一株好氧反硝化細菌及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于環境微生物領域，具體涉及到一株好氧反硝化細菌菌株及其應用。
【背景技術】
[0002] 氮是動物合成蛋白和植物生長必不可少的主要成分，是生物體最重要的營養元素 之一。然而隨著城市擴展及工、農業的發展，人類過度的向水體中釋放含氮化合物，超過環 境的承載能力，不僅造成了水體富營養化和水華風險，含氧量減少，生物多樣性降低，使水 體生態系統遭到破壞等各種影響，同時還嚴重影響到人體健康。因此人們越來越重視氮素 污染的治理以及脫氮工藝的創新。
[0003] 脫氮工藝可分為物理與化學脫氮法(簡稱"物化法"）和生物脫氮法，前者往往具有 操作費用高，容易造成二次污染等缺點。相對于物化法，生物脫氮是對環境影響較小且經濟 有效的一種脫氮工藝。傳統的生物脫氮由于具有良好的脫氮效率而受到廣泛認可，但由于 其由好氧硝化和厭氧/缺氧反硝化兩部分工藝組成，也造成了操作復雜、能耗大以及運行費 用高等缺點。傳統理論認為反硝化只有在厭氧或缺氧的條件下才可以進行，而隨著好氧反 硝化現象的發現以及不斷分離得到好氧反硝化細菌的增加，促進了新型脫氮工藝的發展。 傳統的生物脫氣方法中主要是在有氧條件下由硝化細菌將NH4+-N氧化為N〇3 -N，之后再在 缺氧條件下將N0廠-N轉化為N2,而好氧反硝化細菌的發現則可將硝化和反硝化反應在同一 反應器內實現即同步硝化反硝化，大大節省了操作時間與費用。
[0004] 實現同步硝化反硝化工藝的研究主要基于好氧反硝化菌。反硝化菌為異養菌，而 淺層地下水中C0D濃度較低，需要外加碳源才能滿足反硝化作用，因而研究碳源類型、碳氮 比對反硝化菌脫氮性能的影響，可以找到更加有效經濟的碳源，從而提高反硝化效率。因 此，從自然界中分離高效好氧反硝化菌株并優化其反硝化條件，將對此工藝的發展起到很 好的促進作用。

【發明內容】

[0005] 本發明要解決的技術問題是，提供一株具有高效好氧反硝化能力的菌株，為生物 脫氮、治理高氮污染水體提供一種良好的微生物材料。
[0006] 本發明從昆明滇池底泥樣品中分離篩選出一株好氧反硝化菌株，該菌株命名為變 形假單胞菌(？8611(1〇1]1〇11&3口16(3〇81〇88；[(^(1&)￥頂0(]16，并于2015年7月14日保藏于中國微 生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC)，地址:北京市朝陽區北辰西路1號院3 號，中國科學院微生物研究所，保藏號為CGMCCNo. 11077。
[0007] 該菌株的生物學特征為:細胞呈桿狀，有鞭毛，端生;菌落在LB培養基上的形態特 征為乳白色，圓形，表面光滑;革蘭氏染色反應呈陰性，接觸酶、氧化酶、硝酸鹽還原和精氨 酸水解為陽性;硝基-D甲基半乳糖水解，D引噪反應、VP實驗、H2S產生、色氨酸脫氨酶、賴氨酸 脫酸酶、鳥氨酸脫羧反應、葡萄糖產酸發酵、脲素水解、七葉靈水解和明膠液化均為陰性。菌 株能利用葡萄糖、甘露糖、葡萄糖酸鹽、癸酸、蘋果酸、蔗糖、檸檬酸鈉和苯乙酸作為碳源;不 能利用阿拉伯糖、甘露醇、N-乙酰葡糖糖胺、麥芽糖和己二酸實驗作為碳源。
[0008] 本發明所涉及的好氧反硝化細菌是通過富集、梯度稀釋、選擇性培養基培養并結 合定性篩選中的顏色反應等方法篩選得到的。
[0009] 本發明好氧反硝化細菌的16SrRNA基因序列如序列表SEQIDN0:1所示。
[0010] 本發明菌株變形假單胞菌(P.plecoglossicida)nMDC16,可以利用多種碳源， 如葡萄糖、乙酸鈉、琥珀酸鈉、檸檬酸鈉、酒石酸鈉為唯一碳源并在kn〇3作為唯一氮源條件 下進行生長;且在溫度為15-35°(3、？11在7.5-9.0、轉速為100^111條件下具有較好的脫氮能 力。
[0011]本發明另一目的是將上述好氧反硝化細菌變形假單胞菌(P.plecoglossicida)Y頂DC16應用在高硝氮廢水的治理中。
