示重組蛋白A可用于抗體的檢測。
實施例7 重組蛋白A瓊脂糖凝膠6B FF的制備1.用環氧氯丙烷、氫氧化鈉與瓊脂糖(6％的交聯瓊脂糖凝膠)在水介質中進行反應，在30-60℃的溫度下反應2-4小時，反應完后用蒸餾水清洗至中性后抽干；2.再與本發明的重組蛋白A在4-25℃溫度下反應16-20小時反應完后清洗再抽干；重組蛋白A瓊脂糖凝膠6B FF具有以下特性1.特點基團脫落少，結合特異性強2.基質6％的交聯瓊脂糖凝膠3.配基重組蛋白A4.配基密度≈6mg重組蛋白A/ml5.吸附載量2-5mg鼠IgG2a/ml6.親和介質的顆粒大小50-160μm7.最大流速200cm/h8.pH范圍3-10，在位清洗時pH范圍可到2-119.使用溫度常溫10.保存溫度+4～8℃11.保存液體20％乙醇如果待分離純化的抗體與親和層析介質間的吸附力比較弱，則可適當提高吸附緩沖液的pH值和鹽濃度，即可獲得較好的分離效果。
實施例8 重組蛋白A瓊脂糖凝膠6B FF從小鼠腹水中分離純化IgG2a1、重組蛋白A瓊脂糖凝膠6B FF裝柱，1.6×20cm，柱床體積為10ml；2、用緩沖液A平衡5-10個床體積，流速為1ml/min；3、將2ml小鼠腹水用緩沖液A稀釋到20ml，0.45μm濾膜過濾，上樣。流速為1ml/min；4、用緩沖液A再洗5-10個床體積，流速為1ml/min；5、用緩沖液B洗脫，流速為1ml/min，收集洗脫峰6、用純水流洗10個柱床體積，再用20％的乙醇流洗10個柱床體積，流速為2ml/min，柱子置于+4~8℃環境中保存7、將分離純化的IgG2a與對照品同時進行SDS-PAGE電泳分析。
備注柱子每使用幾次后應該用以緩沖液C流洗1次，以便將吸附更牢的蛋白去除。
緩沖液組成緩沖液A20mM磷酸鹽緩沖液，pH7.4，即pH7.4的PBS溶液。配制0.2M NaH2PO419ml，0.2M Na2HPO4 81ml，NaCl9g加水至1000ml。
緩沖液B20mM檸檬酸緩沖液，pH4.0。配制檸檬酸2.1g加水950ml，用5M NaOH調至pH 4.0，加水至1000ml。
緩沖液C0.5M醋酸緩沖液，pH3.0。配制0.5M醋酸溶液用固體NaOH調至pH 3.0。
緩沖液D1M Tris-HCl緩沖液，pH9.0。配制Tris鹽121.14g，加水至950ml，濃鹽酸調pH至9.0，加水至1000ml。
結果分離純化色譜圖見圖4；SDS-PAGE電泳分析結果見圖5，泳道1為標準蛋白Marker，泳道2為腹水，泳道3為本發明的重組蛋白A瓊脂糖凝膠6B FF親和介質所裝的柱子的洗脫峰。泳道3中，上、下兩條帶分別是IgG2a的重鏈和輕鏈。試驗結果表明了本發明的重組蛋白A瓊脂糖凝膠6B FF親和層析介質一步就可以得到純度大于95％的IgG2a。
實施例9 重組蛋白A葡聚糖凝膠的制備1.用環氧氯丙烷、氫氧化鈉與葡聚糖在水介質中進行反應，在30-55℃的溫度下反應2-4小時，反應完后用蒸餾水清洗至中性后抽干；2.再與本發明的重組蛋白A在4-25℃溫度下反應16-20小時反應完后清洗再抽干；3 蒸餾水清洗后得到重組蛋白A葡聚糖凝膠，它具有與重組蛋白A瓊脂糖凝膠6B FF相同的特性。
實施例10 重組蛋白A葡聚糖凝膠從小鼠腹水中分離純化IgG2a與實施例8中重組蛋白A瓊脂糖凝膠6B FF相同的步驟、應用相同的緩沖液，用重組蛋白A葡聚糖凝膠從小鼠腹水中分離純化IgG2a；結果分離純化色譜圖見圖6；SDS-PAGE電泳分析結果見圖7，泳道1為標準蛋白Marker，泳道2為腹水，泳道3為本發明的重組蛋白A葡聚糖凝膠親和介質所裝的柱子的洗脫峰。泳道3中，上、下兩條帶分別是IgG2a的重鏈和輕鏈。試驗結果表明了本發明的重組蛋白A葡聚糖凝膠親和層析介質一步就可以得到純度大于95％的IgG2a。
實施例11 重組蛋白A與纖維素偶聯的親和層析介質重組蛋白A纖維素凝膠的制備1.用環氧氯丙烷、氫氧化鈉與纖維素在水介質中進行反應，在30-60℃的溫度下反應2-4小時，反應完后用蒸餾水清洗至中性后抽干；2.再與本發明的重組蛋白A在4-25℃溫度下反應16-20小時反應完后清洗再抽干；3.蒸餾水清洗后得到重組蛋白A纖維素凝膠，它具有與重組蛋白A瓊脂糖凝膠6B FF相同的特性。
