枯草工程菌Bacillus subtilis及其構建以及利用其生產脫毛酶制劑的方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于微生物發酵，特別是指一種枯草工程菌Bacillussubtilis及其構建 以及利用其生產脫毛酶制劑的方法。
【背景技術】
[0002] 皮革作為畜牧業的副產品，越來越多的引起人們重視。隨著科學技術的進步，皮革 制品檔次日新月異，成品革面料向著薄、軟、有力度方向發展。市場需要促進制革業發展，同 時也要求制革業發展建立在節能減排、低碳環保的基礎上，目前制革多采用灰堿法脫毛，灰 堿法以硫化鈉為主，將毛溶解，廢水自然排出。一個轉鼓每月要排除5噸鹽堿廢水，堿濃度高 達25%以上，僅河北省蠡縣一個制革區每月要排污水2000噸，全國要排1300萬噸廢水，一年 排放約1.5億噸廢水，且未采取污水處理手段。經有關管理部門對制革區深井水測定，100米 以上均被污染，污染物超過飲用水標準，對環境造成的污染嚴重危害了人體健康。中性蛋白 酶能夠消解生皮毛囊周圍與表皮、真皮連結的蛋白，削弱毛與表皮、真皮的緊密依附，達到 脫毛的目的。中性蛋白酶脫毛制劑項目的研發被業內專家普遍認為是節能、減排、治污制革 理想的新技術，而且微生物酶制劑易得，資源豐富，制備過程沒有污染，用于制革業完全符 合國家節能減排的發展戰略。推廣使用后可節約水資源并減少污水排放量50%以上，有效 的緩解制革業對環境的污染。
[0003] 中性蛋白酶脫毛制劑具有廣闊的前景，但由于野生菌株AS1.398發酵產蛋白酶系 中膠原蛋白酶的存在，能水解生皮中膠原蛋白，不可避免損傷真皮的結構，影響皮制品的性 能；而分離蛋白酶系中膠原蛋白酶工藝復雜，增加了酶制劑成本;且分離純化工藝精細，不 宜工廠化操作進而限制了酶制劑的推廣應用。

【發明內容】

[0004] 本發明的目的在于提供一種不含膠原蛋白酶基因但可以表達中性蛋白酶的枯草 工程菌BacillussubtilisCGMCCNo. 11625。
[0005]本發明的目的之二是提供一種上述工程菌的構建方法。
[0006] 本發明的目的之三是提供一種利用枯草工程菌BacillussubtilisCGMCC No. 11625生產脫毛酶制劑的方法。
[0007]本發明的整體技術構思是：
[0008] -種枯草工程菌BacillussubtilisCGMCCNo. 11625。
[0009] 本發明中的菌種申請人已于2015年11月6日提交位于北京市朝陽區北辰西路1號 院3號的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，該保藏單位的簡稱為 CGMCC，保藏編號為:CGMCCNo. 11625。
[0010] 枯草工程菌的構建方法，該方法包括如下工藝步驟：
[0011]A、中性蛋白酶基因npr的擴增
[0012]根據NCBI中供體菌--解淀粉芽抱桿菌BacillusamyloliquefaciensCGMCC No. 1 . 3 9 8的中性蛋白酶基因npr序列設計引物如下，上游引物為：5'-CCGATTACAAAAACATCAGCCGTAGGATCCCATCAGCTTAAAGAGAATCAAAC-3'，其中下劃線部分為BamH I酶切位點，5 3bp;下游引物為：5 ' - CCCGCTCATTAGGCGGGCTGCCCCGGGTTACAATCCAACAGCATTCCAGGCTG-3'，其中下劃線部分為Sma頂每切位點，53bp;進行PCR擴增，PCR擴增產物利用1%瓊脂糖凝膠電泳進行分析；
[0013]B、重組載體的構建
[0014]將PCR擴增產物回收后，與用BamHI和SmaI雙酶切的載體pHT43經Gibson連接后 轉化至大腸埃希氏菌EscherichiacoliBL21Rosetta感受態中，通過10-100μg/mlAmp抗 性篩選重組質粒，將測序正確的重組質粒命名為pHT43-npr;
[0015]C、將上述構建好的重組表達質粒pHT43-npr通過Spizizen鹽法轉化到受體菌-- 枯草芽孢桿菌BacillussubtilisTO800N中，在10-100μg/ml氯霉素抗性的LB平板上篩選 轉化子，挑取陽性轉化子接種在脫脂牛奶平板上，菌落周圍產生水解圈的為目標轉化子，得 到枯草工程菌BacillussubtilisCGMCCNo. 11625;
[0016]其中npr基因供體菌選用解淀粉芽抱桿菌BacillusamyloliquefaciensCGMCC No. 1.398,購自中國科學院微生物研究所;大腸埃希氏菌EscherichiacoliBL21Rosetta 購自普如汀生物技術（北京）有限公司；受體菌為枯草芽孢桿菌表達宿主Bacillus subti1isWB800N及質粒pHT43，購自MoBiTec公司。
