專利名稱：一種分離基因重組蛋白的親和-膜過濾載體的制法與應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種蛋白質分離材料的制備方法和應用，具體涉及一種分離基因重組蛋白的親和-膜過濾載體的制法與應用。
背景技術：
基因重組蛋白的應用越來越廣泛，重組蛋白的分離在一定程度上限制了其在我國各個領域應用的深度和廣度。親和-膜過濾分離新技術根據目標蛋白的生物化學特性，將親和配基偶聯到水溶性大分子基質上，在溶液狀態下親和載體特異性吸附目標蛋白形成分子團簇，其微粒尺寸遠大于其它雜質成分，在膜分離過程中可以實現分子團簇與雜質的高效分離，因此，親和-膜過濾分離兼具生物親和的特異性和膜分離的快速、易放大。Mattiasson最初提出了親和-膜過濾法分離蛋白質的可行性，并成功地利用熱致死細菌^cc/2arawwy;c^cw^^^細胞膜上殘基作為親和配基，分離純化了刀豆蛋白。此后，有關親和-膜過濾分離蛋白質的研究包括用m-氨基苯甲脒偶聯高分子聚合物實現分子量接近的胰島素和糜蛋白酶的分離；用N-丙烯酰-m-氨基苯甲脒與丙烯酰胺的聚合物分離尿激酶；用生物素化脂質體純化抗生素蛋白avidin;用偶聯染料Cibacron Blue的瓊脂糖實現人血清白蛋白與溶菌酶的相互分離；用高取代染料sephmose回收牛血清白蛋白等。由于胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的分子量相近，單獨運用超濾的方法很難將二者完全分離開來，中國專利ZL200410027191.7應用所合成的可溶性親和載體，在超濾膜分離體系中通過吸附目標分子、清洗雜蛋白、洗脫目標分子獲得純化的胰蛋白酶。結果表明，用配基為PAB的親和載體純化胰蛋白酶，'獲得胰蛋白酶純化倍數達到93倍，回收80%以上。
雖然從提出親和-膜過濾分離技術至今已有20多年，但是，至今未見產業化應用。究其原因，其一，親和配基僅僅針對某一個或幾個特定的蛋白質，難以形成規模化的分離純化方法；其二，這些親和配基與目標蛋白間的作用力弱，需要多級膜分離才能達到理想的分離效率；其三，在專利"水溶性親和超濾載體的制備方法"(專利號ZL200410027191.7)中載體的環氧反應效率低，載體環氧取代度僅0.3mmol/g左右，降低了載體材料的分離效率
發明內容
本發明的目的在于克服現有技術中存在的不足之處，提供一種分離基因重組蛋白的親和-膜過濾載體的制法與應用。本發明選擇水溶性基質材料，偶聯與基因重組蛋白中組氨酸標記有強親和作用的親和配基和金屬離子，制備出親和-膜過濾分離載體材料，并應用于基因重組蛋白的膜分離純化，蛋白回收率高。
本發明目的通過以下技術方案來實現一種分離基因重組蛋白的親和-膜過濾載體的制法，包括以下步驟
(1) 水溶性載體基質的堿活化將水溶性載體基質溶解于堿溶液中，形成混合溶液，其中，水溶性載體基質的重量百分數的2 6%，反應后得到堿活化載體；
(2) 堿活化載體的環氧活化向堿活化載體中加入環氧氯丙垸，組成反應體系，將反
應體系在超聲場中反應2 5h，反應溫度為30。C 50。C，得環氧活化載體；
G)環氧活化載體與親和配基的偶聯將親和配體與環氧活化載體溶液以體積比1:1 3:1進行反應，反應溫度為30'C 5(TC，反應時間為2 5h，得偶聯亞氨基二乙酸的載體；(4)偶聯親和配基的載體與金屬離子的耦合將金屬離子溶液與偶聯亞氨基二乙酸的載體溶液以體積比1:1 3:1進行反應，反應溫度為2(TC 4(TC，反應時間為2 4h，得到本發明的親和-膜過濾載體。