實施例12 重組蛋白A與纖維素偶聯的親和層析介質重組蛋白A纖維素凝膠從小鼠腹水中分離純化IgG2a與實施例8中重組蛋白A瓊脂糖凝膠6B FF相同的步驟、相同的實驗條件、應用相同的緩沖液，用重組蛋白A纖維素凝膠從小鼠腹水中分離純化IgG2a；結果分離純化色譜圖見圖8；SDS-PAGE電泳分析結果見圖9，泳道1為標準蛋白Marker，泳道2為腹水，泳道3為本發明的重組蛋白A纖維素凝膠親和介質所裝的柱子的洗脫峰。泳道3中，上、下兩條帶分別是IgG2a的重鏈和輕鏈。試驗結果表明了本發明的重組蛋白A纖維素凝膠親和層析介質一步就可以得到純度大于95％的IgG2a。
實施例13 重組蛋白A與帶羥基的高分子聚合物等載體偶聯的親和層析介質的制備1.用環氧氯丙烷、氫氧化鈉與帶羥基的高分子聚合物聚乙烯醇在水介質中進行反應，在30-60℃的溫度下反應2-4小時，反應完后用蒸餾水清洗至中性后抽干；2.再與本發明的重組蛋白A在4-25℃溫度下反應16-20小時反應完后清洗再抽干；3.蒸餾水清洗后得到重組蛋白A聚乙烯醇凝膠，它具有與重組蛋白A瓊脂糖凝膠6B FF相同的特性。
實施例14 重組蛋白A與帶羥基的高分子聚合物偶聯的親和層析介從小鼠腹水中分離純化IgG2a與實施例8中重組蛋白A瓊脂糖凝膠6B FF相同的步驟、相同的實驗條件、應用相同的緩沖液，用重組蛋白A聚乙烯醇凝膠從小鼠腹水中分離純化IgG2a；結果分離純化色譜圖見圖10；SDS-PAGE電泳分析結果見圖11，泳道1為標準蛋白Marker，泳道2為腹水，泳道3為本發明的重組蛋白A纖維素凝膠親和介質所裝的柱子的洗脫峰。泳道3中，上、下兩條帶分別是IgG2a的重鏈和輕鏈。試驗結果表明了本發明的重組蛋白A纖維素凝膠親和層析介質一步就可以得到純度大于95％的IgG2a。對說明書中的名詞的解釋1.葡萄球菌蛋白A簡稱SPA或蛋白A(ProteinA)。
2.pBVA20為含有本發明專利所述的目的蛋白A的pBV220。
3.pBV220一種溫控型大腸桿菌表達載體。
4.E.coliDH5α大腸桿菌菌株DH5α。
5.DH5α/pBV220為轉化了pBV220的Escherichia coli DH5α菌；DH5α為Escherichia coli DH5α的簡稱。
6.BSA牛血清白蛋白。
7.重組蛋白A基因單體即構成重組蛋白A基因的基因基本單位，有相對獨立的結構。
序列表(1)一般信息發明名稱重組蛋白A基因及其表達產物的制備與應用序列數目4(2)SEQ ID No1的信息(I)序列特征(A)類型核酸(B)長度551個堿基(C)鏈數雙鏈(II)分子類型DNA(III)序列描述GAATTCATAT GGTGGTAGAC AACAAATTCA ACAAAGAACA ACAAAACGCG TTCTATGAGATCTTACATTT ACCTAACTTA AACGAAGAAC AACGAAACGC CTTCATCCAA AGTTTAAAAGATGACCCAAG CCAAAGCGCT AACCTTTTAG CAGAAGCTAA AAAGCTAAAT GATGCTCAGGCGCCGAAAGT AGACAACAAA TTCAACAAAG AACAACAAAA CGCGTTCTAT GAGATCTTACATTTACCTAA CTTAAACGAA GAACAACGAA ACGCCTTCAT CCAAAGTTTA AAAGATGACCCAAGCCAAAG CGCTAACCTT TTAGCAGAAG CTAAAAAGCT AAATGATGCT CAGGCGCCGAAAGTAGACAA CAAATTCAAC AAAGAACAAC AAAACGCGTT CTATGAGATC TTACATTTACCTAACTTAAA CGAAGAACAA CGAAACGCCT TCATCCAAAG TTTAAAAGAT GACCCAAGCCAAAGCGCTAA CCTTTTAGCA GAAGCTAAAA AGCTAAATGA TGCTCAGGCG CCGAAAGTAGACTAAGGATC C