[0017]利用枯草工程菌BacillussubtilisCGMCCNo. 11625制備脫毛酶制劑的方法，是 將所述的菌種接種于含有碳源、氮源、必要的營養元素及抗生素的無菌發酵培養基中經通 氣發酵制成發酵液，發酵液經后處理制成脫毛酶制劑。
[0018] 本發明的具體技術構思還有：
[0019] 所述的發酵培養基采用如下單位質量百分含量的原料組成:麥麩2%-6%;玉米粉 2%-5%;蛋白胨l%-2%;NaH2P〇4 0·2%-〇·4%;Κ2ΗΡ〇4 0·02%-0·04%;豆油0.01%_ 0 · 05% ;余量為水;發酵培養基消前ρΗ=5 · 5-6 · 6，消后ρΗ=6-7。
[0020] 通氣發酵條件如下：按照質量百分比為1 %的接種量接種，壓力0.03-0.05MPa，攪 拌轉速為150-250轉/分鐘，在發酵液中0D6Q() = 0.5時添加終濃度為0.5-2.5mmol的IPTG作為 誘導劑，當發酵液中酶活下降為發酵終點；
[0021] 通風量的條件如下：
[0022] 0-12小時內：通風量l:0.5-0.7vvm;
[0023]12-24小時：通風量1:0·8-1·Ovvm;
[0024] 24-40小時：通風量1:0 · 9-1 · 2vvm;
[0025] 40小時至發酵結束:通風量1:0 · 8-1 ·Ovvm;
[0026]溫度條件如下：
[0027] 0-8小時:溫度為32°C-35°C;
[0028] 8-14小時：溫度為35°C-37°C;
[0029] 14小時至發酵結束:溫度為37°C。
[0030] 為降低生產成本，優選且較為常見的技術方案是，所述的通氣發酵前包括擴大培 養。
[0031] 所述的擴大培養包括如下步驟：
[0032] A、將菌種制成搖瓶種子；
[0033]B、將搖瓶種子制成一級種子；
[0034] 所述的菌種培養基由如下質量百分含量的原料組成：
[0035] 蛋白胨 牛肉膏l%-5%;Nacll%-5%;余量為水;ρΗ=6·8-7·5;
[0036] 菌種的培養條件為:溫度30°C_37°C，培養12-24h。
[0037] 所述的步驟A是將0D6Q() = 5的LB培養基菌液與質量百分比為20%-50%的甘油混合 后制成液體菌種，將液體菌種接種至無菌的搖瓶種子培養基培養后制成搖瓶種子；
[0038] 所述的搖瓶種子培養基由如下質量百分含量的原料組成：
[0039] 蛋白胨1 % -5 % ;牛肉膏1 % -5 % ;Nac11 % -5 % ;余量為水;抗生素選用濃度為10- 100μg/ml的氯霉素;pH=6 · 8-7 · 5;
[0040] 培養條件如下:搖瓶裝量體積比為10%-25%，溫度33°C_37°C，轉速為180-220轉/ 分鐘，培養周期12小時-18小時。
[0041 ]所述的步驟B是將搖瓶種子接種至無菌種子培養基經通氣發酵制成種子液；
[0042]所述的種子培養基由如下質量百分含量的原料組成：
[0043] 蛋白胨1 % -5 % ;牛肉膏1 % -5 % ;Nac11 % -5 % ;余量為水;抗生素選用濃度為10- 100μg/ml的氯霉素;pH=6 · 8-7 · 5;
[0044] 培養條件如下:接種量的質量百分比為1%，種子罐裝量體積比為40%_60%，溫度 32°C_37°C，轉速為150-250轉/分鐘，壓力為0.03-0.05MPa，培養周期12小時-18小時。
[0045] 采用本發明的方法所制備的發酵液酶活達2000u/ml，因發酵液酶系中不含對生皮 損傷的膠原蛋白酶，無需進行分離純化工藝。后處理包括過濾層析、噴霧干燥，即為脫毛酶 制劑粉末成品。
[0046] 本發明所取得的實質性特點和顯著的技術進步在于：
[0047] 本發明通過基因工程技術構建皮革脫毛用枯草工程菌，工程菌株重組表達中性蛋 白酶，可以水解生皮毛孔中粘蛋白，削弱毛與表皮、真皮的緊密依附，達到脫毛的目的;該菌 株經驗證不表達膠原蛋白酶，這種特性可以有效解決現有技術中因生皮中膠原蛋白的水解 而造成的爛皮、粒面破損的技術難題，且發酵液中酶活可達2000u/ml以上，因此重組工程菌 株可以作為脫毛專用菌株應用于市場。
[0048]本發明中的菌種申請人已于2015年11月6日提交位于北京市朝陽區北辰西路1號 院3號的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，該保藏單位的簡稱為 CGMCC〇
【附圖說明】
[0049] 圖1是本發明中所選用的上游引物及下游引物的序列表。
[0050] 圖2是在牛奶平皿驗證中性蛋白酶的表達的示意圖。
[0051 ] 由圖2可見，受體菌--枯草芽孢桿菌BacillussubtilisWB800N無水解圈，說明 枯草芽孢桿菌BacillussubtilisWB800N菌株不含中性蛋白酶基因。而供體菌--解淀粉 芽抱桿菌