一種蠟狀芽孢桿菌及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物菌肥技術領域，涉及一種作為天然藥用植物內生細菌的蠟狀芽孢 桿菌，及其在促進黃花蒿生長和/或提高黃花蒿中的青蒿素產量中的應用。
【背景技術】
[0002] 青蒿為菊科植物黃花蒿（AriewisiaaawaL.)的干燥地上部分，是我國傳統使用 的一味中草藥。從黃花蒿中提取的青蒿素（Artemisinin)是現今最好的抗皰藥物，具有活 性好、無明顯毒副作用等特點，是我國唯一被世界衛生組織（WHO)認可的按照西藥標準研究 開發的中藥。隨著研究及應用的深入，青蒿素及其衍生物被廣泛用于治療多種疾病。由于 市場需求量逐年增加，而青蒿素在黃花蒿中的含量較低(僅占干重的O.OP/^l%)，導致青蒿 素的供應出現短缺。
[0003]目前，提高黃花蒿中青蒿素含量的方法主要集中于外加激素法，例如中國發明專 利CN101785406B等。該類方法大多基于實驗室組培苗，對生產條件要求較高，增加了生 產成本。另外，向黃花蒿中轉入青蒿素合成過程中的關鍵基因來提高青蒿素含量的方法也 有報道，例如中國發明專利CN101182544B等。該類方法雖然增效顯著，但由于基因工程 目前尚處于嘗試階段，同時世界上許多國家對于轉基因作物的監管和控制比較嚴格，導致 轉基因作物難以在實際中得到普遍應用。
[0004] 隨著綠色農業的興起，人們越來越注重生態保護，生物菌肥也隨之得到廣泛重視。 從植物體內分離出來的內生菌（endophyte)，對植物本身并無危害。經大量研究發現，內生 菌具有促進宿主植物生長、增強宿主植物抗逆性等作用。因此，將有益內生菌與藥用植物共 培養是生產高品質中藥材的嶄新途徑，為中草藥的高產高質高效栽培提供了廣闊的空間。 然而，國內外關于生物菌肥的研究主要集中于內生真菌（endophytic fungi)，對于內生細 菌（endophytic bacteria)的研究較少，特別是針對內生細菌促進黃花蒿生長和/或提高 青蒿素產量方面的研究幾乎為空白。

【發明內容】

[0005] 針對上述情況，本發明從野生黃花蒿(采自南京紫金山地區）的根莖部分分離篩選 出野生型菌株--蠟狀芽孢桿菌cereys)SZ1 (下文簡稱SZ1菌)。SZ1菌已于 2013年3月15日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC)，保藏編 號為CGMCCNo. 7313,保藏地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研 究所。
[0006] 本發明的SZ1菌具有如下生物學特征： 菌落形態特征：SZ1菌在基礎NA培養基（NB培養基添加1. 5%瓊脂）上生長良好，在NA平板培養基上為灰白色，不透明，表面較粗糙，類似毛玻璃或融蠟狀，菌落較大； 菌體形態特征：菌體呈桿狀，末端較方，成短或長鏈，大小為（1. 〇~l. 2)X(3. 0~5. 0) μm； 生理生化特征：在〇°C以下或40°C以上條件下不能生長，在5%和7%的NaCl溶液中能 夠生長，可以利用葡萄糖、蔗糖、半乳糖、鼠李糖和甘露醇，不可以利用L-阿拉伯糖和肌醇， 氧化酶和接觸酶測定結果為陽性，能夠利用檸檬酸鹽，硝酸還原、淀粉水解、明膠液化和酯 酶試驗為陽性，脲酶試驗為陰性。