(3)SEQ ID No2的信息(I)序列特征(A)類型氨基酸(B)長度178個氨基酸(II)分子類型蛋白質(III)序列描述Met Val Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr GluIle Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile GlnSer Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala LysLys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys GluGln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu GluGln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser AlaAsn Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys ValAsp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu HisLeu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu LysAsp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu AsnAsp Ala Gln Ala Pro Lys Val Asp(4)SEQ ID No3的信息(I)序列特征(A)類型核酸(B)長度1600個堿基(C)鏈數雙鏈(II)分子類型DNA
(III)序列描述tgattttgcg gttttaagcc ttttacttcc tgaataaatc tttcagcaaa atatttattttataagttgt aaaacttaca tttaaattta attataaata tagattttag tattgcaatacataattcgt tatattatga tgactttaca aatacataca gggggtatta atttgaaaaagaaaaacatt tattcaattc gtaaactagg tgtaggtatt gcatctgtaa ctttaggtacattacttata tctggtggcg taacacctgc tgcaaatgct gcgcaacacg atgaagctcaacaaaatgct ttttatcaag tgttaaatat gcctaactta aacgctgatc aacgtaatggttttatccaa agccttaaag atgatccaag ccaaagtgct aacgttttag gtgaagctcaaaaacttaat gactctcaag ctccaaaagc tgatgcgcaa caaaataact tcaacaaagatcaacaaagc gccttctatg aaatcttgaa catgcctaac ttaaacgaag cgcaacgtaacggcttcatt caaagtctta aagacgaccc aagccaaagc actaatgttt taggtgaagctaaaaaatta aacgaatctc aagcaccgaa agctgataac aatttcaaca aagaacaacaaaatgctttc tatgaaatct tgaatatgcc taacttaaac gaagaacaac gcaatggtttcatccaaagc ttaaaagatg acccaagcca aagtgctaac ctattgtcag aagctaaaaagttaaatgaa tctcaagcac cgaaagcgga taacaaattc aacaaagaac aacaaaatgctttctatgaa atcttacatt tacctaactt aaacgaagaa caacgtaacg gcttcatccaaagccttaaa gacgatcctt cagtgagcaa agaaatttta gcagaagcta aaaagctaaacgatgctcaa gcaccaaaag aggaagacaa caaaaaacct ggtaaagaag acggcaacaaacctggcaaa gaagacggca acaagcctgg taaagaagac aacaaaaaac ctggtaaagaagacggcaac aagcctggta aagaagacaa caacaaacct ggcaaagaag acggcaacaagcctggtaaa gaagacaaca acaagcctgg taaagaagac ggcaacaagc ctggtaaagaagacggcaac aaacctggta aagaagacgg caacggagta catgtcgtta aacctggtgatacagtaaat gacattgcaa aagcaaacgg cactactgct gacaaaattg ctgcagataacaaattagct gataaaaaca tgatcaaacc tggtcaagaa cttgttgttg ataagaagca