步驟(1)所述的水溶性載體基質是葡聚糖，其分子量為1500000 3000000。步驟(1)所述的堿溶液包括NaOH或KOH的水溶液，濃度為0.1 0.3mol/L;所述的反應的溫度為20 30°C;反應時間為20 40min。
步驟(2)所述的環氧氯丙垸占反應體系的體積百分數為2 6%,超聲頻率為35 130kHz，超聲功率為200W 600W。
步驟(3)所述的親和配體包括亞氨基二乙酸、次氮基三乙酸或N， N， N-三羧甲基乙二胺。
步驟(3)所述的親和配體的濃度為0.1 0.5mol/L，環氧活化載體溶液中載體的重量百分數為2 4%。
步驟(4)所述的金屬離子溶液中金屬離子的濃度為0.1 0.5mol/L，步驟(4)所述的金屬離子包括Ci^+、 C(^+或N產，偶聯亞氨基二乙酸的載體在偶聯亞氨基二乙酸的載體溶液中的重量百分數為2 4%。
所述方法制備的親和-膜過濾載體在分離基因重組蛋白中的應用。本發明方法制備的親和-膜過濾載體分離基因重組蛋白的方法，包括如下步驟
將親和-膜過濾載體溶液與組氨酸標記的基因重組蛋白溶液以體積比為2:1 4:1相混合，其中，親和-膜過濾載體溶液中，親和-膜過濾載體占2 4wt%，基因重組蛋白溶液中基因重組蛋白的濃度為1 3mg/mL;混合溶液在溫度15 35°C、攪拌速度為100 200r/min下，反應0.5 1.5h，形成親和-膜分離載體與基因重組蛋白的結合體，應用截留分子量為10萬 30萬的超濾膜分離截留結合體，在截留的結合體上用與其等體積的0.2 0.5mol/L的咪唑緩沖溶液從載體上洗脫基因重組蛋白，洗滌2 4次，再用截留分子量為10萬 30萬的超濾膜將基因重組蛋白與親和-膜分離載體分離。
本發明相對于現有技術，具有如下的優點和有益效果
1、 本發明所制備的水溶性親和-膜過濾分離載體對基因重組蛋白的特異性吸附來自于親和-膜過濾載體材料的金屬離子和基因重組蛋白的組氨酸標記間的螯合作用。因而，本發明所制備的親和-膜過濾載體材料可以實現一類基因工程產物(而不是一個或幾個特定蛋白質)的下游分離純化。
2、 金屬離子和組氨酸標記間的螯合作用能力強，提高了親和-膜過濾載體材料對基因重組蛋白的特異性吸附，具有很高的選擇性，應用本發明方法所制備的水溶性親和-膜過濾分離載體，蛋白質的回收率達到90%以上。
3、 本發明采用超聲波強化堿活化載體的環氧活化反應，提高了水溶性載體的環氧取代度，載體環氧取代度最高可達1.5374mmol/g，提高了親和-膜過濾載體材料的吸附能力。
具體實施例方式
以下結合具體實施例對本發明作進一步說明，在實施例中所用的基因重組蛋白為N-末端帶有6個組氨酸標記的AxCesD， AxCesD是木醋桿菌UcWo6a"er xW咖w)中纖維素合成因子中的一個蛋白質亞基。但是，本發明所制備的水溶性親和-膜過濾分離載體同樣適用于分離其它帶組氨酸標記的基因重組蛋白，且本發明的實施方式不限于此。實施例1
以分子量為150萬的葡聚糖為水溶性載體基質，將0.2g水溶性載體基質溶解于濃度為0.3mol/L的NaOH溶液中，形成混合溶液，.水溶性載體基質用量為混合溶液重量的4%，在25'C反應30min，得堿活化載體。
向堿活化載體中加入0.3ml環氧氯丙垸，組成反應體系，環氧氯丙烷占反應體系的體積百分數為6%，在超聲頻率為130kHz、超聲功率為300W的超聲場中反應3h，反應溫度為30°C，獲得環氧取代度為1.5374mmol/g的環氧活化載體。將0.5mol/L的亞氨基二乙酸(IDA)溶液與0.2ml的環氧活化載體溶液以體積比1:1 在4(TC反應5h，其中環氧活化載體在環氧活化載體溶液中的重量百分數為4%，得偶聯IDA 的載體。