[0007] 經過序列測定，上述SZ1菌的16SrDNA核苷酸序列如SEQIDN0:1所示，與蠟狀芽 孢桿菌（萬.、蘇云金芽孢桿菌（漢、炭疽芽孢桿菌（漢a/?iAracis) 的相似度達99%。綜合序列同源性分析、Blast比對、形態特征及生理生化特征等實驗結果， 鑒定上述SZ1菌為蠟狀芽孢桿菌。
[0008] 上述SZ1菌對黃花蒿的生長具有明顯的促進作用，可以增加根長10%~30%，增加植 株鮮重和干重7°/『25%，同時可以提高黃花蒿中的青蒿素含量10%~20%，可以應用于促進黃 花蒿的生長和/或提高黃花蒿中的青蒿素產量，對人畜無毒害作用，對環境無污染。
[0009] 在實際應用過程中，可以將上述SZ1菌依下法配制成菌液后使用：取SZ1菌菌株置 于NB培養基中，在25~30°C條件下，搖床振蕩培養10~12小時，離心后去上清，加入無菌水 將SZ1菌的濃度調節為107~109cfu/mL，即得菌液，其中NB培養基的配方如下：牛肉膏3. 0 g，蛋白胨 10. 0g，氯化鈉 5. 0g，蒸餾水 1000mL，ρΗ=7· 2~7· 4。
[0010] 上述菌液的具體應用方式包括浸種（即采用各種濃度的菌液浸泡種子，其中每克 黃花蒿種子所需的菌液施用量為5~20毫升，浸泡時間為1~3小時)和灌根(即將各種溶液傾 倒在植株根部，其中當黃花蒿幼苗的植株高度為5厘米時，在其根部附近一次性灌入菌液 1~2毫升）。
[0011] 與現有技術相比，采用上述技術方案的本發明具有如下優點： 本發明的內生細菌SZ1能夠促進黃花蒿的生長，提高黃花蒿中青蒿素的產量，效果較 為顯著；應用過程中的操作極為簡便，可以實現規模化生產，并且無需高昂的前期投入，同 時減少了化學肥料的使用。具有理想的應用及開發前景。
【附圖說明】
[0012] 圖1為蠟狀芽孢桿菌SZ1的菌落形態圖。
[0013] 圖2為蠟狀芽孢桿菌SZ1的菌體形態圖。
[0014] 圖3為基于16S rRNA基因序列構建的SZ1菌株的系統發育樹。
[0015]圖4為蠟狀芽孢桿菌SZ1通過浸種方式促進黃花蒿生長的盆栽效果對比圖，其中 左側兩盆為處理組黃花蒿，右側兩盆為對照組黃花蒿。
[0016] 圖5為蠟狀芽孢桿菌SZ1通過灌根方式促進黃花蒿生長的盆栽效果對比圖，其中 左側兩盆為處理組黃花蒿，右側兩盆為對照組黃花蒿。
【具體實施方式】
[0017] 下面將結合附圖和具體的實施例來進一步描述本發明。需要說明的是，本發明中 選用的所有原輔材料、試劑和儀器都為本領域所熟知，其他本領域熟知的一些試劑和儀器 都可適用于本發明。
[0018] 實施例一：蠟狀芽孢桿菌SZ1的分離、純化和鑒定。
[0019] 1、內生細菌的分離與純化： 將野生黃花蒿植株依次用自來水、無菌水沖洗干凈后，晾干，選取合適的組織剪成5 _X5mm的組織塊，在75%乙醇中浸泡1min，用無菌水沖洗3次后，在0. 1%升汞溶液中浸 泡5min，取出后用無菌水沖洗5次。在無菌研缽內加入10mL無菌水和少許滅菌石英砂， 研磨成勻漿，靜置30min，取上層溶液并稀釋10倍后，再吸取0. 1mL至準備好的NA平板 上，涂抹均勻后，放入培養箱培養，48h后記錄觀察，并根據菌落形態、顏色和大小不同挑取 單菌落，獲得黃花蒿內生細菌。以組織消毒后用無菌水沖洗的第5次沖洗液為對照，涂皿，3 d后如有菌落生成，證明表面消毒不徹底，棄去。若對照中無菌落，則研磨液中長出的菌落為 內生菌，進行純化培養，于4°C冰箱中保存，備用。