accagcaaac catgcagatg ctaacaaagc tcaagcatta ccagaaactg gtgaagaaaatccattcatc ggtacaactg tatttggtgg attatcatta gccttaggtg cagcgttattagctggacgt cgtcgcgaac tataaaaaca aacaatacac aacgatagat atcattttatccaaaccaat tttaacttat atacgttgat taacacattc(5)SEQ ID No4的信息(I)序列特征(A)類型氨基酸(B)長度450個氨基酸(II)分子類型蛋白質(III)序列描述MKKKNIYSIRKLGVGIASVTLGTLLISGGVTPAANAAQHDEAQQNAFYQVLNMPNLNADQRNGFIQSLKDDPSQSANVLGEAQKLNDSQAPKADAQQNNFNKDQQSAFYEILNMPNLNEAQRNGFIQSLKDDPSQSTNVLGEAKKLNESQAPKADNNFNKEQQNAFYEILNMPNLNEEQRNGFIQSLKDDPSQSANLLSEAKKLNESQAPKADNKFNKEQQNAFYEILHLPNLNEEQRNGFIQSLKDDPSVSKEILAEAKKLNDAQAPKEEDNKKPGKEDGNKPGKEDGNKPGKEDNKKPGKEDGNKPGKEDNNKPGKEDGNKPGKEDNNKPGKEDGNKPGKEDGNKPGKEDGNGVHVVKPGDTVNDIAKANGTTADKIAADNKLADKNMIKPGQELVVDKKQPANHADANKAQALPETGEENPFIGTTVFGGLSLALGAALLAGRRREL
權利要求
1.一種重組蛋白A基因，它具有序列表中SEQ ID No.1所述的堿基序列。
2.一種重組蛋白A，由序列表中SEQ ID No.2所述的氨基酸序列組成。
3.一種重組載體，它含有權利要求1所述的重組蛋白A基因。
4.含有權利要求1所述的重組蛋白A基因的重組載體pBVA20。
5.含有權利要求3所述的重組載體的轉化微生物，其中該重組載體含有權利要求1所述的重組蛋白A基因。
6.一種制備重組蛋白A基因的表達產物的方法，其特征是，制備所述的重組蛋白A基因的表達產物的過程是先構建含有重組蛋白A基因的表達載體；再將含有重組蛋白A基因的表達載體轉入大腸桿菌DH5α中形成大腸桿菌重組株；經菌株培養，誘導使其高效表達重組蛋白A，再經分離純化得到重組蛋白A。
7.一種親和層析介質，其特征為，它由重組蛋白A和層析介質載體組成。
8.根據權利要求1所述的重組蛋白A基因，其特征是，所述的重組蛋白A基因編碼的重組蛋白A用于抗體檢測、分離、純化。
9.根據權利要求2所述的重組蛋白A，其與抗體結合的親和力稍弱，使抗體結合后的洗脫條件更溫和，有利于保持抗體的活性，從而達到良好的抗體分離純化效果。
10.根據權利要求7所述的親和層析介質，其特征為，所述的層析介質載體可以是瓊脂糖凝膠或葡聚糖或纖維素或硅膠或帶羥基的高分子聚合物。
全文摘要
本發明屬于生物工程技術領域。本發明是將設計的化學合成重組蛋白A(rPA)結構單元基因集團串連重復插入熱誘導型大腸桿菌載體，構建了含有該基因的大腸桿菌表達載體pBVA20及其轉化的大腸桿菌DH5α(pBVA20)重組株和利用此菌株生產重組蛋白A的方法。此菌株所產生的可溶性重組蛋白A濃集于細菌胞間質中，達到細菌可溶性蛋白總量的60－80％，以后只經一步分子篩柱層析即可將rPA純化到90％以上純度，該菌株具有表達量高、成本低、表達產物易純化等優點。本發明將為獲得來源穩定，價格便宜的重組蛋白A并用其制備多種抗體分離裝置提供一條切實可行的途徑。
文檔編號G01N33/577GK1524957SQ0314998
公開日2004年9月1日 申請日期2003年8月1日 優先權日2003年2月26日
發明者吳小兵, 楊宇, 韋新桂 申請人:本元正陽基因技術股份有限公司