將0.5mol/L的CuS04溶液與2ml的偶聯IDA的載體溶液以體積比1:1在40'C反應2h， 其中偶聯IDA的載體在偶聯IDA的載體溶液中的重量百分數為4%,得到水溶性親和-膜 過濾載體。
將2ml的載體重量百分數為2%的親和-膜過濾載體溶液與AxCesD濃度為l.Omg/mL 的蛋白質溶液按體積比為2:1相混合，在15'C、攪拌速度150r/min下反應1.5h后，用截 留分子量為30萬的超濾膜截留親和-膜過濾載體與AxCesD的結合體，再用與截留液等體 積的2ml的、濃度為0.2mol/L的咪唑溶液從結合體上洗脫AxCesD 2次，經截留分子量為 30萬的超濾膜過濾后，在透過液中可回收91.20%的AxCesD，截留液中的親和-膜過濾載 體可以重復使用。 實施例2
以分子量為200萬的葡聚糖為水溶性載體基質，將0.2g水溶性載體基質溶解于5mL 濃度為0.2mol/L的NaOH溶液中，形成混合溶液，水溶性載體基質用量為混合溶液重量 的4%，在3(TC活化30min，得堿活化載體。
向堿活化載體中加入0.21111環氧氯丙垸，組成反應體系，環氧氯丙烷占反應體系的體 積百分數為4%，在超聲頻率為35kHz、超聲功率為200W的超聲場中反應5h，反應溫度 為40°C，獲得環氧取代度為1.4375mmol/g的環氧活化載體。
將0.3mol/L次氮基三乙酸(NTA)溶液與lml的環氧活化載體溶液以體積比2:1在 3(TC反應4h，其中環氧活化載體在環氧活化載體溶液中的重量百分數為3%，得偶聯NTA 的載體。
將0.3mol/L的NiS04溶液與2ml的偶聯NTA的載體溶液以體積比2:1在30。C反應4h， 其中偶聯NTA的載體在偶聯NTA的載體溶液中的重量百分數為3%，得到親和-膜過濾載 體。
將4ml載體重量百分數為3%的親和-膜過濾載體溶液與AxCesD濃度為3.0mg/mL的 的蛋白質溶液按體積比為4:1相混合，在35。C、攪拌速度200r/min下反應lh后，用截留 分子量為10萬的超濾膜截留親和-膜過濾載體與AxCesD的結合體，再用與截留液等體積 的5ml、濃度為0.4mol/L的咪唑溶液從結合體上洗脫AxCesD 3次，經截留分子量為10 萬的超濾膜過濾后，在透過液中可回收94.45%的AxCesD，截留液中的親和-膜過濾載體可以重復使用。 實施例3
以分子量為300萬的葡聚糖為水溶性載體基質，將O.lg水溶性載體基質溶解于濃度為 0.1mol/L的NaOH溶液中，形成混合溶液，水溶性載體基質用量為混合溶液重量的2%， 在20 °C活化20min，得堿活化載體。
向堿活化載體中加入0.1ml環氧氯丙烷，組成反應體系，環氧氯丙烷占反應體系的體 積百分數為2%，在超聲頻率為100kHz、超聲功率為600W的超聲場中反應2h，反應溫度 為50°C，獲得環氧取代度為0.9375mmol/g的環氧活化載體。
將0.1mol/LN， N， N-三羧甲基乙二胺(TED)溶液與lml的環氧活化載體溶液以體 積比3:1在50'C反應2h，其中環氧活化載體在環氧活化載體溶液中的重量百分數為為2%， 得偶聯TED的載體。
將0.1mol/L的CoS04溶液與lml的偶聯TED的載體溶液以體積比3:1在20。C反應3h， 其中偶聯TED的載體在偶聯TED的載體溶液中的重量百分數為2%，得到親和-膜過濾載 體。