[0020] 2、菌種鑒定： 2. 1、菌種形態、生理、生化特征： 菌株培養特征觀察：將SZ1菌株接種在NA平板培養基、NB液體培養基中，30 °C下培養 24h，觀察描述菌株的菌落形態特征。
[0021] 革蘭氏染色：用接種針挑取SZ1菌株菌落，涂布在干凈玻片上的一滴無菌水中，風 干固定后，用結晶紫混合液染1min，水洗，再用碘液作用1min，水洗，吸干。用95%乙醇脫 色至洗脫液無色，用番紅液復染2min，水洗風干后觀察。
[0022] 生長溫度：接種100μL濃度為10scfu/mL的SZ1菌株菌懸液至50mLNB培養基 中，分別置于 4°C、8°C、12°C、20°C、30°C、37°C、41 °C、45°C的搖床培養，150r/mim，48h后用 紫外分光光度計測定600nm處0D值。以不接菌的NB培養基為對照。
[0023]碳源利用試驗：在基礎培養基（（NH4)2S04 2 . 0g，MgS04 · 7H20 0· 2g，NaH2P04 0· 5 g，CaCl2 · 2H20 0·lg，K2HP04 0· 5g，蒸餾水1000mL)中加入不同被測底物（葡萄糖、鹿糖、 半乳糖、L-阿拉伯糖、鼠李糖、甘露醇、肌醇，濃度為0. 8%，過濾滅菌）作為測試培養基，將菌 懸液接種至其中，連續接3代，生長者為陽性。
[0024] 耐鹽試驗：將SZ1菌株分別接種于含5%、7%NaCl的NB培養基中，30°C下培養3d 后，觀察菌株在培養基中的生長狀況。
[0025] 檸檬酸鹽利用試驗：每支試管分裝5mL檸檬酸三鈉培養基（NaCl1g，MgS04*7H20 0.2g，NH4H2P04 (X5g，檸檬酸鈉 2g，蒸餾水 1000mL，(X04% 酚紅液 20mL，pH=7.0)。將 SZ1菌株劃線接種至斜面上，培養3d后觀察。若培養基由橙色變成桃紅色則為陽性反應， 無明顯變化則為陰性反應。
[0026] 氧化酶測定：在干凈培養皿中放一張濾紙，滴上1%鹽酸二甲基對苯撐二胺水溶 液，挑取將培養18h的菌苔涂布在濕潤的濾紙上，10~60s出現紅色為陽性反應。以不涂 布細菌的濾紙為對照。
[0027] 接觸酶測定：將培養24 h的SZ1菌株涂布在滴有3%過氧化氫的玻片上，如有氣泡 產生則為陽性，無氣泡產生為陰性。
[0028] 硝酸鹽還原試驗：將SZ1菌株接種于硝酸鹽液體培養基(酵母膏3. 0g，蛋白胨5. 0 g，KN03 1.0g，蒸餾水1000mL，pH=7. 0~7. 6)中，于30°C培養1d、3d、5d后取出培養液各 2mL，滴加格里斯氏試劑A液、B液各一滴，觀察顏色變化。以不接菌的培養基為對照。若 溶液變為粉紅色，玫瑰紅色，橙色，棕色等表示亞硝酸鹽存在，為硝酸鹽還原陽性。若無紅色 出現，則滴兩滴二苯胺試劑，此時如呈藍色反應，表示培養液中仍有硝酸鹽，但無亞硝酸鹽 反應，表示無硝酸鹽還原作用；如不呈藍色反應，表示硝酸鹽和形成的亞硝酸鹽都已被還原 成其他物質，故仍按硝酸鹽還原陽性處理。
[0029] 淀粉水解反應：將SZ1菌株接種至淀粉培養基平板（NA培養基中加0.2%可溶性淀 粉）上，置30°C下培養24h形成明顯菌落后，在平板上滴加碘液，若平板呈藍黑色，菌落周 圍有不變色透明圈，表示淀粉水解陽性；仍是藍黑色為陰性。
[0030] 明膠液化試驗：試管中分裝5mL含明膠的培養基(牛肉膏3. 0g，蛋白胨5g，明膠 100g，蒸餾水1000mL，pH=7. 2~7. 4)，滅菌后穿刺接種SZ1菌株，置30°C下培養