[0012] 本發明菌株變形假單胞菌(P.plecoglossicida)YIMDC16在以N〇3--N為唯一氮 源、葡萄糖為唯一碳源并在(：/^為15、初始?!1為7.5、培養條件為20°0、100印111培養時，￥頂 0(：16可以在3611時對硝態氮(勵 3--吣的去除率可以達到90.07 %，總氮打吣的去除率也可到 達76.99 %，此時從)2-4的含量也只有0.05 11^/1。
【附圖說明】
[0013] 圖1為本發明好氧反硝化菌株ΥΠ1DC16細胞的透射電鏡圖片； 圖2為本發明好氧反硝化菌株Y頂DC16與相近菌株的16SrDNA序列采用N-J法構建的 系統進化樹； 圖3為本發明好氧反硝化菌株YIMDC16在不同碳源下的反硝化脫氮結果示意圖； 圖4為本發明好氧反硝化菌株Y頂DC16在不同溫度下的反硝化脫氮結果示意圖； 圖5為本發明好氧反硝化菌株YMDC16在不同pH下的反硝化脫氮結果示意圖； 圖6為本發明好氧反硝化菌株YIMDC16在不同轉速下的反硝化脫氮結果示意圖； 圖7為本發明好氧反硝化菌株YIMDC16在不同C/N下的反硝化脫氮結果示意圖； 圖8為本發明菌株YIMDC16在最佳反硝化條件下的脫氮效果圖； 圖9為本發明的菌株YIMDC16對模擬高硝氮廢水的脫氮效果圖。
【具體實施方式】
[0014] 下面結合附圖和實施例對本發明作進一步詳細說明，但本發明保護范圍不限于所 述內容，實施例中如無特殊說明，均為常規方法，使用試劑如無特殊說明，均為常規試劑或 按常規方法配制的試劑。
[0015] 實施例1:好氧反硝化菌株ΥΠ1DC16的分離 (1)所使用的培養基及成分如下： 富集培養基（g/L):KN〇3 2g、K2HP〇4 1g、KH2P〇4 1g、MgS〇4.7H20 0.2g、檸檬酸鈉 5g、微量鹽溶液2mL;蒸餾水1000mL，用INNaOH調節pH7.0-7.2; 其中微量鹽溶液（g/L):EDTA50g、ZnS〇4.7H2022g、CaCl2 5.54g、MnCl2.4H20 5.06g、FeS〇4*7H204.99g、（NH4)6M〇7〇24*4H20 1.10g、CuS〇4*5H201.57g、CoCl2· 6H2O1.61g〇
[0016] BTB培養基(g/L):即溴百里酚藍(BTB)選擇性培養基，瓊脂15g、KN〇3lg、KH2P〇4 1g、FeCl2 · 6H20 0.5g、CaCl2 · 7H20 0.2g、MgS〇4 · 7H20 1g、琥珀酸鈉 8.5g、BTB(l% 溶于酒精）1mL;蒸餾水1000mL，用INNaOH調節pH7.0-7.2。
[0017]LB培養基(g/L):蛋白胨10g、NaCl5g、酵母提取物5g、瓊脂15g。
[0018]反硝化培養基（g/L):KN〇30.6g、KH2P〇41g、K2HP〇41g、MgS〇4· 7H20 0.2g、檸 檬酸鈉5g;去離子水1000mL，用NaOH調節pH7.0。
[0019] (2)篩選方法 采集昆明滇池底泥樣品，稱取底泥2g放入含有100mL富集培養基的三角瓶中，30°C、 160rpm條件下培養24h。將富集液進行梯度稀釋，選用梯度為10'10'10'10'每一梯 度取0.2mL的稀釋液均勻涂布于BTB培養基表面，放入恒溫培養箱30°C培養1-2d，挑取使 周圍培養基變為藍色的單菌落，并在LB培養基上純化，即得到初篩菌株。
[0020]將初篩菌株接于反硝化培養基中，30°C、160rpm條件下培養48h進行定性復篩， 吸取培養液滴于干凈白瓷板上，加入Griess溶液I、溶液Π各1滴，如果溶液顯紅色則顯示培 養液中有亞硝態氮存在;無色，加入二苯胺-硫酸試劑，生成藍色沉淀，則說明有硝態氮存 在，無色則說明既無亞硝態氮也無硝態氮。
[0021] 上述Griess試劑(亞硝態氮定性檢測試劑），其配方為:溶液I:稱取磺胺酸0.5g溶 于溶液150mL醋酸溶液(30 %)中；溶液Π:稱取a-萘胺0.5g加入50mL蒸餾水中，沸水浴 后，緩緩加入30 %醋酸溶液150mL，保存于棕色瓶中。
[0022] 上述二苯胺-硫酸試劑(硝態氮定性檢測試劑），其配方為:稱取二苯胺1g溶于20 mL蒸餾水中，然后徐徐加入濃硫酸100mL，保存于棕色瓶中。
[0023]結合上述兩種方法篩選到一株好氧反硝化菌株ΥΠ1DC16。