將3ml的載體重量百分數為4%的親和-膜過濾載體溶液與AxCesD濃度為2.0mg/mL 的蛋白質溶液按體積比為3:1相混合，在25"C、攪拌速度100r/min下反應0.5h后，用截 留分子量為20萬的超濾膜截留親和-膜過濾載體與AxCesD的結合體，再用與截留液等體 積4ml的、濃度為0.5mol/L的咪唑溶液從結合體上洗脫AxCesD 4次，經截留分子量為20 萬的超濾膜過濾后，在透過液中可回收92.15%的AxCesD，截留液中的親和-膜過濾載體 可以重復使用。
權利要求
1、一種分離基因重組蛋白的親和-膜過濾載體的制法，其特征在于，包括以下步驟(1)水溶性載體基質的堿活化將水溶性載體基質溶解于堿溶液中，形成混合溶液，其中，水溶性載體基質的重量百分數的2～6％，反應后得到堿活化載體；(2)堿活化載體的環氧活化向堿活化載體中加入環氧氯丙烷，組成反應體系，將反應體系在超聲場中反應2～5h，反應溫度為30℃～50℃，得環氧活化載體；(3)環氧活化載體與親和配基的偶聯將親和配體與環氧活化載體溶液以體積比1∶1～3∶1進行反應，反應溫度為30℃～50℃，反應時間為2～5h，得偶聯亞氨基二乙酸的載體；(4)偶聯親和配基的載體與金屬離子的耦合將金屬離子溶液與偶聯亞氨基二乙酸的載體溶液以體積比1∶1～3∶1進行反應，反應溫度為20℃～40℃，反應時間為2～4h，得到本發明的親和-膜過濾載體。
2、 根據權利要求l的一種分離基因重組蛋白的親和-膜過濾載體的制法，其特征在于，步驟(1)所述的水溶性載體基質是葡聚糖，其分子量為1500000 3000000。
3、 根據權利要求l的一種分離基因重組蛋白的親和-膜過濾載體的制法，其特征在于，步驟(1)所述的堿溶液包括NaOH或KOH的水溶液，濃度為0.1 0.3mol/L;所述的反應的溫度為20 30°C;反應時間為20 40min。
4、 根據權利要求l的一種分離基因重組蛋白的親和-膜過濾載體的制法，其特征在于，步驟(2)所述的環氧氯丙垸占反應體系的體積百分數為2 6%，超聲頻率為35 130kHz，超聲功率為200W 600W。
5、 根據權利要求l的一種分離基因重組蛋白的親和-膜過濾載體的制法，其特征在于，步驟G)所述的親和配體包括亞氨基二乙酸、次氮基三乙酸或N, N, N-三羧甲基乙二胺。
6、 .根據權利要求1的一種分離基因重組蛋白的親和-膜過濾載體的制法，其特征在于，步驟(3)所述的親和配體的濃度為0.1 0.5mol/L，環氧活化載體溶液中載體的重量百分數為2 4%。
7、 根據權利要求l的一種分離基因重組蛋白的親和-膜過濾載體的制法，其特征在于，步驟(4)所述的金屬離子溶液中金屬離子的濃度為0.1 0.5mol/L，步驟(4)所述的金屬離子包括012+、 Cc^+或N嚴，偶聯亞氨基二乙酸的載體在偶聯亞氨基二乙酸的載體溶液中的重量百分數為2 4%。
8、 一種權利要求1所述方法制備的親和-膜過濾載體在分離基因重組蛋白中的應用。
全文摘要
本發明涉及涉及一種分離基因重組蛋白的親和-膜過濾載體的制法與應用。在超聲場中對堿活化的水溶性載體基質進行環氧活化后，與親和配基偶聯，再與金屬離子螯合，獲得水溶性親和-膜過濾載體。采用本發明制備水溶性親和-膜過濾載體時載體的環氧活化取代度最高可達1.5374mmol/g，金屬離子和組氨酸標記間的螯合作用能力強，提高了親和-膜過濾載體材料對基因重組蛋白的特異性吸附，具有很高的選擇性，采用本發明方法分離帶組氨酸標記的基因重組蛋白的回收率達90％以上。
文檔編號C07K1/34GK101633687SQ20091004223
公開日2010年1月27日 申請日期2009年8月28日 優先權日2009年8月28日
發明者琳 李, 胡松青, 瑋 趙 申請人:華南理工大學